Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Meting van 3-dimensionale cAMP-distributies in levende cellen met behulp van 4-dimensionale (x, y, z en λ) hyperspectrale FRET-beeldvorming en -analyse

2.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/61720

⸱

27 oktober 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, University of South Alabama, 2Center for Lung Biology, University of South Alabama, 3Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of South Alabama

In dit artikel

Samenvatting

Vanwege de inherente lage signaal-ruisverhouding (SNR) van Fӧrster resonantie energieoverdracht (FRET) gebaseerde sensoren, is het meten van cAMP-signalen een uitdaging geweest, vooral in drie ruimtelijke dimensies. Hier beschrijven we een hyperspectrale FRET-beeldvormings- en analysemethodologie die het mogelijk maakt om de cAMP-verdeling in drie ruimtelijke dimensies te meten.

Samenvatting

Cyclisch AMP is een tweede boodschapper die betrokken is bij een breed scala aan cellulaire en fysiologische activiteiten. Verschillende studies suggereren dat cAMP-signalen gecompartimenteerd zijn en dat compartimentering bijdraagt aan signaleringsspecificiteit binnen de cAMP-signaleringsroute. De ontwikkeling van op Fӧrster resonantie energieoverdracht (FRET) gebaseerde biosensoren heeft het vermogen bevorderd om cAMP-signalen in cellen te meten en te visualiseren. Deze metingen zijn echter vaak beperkt tot twee ruimtelijke dimensies, wat kan resulteren in een verkeerde interpretatie van gegevens. Tot op heden zijn er slechts zeer beperkte metingen van cAMP-signalen in drie ruimtelijke dimensies (x, y en z) geweest, vanwege de technische beperkingen bij het gebruik van FRET-sensoren die inherent een lage signaal-ruisverhouding (SNR) vertonen. Bovendien zijn traditionele filtergebaseerde beeldvormingsbenaderingen vaak niet effectief voor nauwkeurige meting van cAMP-signalen in gelokaliseerde subcellulaire gebieden vanwege een reeks factoren, waaronder spectrale overspraak, beperkte signaalsterkte en autofluorescentie. Om deze beperkingen te overwinnen en fret-gebaseerde biosensoren te kunnen gebruiken met meerdere fluoroforen, hebben we hyperspectrale FRET-beeldvormings- en analysebenaderingen ontwikkeld die spectrale specificiteit bieden voor het berekenen van FRET-efficiëntie en de mogelijkheid om FRET-signalen spectraal te scheiden van verstorende autofluorescentie en / of signalen van extra fluorescerende labels. Hier presenteren we de methodologie voor het implementeren van hyperspectrale FRET-beeldvorming, evenals de noodzaak om een geschikte spectrale bibliotheek te construeren die niet ondersampled of oversampled is om spectrale ontmenging uit te voeren. Terwijl we deze methodologie presenteren voor het meten van driedimensionale cAMP-verdelingen in pulmonale microvasculaire endotheelcellen (PMVECs), kan deze methodologie worden gebruikt om ruimtelijke verdelingen van cAMP in een reeks celtypen te bestuderen.

Inleiding

Cyclisch adenosinemonofosfaat (cAMP) is een tweede boodschapper die betrokken is bij belangrijke cellulaire en fysiologische processen, waaronder celdeling, calciuminstroom, gentranscriptie en signaaltransductie. Een groeiend aantal bewijzen suggereert het bestaan van cAMP-compartimenten in de cel waardoor signaleringsspecificiteit wordt bereikt1,2,3,4,5,6,7. Tot voor kort werd cAMP-compartimentering afgeleid op basis van verschillende fysiologische of cellulaire effecten geïnduceerd door verschillende G-gekoppelde receptoragonisten8,9,10,11. Meer recent hebben fret-gebaseerde fluorescentiebeeldvormingssondes nieuwe benaderingen geboden voor de directe meting en observatie van cAMP-signalen in een cel12,13,14.

Förster resonantie energieoverdracht (FRET) is een fysisch fenomeen waarbij energieoverdracht plaatsvindt tussen donor- en acceptormoleculen op een niet-stralingsve manier wanneer de moleculen zich in de nabijheid bevinden15,16. Met de ontwikkeling van FRET-gebaseerde fluorescerende indicatoren is dit fysische fenomeen gebruikt in biologische toepassingen om eiwit-eiwitinteracties17,eiwitcolokalisatie18,Ca+2-signalering 19,genexpressie20,celdeling21 en cyclische nucleotidesignalering te bestuderen. FRET-gebaseerde cAMP-indicatoren bestaan doorgaans uit een cAMP-bindingsdomein, een donorfluoofoor en een acceptorfluoofoor22. De H188 cAMP-sensor12,22 die in deze methodologie wordt gebruikt, bestaat bijvoorbeeld uit een cAMP-bindingsdomein verkregen van Epac, ingeklemd tussen Turquoise (donor) en Venus (acceptor) fluoroforen. Bij basale omstandigheden (ongebonden) bevinden Turkoois en Venus zich in een zodanige oriëntatie dat FRET optreedt tussen de fluoroforen. Bij binding van cAMP aan het bindingsdomein treedt een conformatieverandering op die zodanig dat Turquoise en Venus uit elkaar bewegen, wat resulteert in een afname van FRET.

FRET-gebaseerde beeldvormingsbenaderingen bieden een veelbelovend hulpmiddel voor het onderzoeken en visualiseren van cAMP-signalen in een cel. De huidige op FRET gebaseerde microscopische beeldvormingstechnieken zijn echter vaak slechts gedeeltelijk succesvol in het bereiken van voldoende signaalsterkte om FRET met subcellulaire ruimtelijke helderheid te meten. Dit komt door verschillende factoren, waaronder de beperkte signaalsterkte van veel FRET-verslaggevers, de hoge mate van precisie die nodig is om veranderingen in FRET-efficiëntie nauwkeurig te kwantificeren en de aanwezigheid van verstorende factoren, zoals cellulaire autofluorescentie23,24. Het resultaat is vaak een FRET-beeld dat wordt geplaagd door zwakke SNR, waardoor visualisatie van subcellulaire veranderingen in FRET erg moeilijk is. Bovendien is onderzoek naar ruimtelijk gelokaliseerde cAMP-signalen bijna uitsluitend uitgevoerd in slechts twee ruimtelijke dimensies en is de axiale cAMP-verdeling zelden beschouwd25. Dit komt waarschijnlijk omdat een lage SNR de mogelijkheid belemmerde om cAMP-gradiënten in drie ruimtelijke dimensies te meten en te visualiseren. Om beperkingen van het gebruik van FRET-sensoren met een lage SNR te overwinnen, hebben we hyperspectrale beeldvormings- en analysebenaderingen geïmplementeerd om FRET in afzonderlijke cellen te meten25,26,27.

Hyperspectrale beeldvormingsbenaderingen werden ontwikkeld door NASA om terrestrische objecten te onderscheiden die aanwezig zijn in satellietbeelden28,29. Deze technieken zijn sindsdien vertaald naar het fluorescentiemicroscopieveld30, met verschillende commerciële confocale microscoopsystemen die spectrale detectoren aanbieden. In traditionele (niet-spectrale) fluorescentiebeeldvorming wordt het monster geëxciteerd met behulp van een banddoorlaatfilter of een laserlijn en wordt de emissie verzameld met behulp van een tweede banddoorlaatfilter, vaak geselecteerd om overeen te komen met de piekemissiegolflengte van de fluorofoor (en). Hyperspectrale beeldvormingsbenaderingen daarentegen proberen een volledig spectraal profiel te bemonsteren van ofwel de fluorescentie-emissie26,31,32 of excitatie33,34 op specifieke golflengte-intervallen. In onze eerdere studies toonden we aan dat hyperspectrale beeldvormings- en analysebenaderingen een verbeterde kwantificering van FRET-signalen in cellen kunnen bieden in vergelijking met traditionele filtergebaseerde FRET-beeldvormingstechnieken26. Hier presenteren we een methodologie voor het uitvoeren van 4-dimensionale (x, y, z en λ) hyperspectrale FRET-beeldvorming en -analyse om cAMP-verdelingen in drie ruimtelijke dimensies te meten en te visualiseren. Deze benaderingen hebben visualisatie van agonist-geïnduceerde cAMP ruimtelijke gradiënten in afzonderlijke cellen mogelijkgemaakt 25. Interessant is dat, afhankelijk van de agonist, cAMP-gradiënten zichtbaar kunnen zijn in cellen. De hier gepresenteerde methodologie maakt gebruik van spectrale ontmenging van niet-uniforme achtergrond en cellulaire autofluorescentie om de nauwkeurigheid van de FRET-metingen te verbeteren. Hoewel deze methodologie wordt gedemonstreerd in pulmonale microvasculaire endotheelcellen (PMVECs) met behulp van een cAMP FRET-biosensor, kan de methodologie gemakkelijk worden aangepast voor gebruik met alternatieve FRET-reporters of alternatieve cellijnen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Dit protocol volgt procedures die zijn goedgekeurd door de University of South Alabama Institutional Animal Care and Use Committee.

1. Voorbereiding van cellen, monsters en reagens voor beeldvorming

  1. Isoleer pulmonale microvasculaire endotheelcellen van ratten (PMVEC's) zoals eerder beschreven35.
    OPMERKING: Cellen werden geïsoleerd en gekweekt door de Cell Culture Core aan de Universiteit van South Alabama, Mobile, AL op 100 mm celkweekschalen.
  2. Zaad geïsoleerde PMVEC's op 25 mm ronde glazen dekplaatjes en laat ze in de incubator groeien bij 37 °C totdat de cellen ten minste 80% confluentie bereiken (ten minste 24 uur).
    OPMERKING: Cellen en celtype kunnen variëren van studie tot studie en daarom moeten celspecifieke celkweekprocedures worden gevolgd om cellen te zaaien en te laten groeien. Het celzaai- en kweekprotocol dat in deze studies wordt gebruikt, is beschikbaar als aanvullende informatie in het bestand met de naam "Supplemental File_Cell Culture and Transfection".
  3. Transfecteer PMVECs met een FRET biosensor en incubeer gedurende 48 uur bij 37 °C.
    OPMERKING: Het protocol voor het transfecteren van PMVECs wordt ook beschreven in het aanvullende informatiebestand met de naam "Supplemental File_Cell Culture and Transfection".
  4. Op de dag van de beeldvorming, warm Tyrode's buffer op tot 37 °C in een waterbad.
    OPMERKING: Tyrode's buffer bestaat uit 145 mM NaCl, 4 mM KCl, 10 mM HEPES, 10 mM Glucose, 1 mM MgCl2 en 1 mM CaCl2
  5. Monteer een afdekblad met getransfecteerde cellen in een celkamer en bevestig de bovenkant met een montagepakking om lekken te voorkomen.
  6. Veeg de onderkant van de deklip schoon met een delicaat taakdoekje om overtollige media of hechtende cellen schoon te maken.
  7. Voeg 800 μL werkbuffer en 4 μL 5 mM nucleair label toe aan de celkamer en laat zachtjes schommelen gedurende 5 - 10 seconden.
    OPMERKING: Wanneer u buffer- of reagensoplossingen toevoegt aan coverslips die in de celkamer zijn gemonteerd, moet u ervoor zorgen dat u de oplossing voorzichtig en aan de zijkant van de celkamer toevoegt om aanhangbare cellen niet los te maken. Het toevoegen van 4 μL van 5 mM nucleair label aan 800 μL buffer maakt 25 μM eindconcentratie van nucleair label. Voor losjes hechtende cellen zoals HEK293-cellen, meng nucleair label en buffer eerst in een injectieflacon en voeg vervolgens toe aan coverslips die in de celkamer zijn gemonteerd. Dit voorkomt dat de cellen van de coverslip worden getild.
  8. Bedek de celkamer met aluminiumfolie ter bescherming tegen licht en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
  9. Reagensvoorbereiding: Voeg 1 μL van 50 mM forskolin toe aan 199 μL buffer. Dit zal een uiteindelijke concentratie van forskoline van 50 μM opleveren wanneer het wordt toegevoegd aan cellen die zijn bereid met 800 μL buffer. 1 μL DMSO in 199 μL buffer moet ook worden voorbereid om te worden gebruikt als controlemiddel.
    OPMERKING: In deze studies wordt forskolin gebruikt als een adenylcyclase activator om de cAMP-productie te stimuleren. Indien gewenst kan deze methodologie eenvoudig worden aangepast om behandeling met alternatieve reagentia mogelijk te maken voor het stimuleren of remmen van adenylcyclase, fosfodiësterasen, enz.

2. Beeldverwerving

  1. Gebruik een confocale microscoop uitgerust met een spectrale detector.
    OPMERKING: Alle hier beschreven stappen voor beeldacquisitie zijn ontwikkeld met behulp van een in de handel verkrijgbaar Nikon A1R-microscoopsysteem. Deze stappen moeten mogelijk worden aangepast als een alternatieve spectrale microscoop wordt gebruikt. Zorg ervoor dat alle apparatuur ten minste 30 minuten voor het begin van het experiment is ingeschakeld om stabiele bedrijfsomstandigheden te bereiken.
  2. Selecteer de doelstelling 60x onderdompeling in water en voeg een druppel water toe aan het doel.
    OPMERKING: Voor live-cell imaging met hoge resolutie wordt aanbevolen om een hoog numeriek diafragma objectief te gebruiken. Raadpleeg de lijst met materialen voor informatie over het doel dat in deze onderzoeken wordt gebruikt.
  3. Plaats de geladen celkamer (vanaf stap 1.7) op het microscoopstadium.
  4. Selecteer de DFT (DAPI/FITC/TRITC) filterset door de filterknop aan de rechterkant van de microscoop af te stemmen.
  5. Bedien de microscoop in fluorescentie widefield-modus met behulp van de oculairs om een gezichtsveld te selecteren dat cellen bevat die de cAMP FRET-sensor tot expressie brengen.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de gemiddelde intensiteit van het FRET-signaal op de donor- of acceptoremissiepiekgolflengte in de geselecteerde cel ten minste 100 intensiteitseenheden (A.U.) of ten minste 4x het basissignaal van een gebied zonder tot expressie brengende cellen is. Dit kan worden bevestigd met behulp van de spectrumprofielviewer die beschikbaar is in NIS Elements-software. Bij het zoeken naar een cel met een goed signaal, is het raadzaam om te heldere cellen weg te gooien (ze kunnen worden aangetast).
  6. Open NIS-software, schakel over naar de confocale modus, ontgrendel de laservergrendelingsknop en klik op Live.
  7. Gebruik de focusknop om scherp te stellen op de cellen door naar het voorbeeld op het scherm te kijken.
  8. Configureer apparaat-, acquisitie- en z-stack-instellingen in de software, zoals hieronder wordt beschreven.
  9. Acquisitie-instellingen:
    OPMERKING: Instellingen voor camera- en apparaatacquisitie kunnen worden toegepast met behulp van een eerder verkregen afbeelding. Open de afbeelding, klik met de rechtermuisknop en selecteer Camera-instellingen opnieuw gebruiken.
    1. Open het instellingenmenu van de A1, vink de vakjes aan die overeenkomen met laserlijnen van 405 nm en 561 nm, selecteer SD voor spectrale detector, selecteer 10 voor resolutie en 31 voor kanalen.
      OPMERKING: Het instellingenmenu van A1 wordt weergegeven als een klein tandwielpictogram in de linkerbovenhoek van het venster A1 Plus-instellingen. 405 nm laser wordt gebruikt voor donor excitatie en 561 nm laser wordt gebruikt voor nucleaire label excitatie.
    2. Stel het golflengtebereik (410 – 730 nm) in door begin- en eindgolflengtewaarden te selecteren.
    3. Klik op het binning/skip-pictogram in het A1-instellingenmenu, selecteer het vakje met nummer 15 en klik vervolgens op OK in het A1-instellingenmenu.
      OPMERKING: Dit is om het golflengtekanaal te verwijderen dat overeenkomt met de 561 nm excitatielaser (dit is meestal het15e golflengtekanaal). Het is belangrijk om deze golflengteband niet te gebruiken om een kunstmatig laag signaal te vermijden, wat een spectraal artefact kan creëren. Het signaal is lager in deze band vanwege de mechanische vinger die het detectorelement bedekt om het te beschermen tegen laserschade.
    4. Stel de laserintensiteiten in op respectievelijk 8% en 2% voor de 405 nm en 561 nm lasers, Si Hv (detector gain) op 149 en een pinhole radius van 2,4 airy disk units (AU).
      OPMERKING: Laserintensiteiten moeten mogelijk worden aangepast, afhankelijk van de leeftijd van het instrument en de toestand van de lasers. Bij het aanpassen van laserintensiteiten tussen verschillende monsters of experimentele groepen, is het belangrijk om dezelfde verhouding van laserintensiteiten te behouden (bijv. 8: 2). Bovendien is het belangrijk om een laserintensiteit te selecteren die niet zo helder is dat er snel fotobleeken ontstaat. De detectorversterkte moet worden aangepast om de signaalintensiteit te maximaliseren en tegelijkertijd de detectorruis te minimaliseren. Voor deze studies werd een winst van 149 gebruikt. Een pinhole-grootte van 2,4 AE werd gekozen als balans tussen het verkrijgen van beelden met voldoende signaal-ruisverhouding (SNR) en het handhaven van optische sectioning (confocaliteit). Een toename van de pinhole-grootte verhoogt de SNR, maar vermindert de confocaliteit.
    5. Stel de scansnelheid in op 0,25 spectrale frames per seconde, selecteer het pictogram dat overeenkomt met unidirectioneel voor scanrichting, voer 4 in voor het aantal en stel 1024 x 1024 in voor scangrootte.
      OPMERKING: FRET-signalen zijn zwak en een lage scansnelheid is vaak vereist. Met behulp van een scansnelheid van 0,25 wordt de acquisitie van een spectrale z-stack in ~ 3 minuten voltooid. De scansnelheid kan worden verhoogd of verlaagd, afhankelijk van de gebruikte fluoroforen. Voor helderdere fluoroforen zoals eGFP kan bijvoorbeeld een hogere scansnelheid (2 frames/seconde) worden gebruikt. Het getal dat onder telling wordt ingevoerd, komt overeen met een framegemiddelde waarde van 4, wat helpt bij ruisonderdrukking tijdens beeldacquisitie. Voor zeer stabiele monsters en waar tijd geen beperking is, kunnen hogere gemiddelde waarden (tot 16) worden gebruikt om beelden met verbeterde SNR te verkrijgen.
  10. Definieer z-stack acquisitieparameters:
    OPMERKING: De waarden die in stap 2.10 zijn ingevoerd, moeten mogelijk worden aangepast om rekening te houden met veranderingen in fluorescerende labelbinding of -concentratie, type etiket, aantal gebruikte labels, cellijn en andere veranderingen in de monstervoorbereiding die van invloed kunnen zijn op de celetiketteringsdichtheid en/of cellulaire autofluorescentie. Bij het aanpassen van acquisitieparameters moet ervoor worden gezorgd dat een voldoende SNR wordt bereikt terwijl fotobleaching wordt geminimaliseerd. Bovendien moet er bij het configureren van een spectrale FRET-test voor worden gezorgd dat de parameters goed werken in alle behandelingsgroepen. Het is raadzaam om een proef uit te voeren van elke behandelingsgroep met de voorgestelde parameterinstellingen om ervoor te zorgen dat SNR voldoende is en fotobleaching wordt geminimaliseerd.
    1. Open het ND-acquisitievenster door te klikken op → acquisitiecontrole → ND-acquisitiebekijken.
    2. Voer het pad/de bestemming en een bestandsnaam in om het ND-bestand op te slaan in het pop-upvenster.
    3. Vink het vakje aan dat overeenkomt met de z-serie.
    4. Klik op live in het venster A1 Plus-instellingen. Dit opent een live kijkvenster.
    5. Pas de scherpstelknop op de microscoop aan om de bovenkant van de cel te selecteren en klik op Boven in het ND-acquisitievenster om de huidige positie als boven in te stellen.
      OPMERKING: Er wordt voorgesteld om iets boven de bovenkant van de cel scherp te stellen om ervoor te zorgen dat alle cellen in de z-reeks worden bemonsterd.
    6. Pas de focusknop op de microscoop aan om de onderkant van de cel te selecteren en klik op Onder in het ND-acquisitievenster om de huidige positie als de onderkant in te stellen.
      OPMERKING: Stel iets onder de onderkant van de cel scherp om ervoor te zorgen dat alle cellen worden bemonsterd.
    7. Voer 1 μm in voor stapgrootte, selecteer boven-onder voor de z-scanrichting en klik op uitvoeren op het ND Acquisition-venster om een z-stack te verkrijgen.
      OPMERKING: Stapgrootte bepaalt het aantal z-slices dat wordt verkregen, afhankelijk van de bovenste en onderste locaties (d.w.z. de afgelegde afstand). Een stapgrootte van 1 μm werd gekozen als compromis tussen beeldvormingssnelheid, z-asbemonstering en fotobleaching. Het gebruik van de confocale gaatjesdiameter van 2,4 AE en de 60x waterdompelingsdoelstelling resulteerde in een optische sectiedikte van 1,73 μm. Vandaar dat een stapgrootte van 1 μm iets onder de Nyquist-bemonsteringscriteria ligt, maar dit is een compromis dat is gesloten om de tijd die nodig is om een z-stack te verkrijgen te verkorten. Voor zeer stabiele monsters, waarvoor snelheid niet kritisch is, kan een kleinere z-asstap en mogelijk een kleinere confocale gaatjesdiameter worden gebruikt om de z-asresolutie te verhogen. Bottom-top moet vergelijkbare resultaten opleveren en kan worden gebruikt om eventuele effecten van fotobleaching te evalueren die tijdens de z-scan kunnen optreden.
  11. Stel het Perfect Focus System (PFS) in, indien beschikbaar:
    OPMERKING: PFS stelt het systeem in staat om schommelingen in de scherptediepte tijdens beeldacquisitie te compenseren. De volgende stappen kunnen worden gebruikt om PFS in te stellen en deze stappen kunnen enigszins variëren, afhankelijk van de versie van de Nikon A1R en de gebruikte versie van NIS Elements.
    1. Markeer de symmetrische modus die wordt gedefinieerd door het bereikpictogram in het ND-acquisitievenster.
    2. Schakel de PFS-knop op de voorkant van de microscoop in (zorg ervoor dat de dichroïsche spiegelknop op het gedeelte onder de monstertrap 'in' is).
    3. Herdefinieer de bovenkant (draai tegen de klok in) en de onderkant (draai met de klok mee) met behulp van de knop aan de voorkant van de PFS-offsetcontroller.
    4. Definieer een relatieve z-positie/z-diepte door op 'relatief' te klikken in het ND-acquisitievenster.
    5. Klik op het geheugen op de voorkant van de microscoop zodat de software de relatieve z-diepte onthoudt.
  12. Nadat de z-stack acquisitie is voltooid, voegt u voorzichtig het gewenste reagens (forskolin of voertuigbesturing) toe met behulp van een pipet en wacht u 10 minuten.
    OPMERKING: Voeg het reagens heel voorzichtig toe om de cellen niet te verstoren of de positie van de celkamer in de microscoop XY-fase te verplaatsen; het is handig om in een volgende live view of afbeelding te controleren of het gezichtsveld niet is verschoven tijdens het toevoegen van reagens. De wachttijd van 10 minuten is voor de forskolin-behandeling om van kracht te worden. Als een alternatieve behandeling wordt gebruikt, moet de wachttijd mogelijk worden aangepast.
  13. Wijzig na 10 minuten de bestandsnaam en klik op uitvoeren in het ND-acquisitievenster.
  14. Herhaal stap 2.11 – 2.13 zoals hierboven beschreven voor ten minste 5 coverslips om voldoende resultaten te bereiken voor statistische analyse (n=5 voor elke behandelingsgroep – forskoline en voertuigcontrole).
  15. Bereid monsters en proef blanco's voor om de spectrale bibliotheek te construeren en spectrale beelden te verkrijgen met behulp van vergelijkbare acquisitie-instellingen zoals beschreven in stap 2.9 en 2.10.

3. Beeldanalyse

OPMERKING: Deze afbeeldingen zullen worden gebruikt om een spectrale bibliotheek te construeren die de zuivere spectra van alle individuele eindleden die in de studie aanwezig zijn, bevat. De eindleden in de spectrale bibliotheek kunnen variëren van studie tot studie als verschillende fluoroforen worden gebruikt. Een gedetailleerde procedure om de spectrale bibliotheek te construeren wordt verstrekt in een aanvullend informatiebestand met de naam "Supplemental File_Spectral Library". Hier beschrijven we het exporteren van gegevens naar .tiff bestanden, lineaire spectrale ontmenging, FRET-efficiëntiemetingen, driedimensionale reconstructie en schatting van cAMP-niveaus. Beeldanalyse kan worden uitgevoerd met behulp van verschillende beeldanalyse- en programmeerplatforms zoals ImageJ, Python, MATLAB of CellProfiler. In deze studies werden MATLAB-scripts gebruikt.

  1. Afbeeldingsgegevens exporteren:
    1. Maak nieuwe mappen met dezelfde bestandsnaam die overeenkomt met de spectrale z-stack-afbeeldingen die zijn verkregen in stap 2.13 en 2.14.
      OPMERKING: De volgende stappen voor het exporteren van gegevens zijn specifiek voor NIS Elements AR versie 4.30.01. Deze stappen kunnen enigszins variëren, afhankelijk van de versie van de software.
    2. Klik op Bestand, waarmee een bestandsvenster wordt geopend. Blader en selecteer het spectrale afbeeldingsbestand dat is verkregen in stap 2.12 en klik op Openen.
    3. Zodra het bestand is geladen, klikt u op Bestand→ importeren/exporteren→ ND-document exporteren.
    4. In het pop-upvenster: blader en selecteer de map die is gemaakt in stap 3.1.1, selecteer Tagged Image Format (TIF) voor Bestandstype, selecteer vervolgens Mono-afbeelding voor elk kanaal en Houd bitdiepte.
      OPMERKING: Het bestandsvoorvoegsel wordt vooraf gegenereerd; wijzig deze waarde voor het gemak. De indexvolgorde verandert afhankelijk van de kanalen die zijn geselecteerd en moet "z, c" weergeven voor indexering op basis van de locatie van het z-segment eerst en het golflengtebandnummer seconde. Zorg ervoor dat de vakken die overeenkomen met LUTs toepassen of Overlays invoegen of Puntnamen gebruiken, niet zijn geselecteerd.
    5. Klik op Exporteren om de tiff-bestanden als afzonderlijke tiff-bestanden naar een doelmap te exporteren.
    6. Herhaal stap 3.1.2 – 3.1.5 om spectrale beeldbestanden te exporteren die in stap 2.13 zijn verkregen.
  2. Lineaire spectrale ontmenging:
    1. Open de programmeersoftware.
      OPMERKING: Aangepast ontwikkeld programmeerscript om onbewerkte spectrale afbeeldingen te ontmengen, is te zien op de website van de University of South Alabama BioImaging and BioSystems, onder het tabblad Resources (https://www.southalabama.edu/centers/bioimaging/resources.html).
    2. Open het bestand met het label "Lineair mengen.m" en klik op de knop Uitvoeren in de werkbalk van de editor.
    3. Blader en selecteer de map met de geëxporteerde *.tif bestandsreeks die is gegenereerd door de NIS Elements-software.
    4. Klik op OK om door te gaan, waarna een nieuw venster wordt geopend met de naam Golflengte en Z-Slice.
    5. Kopieer de bestandsnaam van het eerste bestand (zonder z-slice en kanaalnummer) in de map die is geselecteerd in stap 3.2.4 en plak deze in de eerste stap van het dialoogvenster met het label "Voer de afbeeldingsnaam in".
    6. Voer het aantal kanalen in de tweede stap in met het label "Voer het aantal golflengtebanden in", het aantal z-segmenten in de derde stap met het label "Voer het aantal Z-segmenten in" en klik op OK.
      OPMERKING: Het aantal golflengtebanden kan veranderen als er wijzigingen worden aangebracht in de acquisitie-instellingen, zoals het aanpassen van het golflengtebereik of de golflengtestapgrootte. Het aantal Z-segmenten kan ook veranderen afhankelijk van de hoogte van de cel.
    7. Blader en selecteer het golflengtebestand met de naam "Wavelength.mat" in het pop-upvenster met het label "Selecteer het golflengte-informatiebestand" en klik op openen.
    8. Blader en selecteer het bestand "Library.mat" in het nieuwe pop-upvenster met het label "Selecteer het spectrale bibliotheekbestand", klik op Openen en wacht tot het mengen van de segmenten is voltooid.
      OPMERKING: Library.mat-bestand is een bestand met zuivere spectra voor elk eindlid fluorofoor, samen met celautofluorescentie en achtergrondspectrale handtekeningen. In dit geval omvatten eindlidfluooforen Turkoois, Venus en DRAQ5. Achtergrondspectrale signaturen omvatten cellulaire of matrixautofluorescentie, coverslipfluorescentie en coverslipdiffractie. Wavelength.mat-bestand is een bestand met golflengtekanaalinformatie dat wordt gebruikt om het spectrale beeld te verkrijgen. Een voorbeeld bibliotheekbestand en golflengtebestand zijn beschikbaar op de website van Bioimaging and Biosystems (zie de opmerking onder 3.2.1). Voor meer informatie over het genereren van spectrale bibliotheek- en golflengtebestanden raadpleegt u het aanvullende informatiebestand met de naam "Aanvullende File_Spectral bibliotheek". Ongemengde afbeeldingen die overeenkomen met elk z-segment worden opgeslagen in de map met de naam "Unmixed" die is gemaakt tijdens het ontmengingsproces in de map die is geselecteerd in stap 3.2.3.
  3. FRET Efficiency Berekening:
    1. Open het programmeerscript genaamd "multiFRRCF.m" en klik op uitvoeren.
      OPMERKING: Dit programmeerbestand is beschikbaar op de website van de University of South Alabama Bioimaging and Biosystems (zie opmerking onder stap 3.2.1).
    2. Voer het aantal experimentele proeven in dat u wilt analyseren in het pop-upvenster met de naam "hoeveel mappen moeten worden gereliced" en klik op OK.
      OPMERKING: Afbeeldingsgegevens van elk experiment moeten worden opgeslagen in een aparte niet-gemengde afbeeldingsmap. Met deze stap kan de analysecode eenvoudigweg over veel mappen worden herhaald als een tijdbesparende stap.
    3. Blader en selecteer de niet-gemengde map(en) en klik op OK.
      OPMERKING: Het aantal keren dat het pop-upvenster "Bladeren naar map" wordt geopend, is afhankelijk van het aantal dat is ingevoerd in het dialoogvenster "Hoeveel mappen moeten worden aangepast" in de vorige stap. Blader en selecteer de mappen achter elkaar.
    4. Voer in het nieuwe pop-upvenster de volgende informatie in de respectieve vakken in: schaalfactor is 12,4, Drempel is 5,6, X, Y en Z Frequentie zijn respectievelijk 5, 5 en 1, en het afvlakalgoritme is Gaussisch.
      OPMERKING: De schaalfactor is een waarde in pixels/μm en wordt gebruikt om de Z-richtingsbemonstering te schalen naar die van de XY-richting. De schaalfactor wordt verkregen uit de grootte van de afbeeldingspixel, die meestal wordt verstrekt als metagegevens in de afbeelding voor de meeste confocale microscoopsystemen. Als de afbeelding bijvoorbeeld wordt verkregen met een afstand van 0,08 μm/pixel, moet de schaalfactor 12,5 pixels/μm zijn. Drempelwaarde wordt gebruikt om de afbeeldingen te drempelwaarden en een binair masker van de cel te genereren. We hebben een lijst met optimale waarden gemaakt op basis van de intensiteit van de beelddonor+acceptor. Gebruik 4,5 als drempelwaarde als de afbeelding een heldere donor+acceptorintensiteit en een lage achtergrond heeft, een waarde tussen 5,6 en 6,5 voor afbeeldingen met een matige donor+acceptorintensiteit en/of een hogere achtergrond, en een waarde van 7,5 en hoger voor afbeeldingen met een donor+acceptor-intensiteit die lager is dan de achtergrond. De frequentiewaarde komt overeen met het interval, in aantal pixels, waarbij het snijden in de volgende stappen wordt uitgevoerd. Als de Z-diepte van de cel bijvoorbeeld 17 μm is met een stapgrootte van 1 μm en een schaalfactor van 12,5 pixels/μm wordt gebruikt in de XY-richting, wordt de diepte van de 3-dimensionale afbeeldingsdataset opnieuw bemonsterd op 212 pixels (Z-richting). Op basis van de ingevoerde Z-frequentiewaarde (bijvoorbeeld 1 pixel), wordt de 3-dimensionale afbeeldingsgegevensset opnieuw gesegmenteerd, beginnend boven aan de afbeeldingsgegevensset en vervolgens in stappen van 1 pixel naar beneden. Dit resulteert in 212 resliced afbeeldingen. Als een groter frequentiewaarde-interval zou worden ingevoerd voor Z-frequentie, zouden er minder afbeeldingen met aangepaste inhoud worden gegenereerd. Afbeeldingen met een resliced worden in de volgende stappen opgeslagen.
    5. Klik op uitvoeren en wacht tot alle FRET-metingen en reslicing zijn uitgevoerd.
      OPMERKING: Er wordt een aparte map gemaakt in de bovenliggende map waarin fret-efficiëntieafbeeldingen met aangepaste grijswaarden en gekleurde (een toegepaste colormap) FRET-efficiëntieafbeeldingen worden opgeslagen. Alle FRET-afbeeldingen met grijswaarden en colormaps die in de X-richting (YZ-vlak) zijn opgenomen, worden bijvoorbeeld opgeslagen in een map met de naam "Resliced_XFRET".
    6. Herhaal de analyse met vergelijkbare instellingen voor alle experimenten - voor en na forskolinebehandelingen en voertuigcontroles.
      OPMERKING: De stappen die in paragraaf 3.3 worden genoemd, beschrijven de waarden die moeten worden ingevoerd voor het aangepaste FRET-analyseprogrammeringsscript om 3-dimensionale FRET-afbeeldingsgegevens te genereren. Dit script voert echter verschillende bewerkingen uit tijdens het uitvoeren, waaronder: het laden van afbeeldingsgegevens, het maken van afbeeldingsstapels, vloeiend maken, FRET-efficiëntieberekeningen, het maken en toepassen van een celrandmasker, 3-dimensionale beeldreconstructie, het resliceren van 3-dimensionale afbeeldingen met opgegeven intervallen (frequenties), het toepassen van een kleurenkaart voor het visualiseren van FRET-wijzigingen en het opslaan van de gereliceerde afbeeldingsgegevens in dezelfde map. Aanvullende details zijn opgenomen als opmerkingen in het programmascript.

4. Fret-efficiëntie in kaart brengen naar cAMP-niveaus

  1. Open het programmeerbestand met de naam 'Mapping_FRET Efficiency_to_cAMP_concentration.m' en klik op uitvoeren in het hoofdvenster.
    OPMERKING: Het bestand is beschikbaar op de website van BioImaging en BioSystems (zie opmerking onder 3.2.1). Dit bestand leest grijswaarden FRET-efficiëntieafbeeldingen en converteert deze naar cAMP-niveaus op basis van een karakteristieke curve. Deze karakteristieke curve maakt gebruik van een cAMP-naar-FRET-relatie gedocumenteerd in literatuur15,36 die wordt beschreven door de Hill-vergelijking (de derde vergelijking hieronder). Kd van de sonde in intacte cellen is echter moeilijk in te schatten en we zijn er in onze berekeningen van uitgegaan dat het 1 μM is. Vandaar dat de resultaten worden weergegeven als een functie van Kd. (d.w.z. [cAMP] = x* Kd). Vergelijkingen die worden gebruikt om de FRET-efficiëntie te meten en FRET aan cAMP-niveaus toe te brengen, worden hieronder weergegeven:
    figure-protocol-1
    Waarbij E de FRET-efficiëntie is, en eenschijnbare en dschijnbare zijn ongemengde pixelintensiteiten van respectievelijk acceptor- en donorafbeeldingen.
    Qa en Qd zijn kwantumopbrengsten van acceptor en donor. Merk op dat Qa en Qd opheffen wanneer de vergelijking voor kλ is opgenomen in de FRET-efficiëntievergelijking, kλ een correctiefactor is:
    figure-protocol-2
    figure-protocol-3 en figure-protocol-4 zijn extinctiecoëfficiënten van donor en acceptor op de donor excitatie golflengte, i (405nm).
    figure-protocol-5
    E is FRET-efficiëntie en KD = Dissociatieconstante = 1 μM.
  2. Navigeer en selecteer de eerste FRET-afbeelding in grijsschaal (opgeslagen in stap 3.3.5) en klik op OK.
  3. Open de FRET/cAMP-beelden om de verdeling van cAMP-signalen in drie dimensies te inspecteren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Dit protocol beschrijft het gebruik van hyperspectrale FRET-beeldvormings- en analysebenaderingen om cAMP-gradiënten in drie ruimtelijke dimensies in levende cellen te meten. Er zijn verschillende belangrijke stappen betrokken bij het genereren van deze resultaten, waarvoor zorgvuldige aandacht vereist is bij het analyseren en kwantificeren van de gegevens. Deze belangrijke stappen omvatten de bouw van een geschikte spectrale bibliotheek, achtergrondspectraal onmenging, drempeling om celgrenzen te identificeren en FRET-e...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De ontwikkeling van FRET-biosensoren heeft de meting en visualisatie van cyclische nucleotidesignalen in afzonderlijke cellen mogelijk gemaakt, en er is een grote belofte voor het visualiseren van subcellulaire signaleringsgebeurtenissen13,22,37,38. Het gebruik van FRET-biosensoren vertoont echter verschillende beperkingen, waaronder de lage signaal-ruiskenmerken van veel op fluorescerende eiwi...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Drs. Leavesley en Rich onthullen financieel belang in een startend bedrijf, SpectraCyte, LLC, dat werd opgericht om spectrale beeldvormingstechnologieën te commercialiseren. Alle procedures die in dit protocol worden beschreven, zijn echter uitgevoerd met behulp van commercieel verkrijgbare producten die niet zijn gekoppeld aan SpectraCyte, LLC.

Dankbetuigingen

De auteurs willen dr. Kees Jalink (Het Nederlands Kanker Instituut en van Leeuwenhoek Center for Advanced Microscopy, Amsterdam, Nederland) bedanken voor het leveren van de H188 cAMP FRET biosensor en Kenny Trinh (College of Engineering, University of South Alabama) voor technische hulp bij het verkorten van de tijd die nodig is om onze op maat ontwikkelde programmeerscripts uit te voeren.

De auteurs willen graag de financieringsbronnen erkennen: American Heart Association (16PRE27130004), National Science Foundation; (1725937) NIH, S100D020149, S10RR027535, R01HL058506, P01HL066299).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html
Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Attofluor Cell ChamberInvitrogenA7816Attofluor bevat stalen cellkamers en een rubberen O-ring. De cellkamer houdt de dekglas vast en de O-ring zorgt voor een vergrendelingsmechanisme om de buffer in de cellkamer te houden zonder lekkage
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)Fisher ScientificBP231-100Oplosmiddel dat wordt gebruikt om een voorraadoplossing forskolin te bereiden.
DRAQ5 Fluorescent Probe SolutionThermo Scientific62252Kernlabel
Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM)Gibco11965-092Bevat voedingsstoffen en groeifactoren voor de cellen om te groeien en zich te delen in de kweekschalen.
Fetal Bovine Serum (FBS)SigmaF6178Groeifactorsupplement dat wordt toegevoegd aan het kweekmedium, DMEM
ForskolinSigmaF3917Adenylylcyclase-activator.
H188 Cyclic AMP FRET biosensorNetherland Cancer Institute, Dr. K. JalinkGiftPlasmid dat Turquoise (donor fluorofoor), Venus (acceptor fluorofoor) en bindingsdomein codeert verkregen uit Epac.
Image Jimage.netGratis downloadEen andere beeldverwerkingsplatform die wordt gebruikt om spectrale informatie en beeldverwerking te extraheren.
Integrating SphereOcean OpticsFOIS-1Wordt gebruikt om de verlichtingsintensiteit van de laserlijn bij verschillende laserintensiteiten te meten (?).
Laminin Mouse Protein, NaturalInvitrogen23017-015Dekglazen zijn bedekt met laminine en dit helpt bij hechting, groei en beweeglijkheid van de cel.
Lipofectamine 3000 Transfection KitInvitrogenL3000-015Transfectiereagens dat wordt gebruikt om cellen te transfecteren met H188 FRET biosensor
MATLABMathworksR2019aBeeldverwerkingsoperaties (lineaire unmixing en FRET-efficiëntieberekeningen) worden uitgevoerd door het schrijven van aangepaste programma's in de MATLAB-programmeeromgeving
Nikon A1R confocale microscoopNikon InstrumentsNikon A1RSpectraal beeldverwerving wordt uitgevoerd met behulp van een confocale microscoop.
Nikon Elements SoftwareNikon InstrumentsSoftware donglewordt gebruikt om nd2-beeldbestanden (multidimensionale beeldbestanden) te exporteren en te verwerken die zijn verkregen met behulp van Nikon A1R
NIST-Traceable Calibration LampOcean OpticsLS-1-CAL-INTEen lamp met een bekend spectrum voor gebruik als standaard
PBS pH 7.4 (1X)Gibco10010-023Meestal gebruikte buffer tijdens celkweek
Pulmonary Microvascular Endothelial Cells (PMVECs)In house - Cell culture core, Univeristy of South AlabamaGeïsoleerd uit de pulmonaire microvatsculatuur van rattenPMVECs vormen de binnenbekleding van een bloedvat.
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)Gibco15140-122Antibiotica worden toegevoegd aan het kweekmedium om besmetting van de cellen te voorkomen.
Pre-Cleaned Gold Seal Micro SlidesClay Adams3010Microscoopglaasjes die worden gebruikt voor celfixatie
ProLong Diamond Antifade Mounting MediaInvitrogenP36961Als monsters worden gefixeerd met behulp van antifade-montant, beschermt deze later de fluorescente kleurstoffen en chromoforen tegen vervagen.
SpectrometerOcean OpticsQE65000Wordt gebruikt om de spectrale respons van de lichtbron te meten (?)
Trypsin-EDTA (0,25%)Gibco25200-056Verteert de eiwit-eiwitbinding tussen de cel en het celmatrix en helpt bij het losmaken en opheffen van de cellen tijdens celplakken.
Tyrodes BufferMade in-houseMade in-houseTyrodes buffer wordt gebruikt om werkoplossingen te maken en om cellen in waterige oplossing te houden tijdens beeldacquisitie.
6 Well Cell Culture PlateCorning3506Laminine gecoate dekglazen worden geplaatst in een 6-wels kweekschaal (één dekglas/wels). Cellen samen met medium worden in elke wels toegevoegd.
25 mm Round Microscope Cover SlipsFisher Scientific12545102Cellen werden gekweekt op ronde glazen dekglazen
60X ObjectiefNikon InstrumentsPlan Apo VC 60X/1.2 WI ∞/0.15-0.18 WD 0.27water-immersie en veel gebruikt objectief voor cellen
```

Referenties

  1. Corbin, J. D., Sugden, P. H., Lincoln, T. M., Keely, S. L. Compartmentalization of adenosine 3':5'-monophosphate and adenosine 3':5'-monophosphate-dependent protein kinase in heart tissue. The Journal of Biological Chemistry. 252, 3854-3861 (1977).
  2. Terrin, A., et al. PGE1 stimulation of HEK293 cells generates multiple contiguous domains with different [cAMP]: role of compartmentalized phosphodiesterases. The Journal of Cell Biology. 175, 441-451 (2006).
  3. Bacskai, B. J., et al. Spatially resolved dynamics of cAMP and protein kinase A subunits in Aplysia sensory neurons. Science. 260, 222-226 (1993).
  4. Iancu, R. V., Ramamurthy, G., Harvey, R. D. Spatial and temporal aspects of cAMP signalling in cardiac myocytes. Clinical and Experimental Pharmacology & Physiology. 35, 1343-1348 (2008).
  5. Brunton, L. L., Hayes, J. S., Mayer, S. E. Functional compartmentation of cyclic AMP and protein kinase in heart. Advances in Cyclic Nucleotide Research. 14, 391-397 (1981).
  6. Hohl, C. M., Li, Q. Compartmentation of cAMP in adult canine ventricular myocytes. Relation to single-cell free Ca2+ transients. Circulation Research. 69, 1369-1379 (1991).
  7. Rich, T. C., et al. A uniform extracellular stimulus triggers distinct cAMP signals in different compartments of a simple cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 13049-13054 (2001).
  8. Sayner, S. L., Alexeyev, M., Dessauer, C. W., Stevens, T. Soluble adenylyl cyclase reveals the significance of cAMP compartmentation on pulmonary microvascular endothelial cell barrier. Circulation Research. 98, 675-681 (2006).
  9. Rich, T. C., Tse, T. E., Rohan, J. G., Schaack, J., Karpen, J. W. In vivo assessment of local phosphodiesterase activity using tailored cyclic nucleotide-gated channels as cAMP sensors. The Journal of General Physiology. 118, 63-78 (2001).
  10. Blackman, B. E., et al. PDE4D and PDE4B function in distinct subcellular compartments in mouse embryonic fibroblasts. Journal of Biological Chemistry. 286, 12590-12601 (2011).
  11. Sayner, S. L., et al. Paradoxical cAMP-induced lung endothelial hyperpermeability revealed by Pseudomonas aeruginosa ExoY. Circulation Research. 95, 196-203 (2004).
  12. Klarenbeek, J., Jalink, K. Detecting cAMP with an EPAC-based FRET sensor in single living cells. Methods in Molecular Biology. 1071, 49-58 (2014).
  13. Surdo, N. C., et al. FRET biosensor uncovers cAMP nano-domains at β-adrenergic targets that dictate precise tuning of cardiac contractility. Nature Communications. 8, 15031(2017).
  14. Ponsioen, B., et al. Detecting cAMP-induced Epac activation by fluorescence resonance energy transfer: Epac as a novel cAMP indicator. EMBO Reports. 5, 1176-1180 (2004).
  15. Vogel, S. S., Thaler, C., Koushik, S. V. Fanciful FRET. Science's STKE. 2006, (2006).
  16. Clegg, R. M. The History of FRET: From conception through the labors of birth. Reviews in Fluorescence. 3, (2006).
  17. Giepmans, B. N. G., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. The fluorescent toolbox for assessing protein location and function. Science. 312, 217-224 (2006).
  18. Manzella-Lapeira, J., Brzostowski, J. A. Imaging protein-protein interactions by Förster resonance energy transfer (FRET) microscopy in live cells. Current Protocols in Protein Science. 93, 58(2018).
  19. Cooper, D. M. F., Mons, N., Karpen, J. W. Adenylyl cyclases and the interaction between calcium and cAMP signalling. Nature. 374, 421-424 (1995).
  20. Sassone-Corsi, P. Coupling gene expression to cAMP signalling: role of CREB and CREM. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 30, 27-38 (1998).
  21. Rebhun, L. I. Cyclic nucleotides, calcium, and cell division. International Review of Cytology. 49, 1-54 (1977).
  22. Klarenbeek, J., Goedhart, J., Van Batenburg, A., Groenewald, D., Jalink, K. Fourth-generation Epac-based FRET sensors for cAMP feature exceptional brightness, photostability and dynamic range: characterization of dedicated sensors for FLIM, for ratiometry and with high affinity. PLOS ONE. 10, 0122513(2015).
  23. Leavesley, S. J., Rich, T. C. FRET: signals hidden within the noise. Cytometry Part A. 85, 918-920 (2014).
  24. Rich, T. C., Webb, K. J., Leavesley, S. J. Can we decipher the information content contained within cyclic nucleotide signals. The Journal of General Physiology. 143, 17-27 (2014).
  25. Annamdevula, N. S., et al. Spectral imaging of FRET-based sensors reveals sustained cAMP gradients in three spatial dimensions. Cytometry Part A. 93 (10), 1029-1038 (2018).
  26. Leavesley, S. J., Britain, A. L., Cichon, L. K., Nikolaev, V. O., Rich, T. C. Assessing FRET using spectral techniques. Cytometry Part A. 83, 898-912 (2013).
  27. Leavesley, S. J., Rich, T. C. Overcoming limitations of FRET measurements. Cytometry Part A. 89, 325-327 (2016).
  28. Fink, D. J. Monitoring Earcths Resources from Space. Technology Review. 75, 32-41 (1973).
  29. Goetz, A. F. H., Vane, G., Solomon, J. E., Rock, B. N. Imaging Spectrometry for Earth Remote Sensing. Science. 228, 1147-1153 (1985).
  30. Bücherl, C. A., Bader, A., Westphal, A. H., Laptenok, S. P., Borst, J. W. FRET-FLIM applications in plant systems. Protoplasma. 251, 383-394 (2014).
  31. Chen, Y., Mauldin, J. P., Day, R. N., Periasamy, A. Characterization of spectral FRET imaging microscopy for monitoring nuclear protein interactions. Journal of Microscopy. 228, 139-152 (2007).
  32. Zimmermann, T., Rietdorf, J., Girod, A., Georget, V., Pepperkok, R. Spectral imaging and linear un-mixing enables improved FRET efficiency with a novel GFP2-YFP FRET pair. FEBS Letters. 531, 245-249 (2002).
  33. Griswold, J. R., Annamdevula, N., Deal, J., Rich, T., Leavesley, S. Estimating FRET Efficiency using Excitation-Scanning Hyperspectral Imaging. Biophysical Journal. 112, 586(2017).
  34. Favreau, P. F., et al. Excitation-scanning hyperspectral imaging microscope. Journal of Biomedical Optics. 19, 046010(2014).
  35. King, J., et al. Structural and functional characteristics of lung macro- and microvascular endothelial cell phenotypes. Microvascular Research. 67, 139-151 (2004).
  36. Thaler, C., Koushik, S. V., Blank, P. S., Vogel, S. S. Quantitative multiphoton spectral imaging and its use for measuring resonance energy transfer. Biophysical Journal. 89, 2736-2749 (2005).
  37. Agarwal, S. R., et al. Compartmentalized cAMP signaling associated with lipid raft and non-raft membrane domains in adult ventricular myocytes. Frontiers in Pharmacology. 9, 332(2018).
  38. Johnstone, T. B., Agarwal, S. R., Harvey, R. D., Ostrom, R. S. cAMP signaling compartmentation: Adenylyl cyclases as anchors of dynamic signaling complexes. Mol Pharmacol. , (2017).
  39. Zhang, J., Li, H., Chai, L., Zhang, L., Qu, J., Chen, T. Quantitative FRET measurement using emission-spectral unmixing with independent excitation crosstalk correction. Journal of Microscopy. 257, 104-116 (2015).
  40. Zhang, J., Lin, F., Chai, L., Wei, L., Chen, T. IIem-spFRET: improved Iem-spFRET method for robust FRET measurement. Journal of Biomedical Optics. 21, 105003(2016).
  41. Levy, S., et al. SpRET: highly sensitive and reliable spectral measurement of absolute FRET efficiency. Microscopy and Microanalysis. 17, 176-190 (2011).
  42. West, S. J., et al. Hyperspectral Measurements Allow Separation of FRET Signals from Non-Uniform Background Fluorescence. Biophysical Journal. 112, 453(2017).
  43. Annamdevula, N. S., et al. An approach for characterizing and comparing hyperspectral microscopy systems. Sensors. 13, Basel. 9267-9293 (2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

cAMP distributiespectrale ontmengingconfocale microscopie3D beeldvormingcyclisch AMPFRET effici ntiespectrale bibliotheeklineaire ontmenging
Meting van 3-dimensionale cAMP-distributies in levende cellen met behulp van 4-dimensionale (x, y, z en λ) hyperspectrale FRET-beeldvorming en -analyse
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.