Atomic Force Microscopie gecombineerd met infraroodspectroscopie als hulpmiddel om single bacterium chemistry te onderzoeken

Samenvatting

Atomic Force Microscopy-Infrared Spectroscopy (AFM-IR) biedt een krachtig platform voor bacteriële studies, waardoor resolutie op nanoschaal kan worden bereikt. Zowel het in kaart brengen van subcellulaire veranderingen (bijvoorbeeld bij celdeling) als vergelijkende studies van de chemische samenstelling (bijvoorbeeld als gevolg van medicijnresistentie) kunnen worden uitgevoerd op een enkel celniveau in bacteriën.

Samenvatting

Atomic Force Microscopy-Infrared Spectroscopy (AFM-IR) is een nieuwe combinatorische techniek, die gelijktijdige karakterisering van fysische eigenschappen en chemische samenstelling van monster met nanoschaalresolutie mogelijk maakt. Door AFM te combineren met IR wordt de ruimtelijke resolutiebeperking van conventionele IR overwonnen, waardoor een resolutie van 20-100 nm kan worden bereikt. Dit opent de deur voor een breed scala aan nieuwe toepassingen van IR in de richting van het onderzoeken van monsters kleiner dan enkele micrometers, voorheen onhaalbaar door middel van conventionele IR-microscopie. AFM-IR is bij uitstek geschikt voor bacterieel onderzoek en levert zowel spectrale als ruimtelijke informatie op enkelcellig en intracellulair niveau. De toenemende wereldwijde gezondheidsproblemen en ongunstige toekomstvoorspellingen met betrekking tot bacteriële infecties, en vooral de snelle ontwikkeling van antimicrobiële resistentie, hebben een dringende behoefte gecreëerd aan een onderzoeksinstrument dat in staat is tot fenotypisch onderzoek op het niveau van één cel en subcellulair niveau. AFM-IR biedt het potentieel om aan deze behoefte te voldoen, door gedetailleerde karakterisering van de chemische samenstelling van een enkele bacterie mogelijk te maken. Hier bieden we een compleet protocol voor monstervoorbereiding en gegevensverzameling van enkele spectra en mapping modaliteit, voor de toepassing van AFM-IR op bacteriële studies.

Inleiding

Bacteriën zijn eencellige prokaryote organismen, die in verschillende vormen en maten voorkomen, meestal in het bereik van enkele honderden nanometers tot micrometers. Ze bestaan in verschillende habitats en zijn essentieel voor het bestaan van leven. In het menselijk lichaam zijn de meeste bacteriën in de darm onschadelijk en velen zijn in feite gunstig¹. Verschillende bacteriesoorten zijn echter pathogeen en veroorzaken een reeks infectieziekten. Bacteriële infecties kunnen leiden tot de ontwikkeling van sepsis en septische shock: een levensbedreigende aandoening, als gevolg van de reactie van het lichaam op een infectie². Sepsis is een wereldwijde grote bedreiging voor de gezondheid, met een hoge prevalentie wereldwijd en ernstige sterftecijfers. Alleen al in 2017 werden wereldwijd naar schatting 50 miljoen gevallen van sepsis geregistreerd, waarvan 11 miljoen met de dood tot gevolg (ongeveer 20%)². Bovendien bleek een afname van de overlevingskansen van de patiënt, als gevolg van vertraagde therapie, op uurbasis op te treden^3,4.

Bacteriële infecties worden behandeld met antibiotica. De ernst van de mogelijke gevolgen van bacteriële bloedbaaninfecties (BSFI's), samen met een duidelijke betekenis van snelle start van antimicrobiële therapie, leiden tot de noodzaak van onmiddellijke toediening van antibiotica. Omdat de huidige diagnostische benaderingen die in de klinische praktijk worden gebruikt (bijv. Bloedkrijven) echter relatief lang duren, vindt toediening van antibiotica vaak plaats voorafgaand aan een positieve BSI-diagnose⁵. Deze factor leidt tot uitgebreid overmatig gebruik van antibiotica, wat - samen met overmatig antibioticagebruik in andere sectoren zoals de landbouw - een ernstige evolutionaire druk creëert in de richting van de ontwikkeling van antimicrobiële resistentie (AMR)^6,7. AMR is momenteel een van de meest urgente wereldwijde gezondheidsproblemen^7,8 en zal naar verwachting in 2050 de belangrijkste doodsoorzaak worden⁹. De ontwikkeling van resistentie, samen met de verspreiding van AMR-stammen, vindt plaats in eenalarmerend tempo^7,8,9 en overtreft veruit de snelheid van ontdekking van nieuwe antibiotica¹⁰. Wereldwijd zijn er voortdurend nieuwe resistente fenotypen in opkomst, terwijl
onderzoek gericht op het begrijpen van de AMR-gerelateerde veranderingen is vaak traag en beperkt door beschikbare benaderingen¹¹. Bovendien richten de veelgebruikte methoden, zoals polymerasekettingreactie (PCR) en whole gene sequencing (WGS), zich alleen op genotypische veranderingen. Deze zijn niet voldoende om de mechanismen van^{resistentie 11}te onthullen , waardoor er dringend behoefte is aan een onderzoeksinstrument waarmee de chemische samenstelling van bacteriën kan worden begrepen.

Infraroodspectroscopie (IR) biedt een moleculaire karakterisering van het monster en is dus een veelbelovende kandidaat voor fenotypische bacteriële spleet. Sinds de vroege toepassingen¹², werd een grote omvang van voorbeelden van het gebruik ervan aangetoond in de literatuur^13,14. Deze omvatten fenotypische identificatie van bacteriën op genus^15,soort¹⁶en stam^17,18 niveau. De ruimtelijke resolutie van conventionele IR is echter beperkt tot enkele micron vanwege de golflengtediffractie ruimtelijke resolutielimiet¹⁹. Aangezien de grootte van de meeste bacteriën onder die limiet ligt (bijv. Staphylococcus aureus ≈ diameter van 400 nm), is conventionele IR niet van toepassing op onderzoek op eencellig of intracellulair niveau.

De beperking van de ruimtelijke resolutie werd onlangs overwonnen door IR-spectroscopie te combineren met Atomic Force Microscopy (AFM-IR). In dit geval wordt de IR-absorptie indirect gedetecteerd, door thermische uitzetting van het materiaal^19,20,21,22. Kortom, de absorptie van IR-straling resulteert in een lokale temperatuurstijging. Dit kan direct²³ worden gemeten of door de meting van oscillatie van de AFM cantilever-sonde, als gevolg van krachtimpuls gecreëerd door IR-absorptie^20,21. De combinatorische AFM-IR-techniek maakt het mogelijk om een ruimtelijke resolutie van bijna 20 nm te bereiken, waardoor gelijktijdig informatie wordt verstrekt over lokale fysische eigenschappen van een monster (AFM) en de chemische samenstelling ervan (AFM-IR). Verzameling van beide, enkele spectra van geselecteerde plekken en het in kaart brengen van de intensiteit van geselecteerde golfnummerwaarden binnen een gekozen gebied zijn mogelijk.

Gezien de haalbare ruimtelijke resolutie van AFM-IR, is het duidelijk dat de techniek de mogelijkheid opent van chemisch / fenotypisch onderzoek van enkele bacteriecellen en hun intracellulaire samenstelling²⁴. Tot nu toe werden verschillende voorbeelden van de toepassing van AFM-IR voor afzonderlijke bacteriën aangetoond in de literatuur^{19,20,21,22,25,26,27,28.} Deze omvatten enkelvoudige spectrale analyse^19,21,22 en mapping op subcellulair niveau^{19,22,25,26,27,28.} Het vermogen om intracellulaire lipide blaasjes²⁷ en virussen²⁸ binnen één bacterie te detecteren, is bijvoorbeeld beschreven. Deze resultaten tonen het nut aan van AFM-IR voor studies op nanoschaal van afzonderlijke bacteriën en klinisch relevante pathogenen¹⁹.

Daarom presenteren we een monstervoorbereidings- en verzamelmethode voor AFM-IR-gegevens van meerlaagse, monolaagse en eencellige bacteriële monsters. Het hierin beschreven protocol werd toegepast om verschillende soorten bacteriën²² en de veranderingen in hun chemische samenstelling te bestuderen. In het bijzonder werd de in vivo ontwikkeling van vancomycineresistentie en daptomycine niet-gevoeligheid onderzocht in klinische paren van S. aureus¹⁹. Zowel vancomycine intermitterende resistentie als daptomycine niet-gevoeligheid in S. aureus (VISA en DpR) ontstonden relatief recent, na het toegenomen gebruik en de introductie van deze antibiotica in klinieken, wat een aanzienlijk medisch probleem vormt. Bovendien blijft met name het mechanisme van niet-gevoeligheid voor daptomycine nog steeds ongrijpbaar, waardoor de ontwikkeling van alternatieve geneesmiddelen wordt belemmerd^19,29. Het gepresenteerde protocol richt zich op het leveren van betrouwbare AFM-IR-spectra van afzonderlijke bacteriën, die verder kunnen worden geanalyseerd met behulp van een verscheidenheid aan chemometrische benaderingen, volgens de experimentele doelstellingen. Het omvat bovendien de mapping-benadering, die van toepassing is op intracellulaire studies.

Protocol

Al het werk dat met pathogene bacteriën wordt uitgevoerd, moet worden uitgevoerd met passende veiligheidsmaatregelen. Deze omvatten het werken in een laboratorium met een adequaat bioveiligheidsniveau en in een bioveiligheidscabine (PC2) en een zorgvuldige decontaminatie van het werkgebied met een geschikt desinfectiemiddel, bijvoorbeeld 80% ethanoloplossing. Geschikte PBM moeten de hele tijd worden gedragen.

1. Bereiding van oplosmiddelen en materialen

1. Oplosmiddelen: Gebruik ultrapijn water als oplosmiddel. Gebruik gezuiverd water, geautoclaveerd voorafgaand aan het experiment om mogelijke kruisbesmetting te voorkomen.
2. Substraat: Gebruik een van deze substraten voor AFM-IR, bijvoorbeeld ZnSe, CaF_2,BaF_2,enz. Omdat AFM-IR in principe een niet-destructieve techniek is, kan men na afm-ir-analyse diverse andere onderzoeksinstrumenten toepassen op dezelfde steekproef. Correlatie van de resultaten met Raman-spectroscopie kan bijvoorbeeld worden uitgevoerd als Raman grade CaF_2- of BaF_2-dia's worden gebruikt.
3. Gebruik glazen injectieflacons in plaats van plastic buizen, omdat plastic het monster kan verontreinigen.

2. Monstervoorbereiding afm-ir

1. Groei/incubatie van het monster
   1. Kweek bacteriën in vloeibare media of op vaste platen. Selecteer het type medium, de groeiomstandigheden (bijv. temperatuur, beschikbaarheid van zuurstof) en de groeitijd volgens de specifieke vereisten van de onderzochte bacteriesoort. Voor S. aureus Heart Infusion (HI) kunnen bijvoorbeeld agarplaten worden gebruikt, met groei gedurende 16 uur in 37 °C in aerobe omstandigheden.
      OPMERKING: Om de beste resultaten te bereiken, moet de groei / incubatie voldoende bacteriën opleveren die het mogelijk maken om een micropellet van monster te verzamelen. Het specifieke aantal kolonievormende eenheden of bacteriële cellen is afhankelijk van het type en de grootte van de bacterie.
2. Monsterdepositie
   1. Gebruik een steriele lus om bacteriën uit de kolonies op de agarplaat te verzamelen en over te brengen naar een glazen buis. Verzamel bacteriën alleen van de bovenkant van de kolonies. Bij het verzamelen van monsters van een vloeibare cultuur, met behulp van een pipet, breng ongeveer 1 ml van de bacteriële suspensie over naar een glazen buis. Het volume kan worden aangepast afhankelijk van de bacteriële belasting.
      OPMERKING: Het is belangrijk om te proberen geen medium van onder de kolonie te verzamelen (of zoveel mogelijk te minimaliseren). De volgende stappen van monstervoorbereiding zijn gericht op het verwijderen van mogelijke resten van media. Minimalisatie van het potentiële mediumresidu vanaf het begin maakt de spectrale verwerving van gegevens van gezuiverde bacteriële cellen mogelijk. De stappen 2.2.2 en 2.2.3 zijn van toepassing op monsters die zijn bereid uit agarplaten. Voor monsters bereid uit vloeibare media gaat u naar stap 2.2.4.
   2. Voeg 1 ml ultrapijn water toe aan de buis. Vortex totdat de verzamelde bacteriële pellet niet langer zichtbaar is aan de onderkant van de buis (meestal 1-2 min).
   3. Schat de ruwe troebelheid van de oplossing met behulp van bijvoorbeeld McFarland-normen door visuele vergelijking³⁰ tussen de bereide oplossing en McFarland-normen. Als de troebelheid van bacteriële suspensie erg laag lijkt te zijn, voeg dan meer bacteriën uit de plaat toe met behulp van een steriele lus en vortex opnieuw. Herhaal dit totdat de ruwe troebelheid van de oplossing vergelijkbaar is met McFarland-normen 0,5 en 1. Dit zal over het algemeen een goede hoeveelheid bacteriële pellet opleveren.
   4. Centrifugeer de bacteriële suspensie bij 3.000 x g gedurende 5 minuten om een pellet te verkrijgen.
      OPMERKING: Centrifugatieparameters kunnen worden gewijzigd om bacteriële pellets te verkrijgen. Voorzichtigheid is geboden bij het verhogen van de g-kracht, om geen breuk van bacteriën te veroorzaken (vooral in het geval van Gram-negatieve bacteriën).
   5. Verwijder met een pipet voorzichtig het supernatant van boven de pellet. Voeg 1 ml ultrapijn water toe aan de buis en vortex om de pellet opnieuw te laten zweven. Centrifugeer vervolgens het monster zoals in stap 2.2.4 is gedaan.
   6. Herhaal de wasprocedure (stappen 2.2.2 en 2.2.4) ten minste drie keer. In geval van verzameling van het eerste monster uit vloeibare media, herhaalt u de procedure ten minste vier keer (verwijdering van de media gevolgd door drie wasbeurten).
   7. Verwijder na de laatste wasbeurt het supernatant, voeg ultrapijn water en vortex toe gedurende ten minste 2 minuten. Deponeer vervolgens 5 μL van het monster op het substraat (bijv. Raman-klasse CaF₂).
   8. Als de gewenste dikte van het monster een meerlaagse bacterie is, laat het monster dan aan de lucht drogen.
   9. Als de gewenste dikte monolaag of individuele bacteriën is, voeg dan onmiddellijk na het deponeren van het monster (stap 2.2.7) tussen 20-100 μL ultrapijn water toe en meng voorzichtig met een pipetpunt. Laat aan de lucht drogen.
      OPMERKING: Het exacte volume water kan variëren tussen experimenten, omdat het afhankelijk is van vele factoren (bijv. Grootte van het organisme, dichtheid van de pellet, enz.) en daarom het best empirisch kan worden bepaald. De voorbereiding van een reeks monsters met verschillende volumes ultrapijn water maakt het mogelijk om een monster te selecteren met de gewenste dikte / dichtheid van bacteriën. De dikte/dichtheid van bacteriën kan eenvoudig worden gevisualiseerd via AFM in de volgende stadia. Voorbeelden van AFM-beelden uit monolaagse en eencellige monsters zijn weergegeven in figuur 1A-H.
   10. Monteer het substraat op een AFM metalen monsterschijf met dubbelzijdig plakband.

3. Instrumentvoorbereiding

OPMERKING: De instrumentele procedures die hier worden beschreven, zijn voor het instrument dat is opgenomen in de tabel met materialen. De gedetailleerde instrumentele procedure kan enigszins afwijken van de hier beschreven procedure bij gebruik van een nieuwer model van het AFM-IR-instrument.

1. Schakel het instrument in en initialiseer het door op de knop Initialiseren te drukken. Zorg ervoor dat de lasersluiter in de open positie staat voor de lasertest.
2. Als een spoelsysteem is ingesteld, reindt u het instrument met N₂ door de stroom van N₂in te schakelen. Pas de stikstofzuivering aan om een stabiele luchtvochtigheid te bereiken (bijvoorbeeld 20%). Zorg ervoor dat de luchtvochtigheid niet fluctueert tijdens metingen en tussen het verzamelen van achtergrond- en monstergegevens. Het wordt aanbevolen om ongeveer 20 minuten de luchtvochtigheid te stabiliseren.
3. Laad het monster in de monsterkamer door op de knop Laden te drukken. Het laden van monsters gebeurt via de softwarewizard. Richt u tijdens het bedienen van de softwarewizard eerst op de punt, gebruik pijlen om de microscooptrap in de Z-richting te bewegen en klik op Volgende. Ten tweede, pas de plek voor gegevensverzameling aan, met behulp van pijlen die de beweging in het vliegtuig begeleiden en lijn de AFM-laser en AFM-detector uit met behulp van de knoppen aan de bovenkant van de AFM-kop. Richt vervolgens op het monsteroppervlak door de microscooptrap in Z-richting te bewegen.
   OPMERKING: Gedetailleerde illustraties van elke stap van het laden van monsters zijn te zien in de softwarehandleiding³¹. De focus op het monster moet met zorg worden uitgevoerd. Gebruik bij het naderen van het monsteroppervlak in de Z-richting een laag motortoerental.
4. Benader het voorbeeld zonder in te schakelen door op de knop Benaderen te klikken.

4. Gegevensverzameling

1. Achtergrond
   1. Verzamel voorafgaand aan gegevensverzameling de achtergrond. Voor het verzamelen van achtergronden moet u ervoor zorgen dat de lasersluiter in de positie Open staat. Selecteer het spectrale bereik en de resolutie (afhankelijk van het doel van de analyse) en het aantal scans en het aantal co-gemiddelden van de achtergrond. Deze worden over het algemeen aanbevolen om hoog te zijn (bijv. 1024 scans en 3 co-gemiddelden).
      OPMERKING: Over het algemeen worden spectrale resoluties van 4 cm^-1 of 8 cm^-1 en spectrale bereiken van 3.200 cm^-1–2.800 cm^-1 en 1.800 cm^-1–900 cm^-1 aanbevolen.
   2. Sla na het verkrijgen van de achtergrond het achtergrondbestand op. Het bestand wordt niet automatisch opgeslagen. Wijzig de positie van de lasersluiter in Sluiten.
2. Monster – enkele spectra
   1. Druk op de Engage-knop om deel te nemen aan het voorbeeld. Het systeem begint het monsteroppervlak te naderen, totdat direct contact wordt gedetecteerd.
      OPMERKING: Het instelpunt dat in dit werk werd gebruikt, varieerde tussen 0,15-2 V en de feedbackwinsten (I Gain en P Gain) zouden meestal worden ingesteld op 3 en 10. NIR2-contactsondes worden vaak gebruikt met nanoIR2-systeem (model: PR-EX-nIR2-10, resonantiefrequentie (kHz): 13 +/−4 kHz, veerconstante (N/m): 0,07−0,4 Nm^-1).
   2. Verzamel een AFM-afbeelding om het oppervlak te visualiseren. Scan in eerste instantie een groter gebied (bijv. 50 x 50 μm) met een lagere ruimtelijke resolutie (bijv. 200 x 200 punten) (Figuur 1I).
      OPMERKING: AFM-IR-gegevens worden altijd verzameld in contactmodus, maar de AFM-gegevens kunnen worden verzameld in contact- of tapmodus.
   3. Selecteer in de AFM-hoogte/afbuigingsafbeelding een specifiek interessegebied en stel het opnieuw af met een hogere ruimtelijke resolutie(figuur 1J-K). Zorg ervoor dat de snelheid van gegevensverzameling geschikt is, met langzame tipbewegingen (bijv. Scansnelheid 0,2-0,4 Hz).
   4. Selecteer de meetplek (bijvoorbeeld een enkele bacterie) en verplaats de punt naar de plek.
   5. Lijn de IR-laser uit. Gebruik hiervoor een golfnummer waarbij het monster zal absorberen. Voor biologische materialen kan dit bijvoorbeeld amide I (1655 cm^-1)zijn. Zorg ervoor dat het Band Pass-filter is uitgeschakeld en klik op IR starten. De rechtergrafiek in de nanoIR-meter (FFT van de afbuiging weergegeven als amplitude versus frequentie) moet ten minste één duidelijke piek laten zien en de linkergrafiek (afbuiging versus tijd) moet een periodieke golfvorm hebben. Als dit niet het geval is, ga dan verder met het optimaliseren van de IR-spots.
      OPMERKING: Zelfs als de Fast Fourier Transform (FFT) en de afbuiging het verwachte profiel laten zien, wordt het aanbevolen om de optimalisatie van IR-spots uit te voeren voor ten minste meerdere golfnummers, waar banden worden verwacht.
   6. Optimaliseer de hotspots voor de IR-gegevensverzameling met behulp van de geselecteerde golfnummerwaarden. Het kan nuttig zijn om een conventioneel IR-spectrum van de bacteriën te gebruiken (bijv. ATR-spectrum van bacteriële pellets) om de posities van de banden te identificeren en deze te gebruiken om de hotspots te optimaliseren. Selecteer verschillende golfnummerwaarden (bijvoorbeeld 8-10) uit verschillende spectrale gebieden.
      OPMERKING: Als het conventionele IR-spectrum van bacteriën van belang niet kon worden verzameld voorafgaand aan de afm-ir-gegevensverzameling, kunnen bacteriële spectra die beschikbaar zijn in de literatuur worden gebruikt als een ruwe leidraad. Het resultaat van de optimalisatie van een IR-spot is een afbeelding, die een kaart van het FFT-magnitudesignaal op elke x- en y-locatie presenteert. De locatie met het grootste signaal wordt automatisch geselecteerd. Voorbeelden van dergelijke afbeeldingen worden gegeven in softwarehandleiding³¹.
   7. Na het optimaliseren van de IR-spots voor geselecteerde golfnummerwaarden, definieert u de parameters van spectrale gegevensverzameling: spectraalgebied, spectrale resolutie, aantal scans en toegepast vermogen en voert u deze in de juiste vensters in de software in. De spectrale resolutie moet overeenkomen met de achtergrondresolutie en het spectrale gebied moet zich binnen het spectrale gebied bevinden waarvoor achtergrond is verzameld.
      OPMERKING: Een algemene eerste set parameters zou kunnen zijn: spectraal bereik: 3200 cm^-1–2800 cm^-1 en 1800 cm^-1–900 cm^-1, spectrale resolutie: 4 cm^-1 of 8 cm^-1, aantal scans: 512–2048.
   8. Pas indien nodig het laservermogen aan, afhankelijk van het signaal. Over het algemeen moeten waarden tussen 8% -10% van het laservermogen voldoende zijn voor een goede kwaliteit van het signaal. Hogere waarden kunnen met voorzichtigheid worden gebruikt, omdat ze kunnen leiden tot schade aan het monster.
      OPMERKING: Het percentage laservermogen kan variëren afhankelijk van het type IR-laser. De hier gegeven procentuele waarden zijn voor OPO laser.
   9. Klik op Verwerven om AFM-IR spectrum te verzamelen.
   10. Verzamel de AFM-gegevens uit hetzelfde gebied opnieuw na het verzamelen van het AFM-IR-spectrum. Dit wordt ten zeerste aanbevolen omdat het mogelijke drift en / of destructieve invloed op het monster zal onthullen.
   11. Als het AFM-IR-spectrum bevredigend is en er geen destructieve invloed op de steekproef wordt waargenomen, ga dan verder met het verzamelen van gegevens. Definieer indien nodig een reeks punten voor gegevensverzameling met behulp van de optie Array en de verzamelde AFM-hoogte- of afbuigingsafbeelding. Deze optie maakt het mogelijk om achtereenvolgens spectra van elk punt te verzamelen met dezelfde spectrale parameters als gedefinieerd voor een enkel spectrum.
   12. Als het AFM-beeld dat is verzameld na het verzamelen van AFM-IR-spectrum destructieve invloed op het monster (meestal een verbrande plek) onthult, verminder dan het vermogen; selecteer een andere plek en herhaal de stappen 4.3.8–4.3.11.
   13. Als het signaal in het AFM-IR-spectrum niet bevredigend is, controleer dan de juistheid van de optimalisatie van IR-spots (stap 4.3.6). Als dit juist is, verhoogt u het laservermogen iets en herhaalt u de stappen 4.3.7–4.3.11. Dit kan worden herhaald totdat een bevredigend signaal is bereikt.
3. Voorbeeld – beeldvormingsbenadering
   OPMERKING: Het wordt ten zeerste aanbevolen om een enkel AFM-IR-spectrum van de bacterie vast te leggen voordat u een intensiteitsverdelingsbeeld verzamelt voor een geselecteerde golfnummerwaarde.
   1. Leg een AFM-afbeelding vast van het gekozen steekproefgebied. Om dit te doen, verzamelt u eerst AFM-afbeelding van een groter gebied met een lagere ruimtelijke resolutie (bijv. 50 x 50 μm, 200 x 200 punten), selecteert u vervolgens een interessegebied en verzamelt u een AFM-afbeelding met verhoogde ruimtelijke resolutie (zoals geïllustreerd in figuur 1I-K).
   2. Selecteer de golfnummerwaarden voor AFM-IR-beeldvorming.
   3. Zorg ervoor dat de IR-spot van de laser is geoptimaliseerd voor de geselecteerde golfnummerwaarden (stap 4.3.6). Als de IR-spot niet is geoptimaliseerd voor sommige golfnummers (geen duidelijk maximum), optimaliseer deze dan voor hen.
   4. Definieer de parameters van het afgebeelde gebied: de breedte en hoogte, het aantal gegevenspunten in X- en Y-richting.
      OPMERKING: Als de opeenvolgende selectie van vlekken uit de vorige AFM-afbeeldingen wordt toegepast (zoals weergegeven in figuur 1I-K),worden de breedte- en hoogtevelden automatisch opgevuld bij het markeren van het gebied.
   5. Definieer de parameters van spectrale signaalacquisitie: de golflengte, het aantal scans en het laservermogen.
      OPMERKING: Het aantal scans moet binnen redelijke grenzen worden gehouden. 64 of 32 scans zorgen meestal voor voldoende signaal.
   6. Definieer de parameters van AFM tip beweging door te klikken op de Scan Rate. Hoe hoger het aantal scans in de vorige stap en het aantal datapunten in X-richting, hoe langzamer de tipbewegingen moeten zijn. Gebrek aan aanpassing tussen deze parameters zal resulteren in een te snelle beweging van de tip, waardoor de daadwerkelijke verwerving van een bepaald aantal scans vanaf elk punt wordt voorkomen.
      OPMERKING: Voor een geschikte verzameling IR-signalen met 64 co-toevoegingen en 200 punten stelt u bijvoorbeeld de scansnelheid in op 0,07 kHz.
   7. Zorg ervoor dat het selectievakje IR-beeldvorming inschakelen is aangevinkt.
   8. Begin met beeldvorming. AFM-IR van de signaalintensiteit bij het geselecteerde golfnummer wordt gelijktijdig met de AFM-gegevens uit dat gebied verzameld.
      OPMERKING: Wanneer de OPO-laser wordt gebruikt, is het mogelijk om bovendien gelijktijdig contactresonantie piekfrequentiebeeld te verzamelen. Dit kan worden gebruikt om informatie te verkrijgen over de relatieve stijfheid van het monster op verschillende locaties.
   9. Gebruik het venster Capture Sequence om een opeenvolgende verzameling AFM-IR-gegevens uit hetzelfde gebied in te stellen met dezelfde parameters, maar voor verschillende golfnummerwaarden. Om dat te doen, opent u het venster Capture Sequence, typt u elk golfnummer in en definieert u het toegepaste laservermogen (voor elk golfnummer).
   10. Exporteer de verzamelde gegevens (AFM en AFM-IR, enkele spectra en beeldvorming) in verschillende formaten en analyseer deze met behulp van methoden die geschikt zijn voor specifieke onderzoeksdoelen.

Resultaten

Het beschreven protocol maakt het mogelijk om een reeks soorten celverdelingen van bacteriën op het substraat te verkrijgen, afhankelijk van de initiële concentratie van het monster en de hoeveelheid toegevoegd water. Figuur 1 illustreert de voorbeelden van AFM-beelden (hoogte en doorbuiging) die zijn opgenomen uit monolagen en eencellige monsters die zijn bereid met behulp van het beschreven protocol van Gram-positieve (S. aureus) en Gram-negatieve (Escherichia coli) bacteriën.

Het hier beschreven protocol kan worden gebruikt voor AFM-IR-beeldvorming van intra- en extracellulaire structuren van afzonderlijke bacteriën. Een voorbeeld van deze toepassing is te zien in figuur 2, die de resultaten toont van het monitoren van de ruimtelijk gelokaliseerde chemische veranderingen die optreden tijdens de deling van een S. aureuscel. Hoewel luchtdrogen algemeen wordt beschouwd als een fixatiebenadering voor bacteriële bereiding, vertonen bacteriën van nature een zeer hoge weerstand tegen externe factoren zoals temperatuur en werd gemeld dat ze uitdroging overleven³². De hier gepresenteerde resultaten werden verkregen uit een aan de lucht gedroogd monster. De vorming van een septum, optredend voorafgaand aan de celdeling, werd waargenomen en gemonitord via AFM-beeldvorming (figuur 2A-D) door 12 beelden van hetzelfde gebied achter elkaar te verzamelen (verzameling van een enkel beeld ≈ 20 min). Figuur 2A-D toont 4 geselecteerde AFM-afbeeldingen, met een tijd tussen het verzamelen van elke afbeelding van ongeveer 40 minuten. De gevormde structuur (septum) is 45 nm hoog. Het gevormde septum is duidelijk zichtbaar in AFM-hoogte- en afbuigingsbeelden (figuur 2E-F). De AFM-IR-spectra die werden geregistreerd vanaf het cel- en septumgebied (figuur 2G, oorsprongspunten gemarkeerd in figuur 2F) werden voorafgaand aan de vergelijking genormaliseerd tot de amide I-band, om de invloed van variërende monsterdikte tussen punten van gegevensverzameling te minimaliseren. Het AFM-IR-spectrum van het septum wordt gekenmerkt door een hogere relatieve intensiteit van banden bij 1240 en 1090 cm^-1 in vergelijking met AFM-IR-spectrum verzameld uit celgebied. Deze worden toegeschreven aan koolhydraat- en fosfodiëstergroepen van celwandcomponenten (waaronder bijvoorbeeld peptidoglycaan en teichoïnezuur)²².

Het beschreven protocol kan ook worden gebruikt voor vergelijking van een enkele spectra tussen een aantal verschillende monsters. Een voorbeeld van deze toepassing samen met de resultaten is weergegeven in figuur 3 en figuur 4. Het doel van de studie is om de chemische veranderingen te bepalen die optreden als gevolg van in vivo ontwikkeling van vancomycine intermitterende resistentie in S. aureus (VISA). Voor dit doel werden klinische paren monsters verzameld van patiënten, waarbij de moederstam werd geïsoleerd bij opname in het ziekenhuis en voorafgaand aan antibiotische therapie (vancomycine-gevoelige S. aureus, VSSA) en de dochterstam geïsoleerd van dezelfde patiënt na opname van antibiotica en klinisch falen. Monsters werden verder gekweekt op agar medium en bereid volgens het protocol (Figuur 3A-B). De AFM-IR-spectra werden verzameld uit meerdere enkele bacteriën (en meerdere monsters) voor VSSA en VISA en vervolgens geanalyseerd met behulp van verschillende chemometrische benaderingen(figuur 3C).

Er werden geen morfologische verschillen waargenomen tussen VSSA- en VISA-cellen(figuur 4A-C). De AFM-IR spectra (Figuur 4D,F) en hun tweede derivaten (Figuur 4E,G) toonden echter een duidelijk verschil in de chemische samenstelling tussen resistente en gevoelige stammen. De relatieve intensiteit van de banden geassocieerd met koolhydraat- en fosfodiëstergroepen van celwandcomponenten (in het bijzonder de band bij 1088 cm^-1) nam duidelijk toe in de resistente stam, vergeleken met de gevoelige tegenhanger. Van belang is het feit dat alle gehercodeerde spectra (VISA: 81, VSSA: 88) een kleine standaarddeviatie vertonen. Dit toont een goede reproduceerbaarheid aan van gegevens die zijn geregistreerd uit verschillende monsters die uit dezelfde stam zijn bereid, omdat er geen onderscheid mogelijk was tussen spectra die werden geregistreerd uit verschillende monsters van dezelfde stam. De waargenomen verschillen wezen op een verhoogde dikte van de celwand bij resistente stammen, vergeleken met de gevoelige tegenhanger, die in overeenstemming blijft met andere literatuurrapporten^33,34.

Figuur 1: Representatieve AFM-beelden van diverse bacteriemonsters voor AFM-IR metingen. Afhankelijk van de verdunning op het substraat, maakt het protocol het mogelijk om meerlagen en monolagen van bacteriën en eencellige monsters te verkrijgen. Representatieve AFM-beelden van: (A–D) monolaag en (E–H) eencellig monster voor (A,B,E,F) Gram-positieve (S. aureus) en (C,D,G,H) Gram negatieve (E. coli) bacteriën. (A,C,E,G) tonen hoogtebeelden en (B,D,F,H) tonen overeenkomstige afbuigingsbeelden. Grootte van de afgebeelde gebieden: (A-D, G, H) 20 x 20 μm, (E, F) 50 x 50 μm. (I-K) opeenvolgende selectie van een gebied voor AFM-IR-mapping. Dit wordt bereikt met behulp van AFM-beeldvorming met toenemende ruimtelijke resolutie in het voorbeeld van een enkele S. aureuscel. Elke afbeelding wordt verzameld door 200 x 200 punten te bemonsteren, met een toenemende ruimtelijke resolutie als gevolg van de verkleining van de grootte van het afgebeelde gebied. Grootte van de afgebeelde gebieden: (I) 40 x 40 μm, (J) 20 x 20 μm en (K) 2,24 x 2,24 μm. Het zwarte vierkant in (I) markeert het gebied afgebeeld in (J). Het zwarte vierkant in (J) markeert het gebied afgebeeld in (K). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Monitoring S. aureus celdeling via AFM-IR. (A–D) AFM-beelden van S. aureuscel die de vorming van septum voorafgaand aan celdeling laten zien. Grootte van het afgebeelde gebied: 2 x 2 μm. De beelden werden geselecteerd uit een grotere reeks (12 beelden opgenomen elke 20 minuten) en vertegenwoordigen gegevens die elke 40 minuten zijn opgenomen. (E-F) AFM-hoogte- en afbuigingsbeeld opgenomen aan het einde van celtussenschotvorming met gemarkeerde verzamelpunten van AFM-IR-spectra. Grootte van het afgebeelde gebied 1,17 x 1,15 μm. De hoogte van de nieuw gevormde structuur is 45 nm. (G) AFM-IR spectra geregistreerd van celgebied (zwart) en septumgebied (rood) (gemarkeerd in (F)), in het bereik 1400-900 cm^-1. Beide spectra werden genormaliseerd naar de amide I-band en tonen een toename van de relatieve intensiteit van celwandcomponenten uit het septum. Dit cijfer is gewijzigd van K. Kochan et al.²². Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Een overzicht van de experimentele opzet voor AFM-IR studie naar antimicrobiële resistentie. A)Herkomst van het monster en initiële voorbereiding: gevoelige ouderstam werd verzameld bij een patiënt voorafgaand aan antibiotische therapie en de dochterresistente stam was afkomstig van dezelfde patiënt na antibioticatherapie en klinisch falen (in vivo resistentieontwikkeling). Bacteriën werden geïsoleerd en gekweekt op Heart Infusion (HI) agar gedurende 16 uur in 37 °C. B)Daaropvolgende monstervoorbereiding voor AFM-IR, met inbegrip van het verzamelen van het monster gevolgd door het wassen van bacteriële pallets (3×) en monsterafzetting. (C) AFM-IR dataverzameling en -analyse: AFM hoogte en AFM-IR spectrum (1800–900 cm^-1). Grootte van het afm-afgebeelde gebied: 1,7 x 1,4 μm. Het AFM-IR spectrum werd verzameld vanuit het midden van de cel. De gegevens werden vervolgens geanalyseerd met behulp van chemometrische benaderingen, waaronder hiërarchische clusteranalyse. Dit cijfer is aangepast van K. Kochan et al.¹⁹. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: AFM- en AFM-IR-resultaten van onderzoek naar chemische veranderingen in vancomycine-intermediair S. aureus (VISA) in vergelijking met vancomycinegevoelige S. aureus (VSSA) in klinische paren. AFM-beelden van (A–B) VISA en (C) VSSA eencellige monsters. Grootte van de afgebeelde gebieden: (A, C) 40 x 40 μm, (B) 2,56 x 2,45 μm. (D-E) Gemiddelde AFM-IR spectra en hun (F-G) tweede afgeleiden voor: (D, F) VISA en (E, G) VSSA-cellen, in het spectrale bereik 1800-900 cm^-1. De gepresenteerde spectra zijn gemiddeld 81 (VISA) en 88 (VSSA) individuele spectra en worden samen met standaarddeviatie (SD) gepresenteerd. De middeling werd uitgevoerd na normalisatie van alle individuele spectra samen. De belangrijkste banden zijn gemarkeerd in (F-G). Dit cijfer is aangepast van K. Kochan et al.¹⁹. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Beelddrift over opeenvolgende registratie van AFM-IR-kaarten bij geselecteerde golfnummerwaarden voor de S. aureuscel.  (Bovenste rij): AFM-beelden werden gelijktijdig opgenomen met de overeenkomstige ( ondersterij) AFM-IR-kaarten op basis van de intensiteit van het IR-signaal bij geselecteerde golfnummerwaarden. De golfnummerwaarden (966, 1055, 1079, 1106, 1234, 1398, 1454, 1540, 1656, 1740 cm^-1) zijn geannoteerd boven de onderste rij. Elke set (AFM-afbeelding en AFM-IR-kaart) werd direct na de vorige afbeelding opgenomen (ongeveer 40 minuten per set). De grootte van het afgebeelde/in kaart gebrachte gebied: 1,54 x 1,57 μm. Tussen de beelden is een duidelijke afwijking zichtbaar. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Het nut van IR-spectroscopie voor de karakterisering van een breed scala aan biologische monsters in de context van hun chemische samenstelling is goed vastgesteld. In het afgelopen decennium is IR-spectroscopie naar voren gekomen als een veelbelovend hulpmiddel voor bacteriële studies^{12,13,14,15,16,17.} Het blijft aanzienlijke belangstelling trekken op het gebied van microbiologie, als een van de weinige technieken die een fenotypische karakterisering door de chemische samenstelling mogelijk maken. In deze context ligt het grootste nadeel van conventionele FTIR-microscopie in een beperkte ruimtelijke resolutie, waardoor eencellige en subcellulaire studies van bacteriën worden voorkomen. In feite vormt de kleine omvang van bacteriën een belemmering, niet alleen voor IR, maar voor de overgrote meerderheid van de technieken. De beschikbare onderzoeksinstrumenten voor eencellige en subcellulaire studies van bacteriën zijn dus aanzienlijk beperkt. De combinatie van AFM met IR maakt het mogelijk om de ruimtelijke resolutiebeperking van IR-spectroscopie te overwinnen, wat een nieuw hulpmiddel biedt voor bacterieel onderzoek, dat in staat is om op nanoschaal de chemische samenstelling te onderzoeken.

De techniek is niet beperkt tot eencellige studies en stelt men in staat om een verscheidenheid aan monsters te onderzoeken, variërend in dikte. Ongetwijfeld is een schone en zorgvuldige monstervoorbereiding van cruciaal belang voor het bereiken van afbeeldingen van hoge kwaliteit. Het protocol hierin biedt een methode om meerlaagse, monolaagse en /of eencellige monsters van verschillende bacteriën te bereiden(figuur 1). Het bereide monster is afhankelijk van verschillende factoren, waaronder de initiële bacteriële belasting, verdunning na het wassen en verdere verdunning op het substraat. De hoeveelheid monster die wordt verkregen na het verdunnen van de gewassen pellets en voorafgaand aan de afzetting op het substraat, maakt het meestal mogelijk om talrijke monsters te bereiden. Daarom is het, om de gewenste verdeling van het monster op het substraat te verkrijgen, vaak gunstig om een reeks monsters te bereiden, variërend in hun verdunning. Voor studies die gericht zijn op het verzamelen van AFM-IR-spectra in plaats van subcellulaire beeldvorming, kan het wijzigen van de hoeveelheid monster (bijvoorbeeld van monolaag naar meerlaags) gunstig zijn om de intensiteit van het signaal te verhogen.

Een ander cruciaal aspect bij de monstervoorbereiding is de juiste verwijdering van mediumresten. Afhankelijk van de geselecteerde kweekmethoden van het monster wordt het monster verzameld uit vloeibaar medium of uit een agarplaat. In beide gevallen is het mediumresidu waarschijnlijk aanwezig in het monster, zij het in veel mindere mate bij verzameling van agarplaten. Omdat bacteriële groeimedia een overvloed aan verschillende biologische componenten bevatten, is het van cruciaal belang om te zorgen voor een geschikte verwijdering van het medium. We raden drie wasbeurten met ultrapijn water aan voor agarplaatmonsters en ten minste vier wasbeurten voor monsters die zijn verzameld uit medium. Het aantal wasbeurten kan worden verhoogd, indien nodig; voor vergelijking tussen verschillende monsters is het echter belangrijk om het consistent te houden tussen monsters. Het gedemonstreerde protocol maakt gebruik van water, in plaats van oplosmiddelen zoals fosfaatbufferoplossing (PBS) of zoutoplossing. Zowel PBS als zoutoplossing leiden bij het drogen tot de vorming van kristallen, die de bacteriën kunnen beschadigen. Bovendien zijn beide een bron van intense IR-banden, waarbij PBS in het bijzonder meerdere banden in het vingerafdrukgebied bevat. Het gebrek aan vermogen voor het gebruik van zoutoplossing of PBS, vormt momenteel een belangrijke beperking voor de techniek. Meestal veroorzaakt het gebruik van water voor het wassen geen destructieve invloed op de bacteriën; er moet echter voorzichtig worden omgegaan en indien mogelijk moet de tijd van blootstelling aan water worden beperkt. Als het monstervoorbereidingsprotocol in het stadium van het wassen moet worden gepauzeerd, wordt aanbevolen om het monster in gepelletiseerde vorm te laten na het verwijderen van het water. Dit is met name van belang voor Gram-negatieve bacteriën, die een dunnere celwand bevatten omdat ze gevoeliger zijn voor scheuren.

Om te zorgen voor goede en hoogwaardige AFM-IR-gegevens zijn verschillende aspecten in het protocol voor gegevensverzameling van cruciaal belang. Ten eerste is het correct verzamelen van achtergrondinformatie essentieel voor data-acquisitie. In het bijzonder is het noodzakelijk om stabiele vochtigheidsniveaus te handhaven tijdens de achtergrondverzameling en tussen achtergrond- en monsterverzameling. Om dit te garanderen, raden we aan om het instrument te zuiveren met stikstof en de luchtvochtigheid niet hoger dan 25% te houden. Gebrek aan zuivering kan een aanzienlijke beperking opleggen, vooral op plaatsen met een hoge luchtvochtigheid. Ten tweede moet het belang van een goede optimalisatie van IR-spots worden benadrukt. Voor het beste resultaat kan a priori kennis over de positie van bandmaxima gunstig zijn. Een conventioneel IR-spectrum van bacteriële pellet kan bijvoorbeeld worden gebruikt om posities van banden te bepalen die van een monster worden verwacht. Als dat niet mogelijk is om te verkrijgen, kan de gebruiker als alternatieve benadering IR-spectra gebruiken die beschikbaar zijn in de literatuur of beginnen met de optimalisatie met behulp van een bandpositie die redelijk is om te verwachten in de bacterie (bijv. amide I en amide II). Ten derde is het voor het verzamelen van gegevens belangrijk om het belang van zorgvuldige vermogensselectie te benadrukken (waardoor een goede S / N-verhouding kan worden bereikt), omdat dit een destructief effect kan hebben. Het geadviseerde vermogen is afhankelijk van de dikte van het monster, met ruwe begeleiding beschikbaar in de instrumenthandleiding³¹. We raden aan om de toestand van het monster na de meting empirisch te testen door een AFM-afbeelding te verzamelen, omdat dit elke destructieve invloed zal onthullen. Verder dient het verzamelen van AFM-beelden uit hetzelfde gebied voor en na het verzamelen van AFM-IR spectra als een goede bevestiging dat er geen drift is opgetreden en de spectra inderdaad afkomstig zijn van het geselecteerde punt in de cel. De mogelijkheid van drift is vooral belangrijk bij het toepassen van de beeldvormingsmodaliteit, door middel van opeenvolgende beeldvorming van IR-intensiteit bij geselecteerde golfnummerwaarden. Een voorbeeld hiervan wordt geïllustreerd in figuur 5. Het afgebeelde gebied is aan het begin van het experiment gedefinieerd en is bedoeld om consistent te zijn voor alle golfnummerwaarden. Er is echter een duidelijke afwijking zichtbaar tussen elk AFM-hoogtebeeld (en de bijbehorende IR-golfnummerintensiteit), met een acquisitietijd van elke kaart van ongeveer 40 minuten. Daarom raden we gebruikers die beeldgegevens verzamelen aan om altijd een gebied te selecteren dat iets groter is dan het gewenste voorbeeld, om ervoor te zorgen dat zelfs bij het bestaan van drift het interessante monster binnen het afgebeelde gebied blijft.

De mogelijke beperkingen van het protocol omvatten het gebrek aan vermogen om gegevens in een gehydrateerde toestand te verzamelen in fysiologische oplossingen (bijv. Zoutoplossing of PBS) die hierboven zijn beschreven. Bovendien is er, vooral in gebieden met een hoge luchtvochtigheid, vaak behoefte aan stikstofzuivering. Bovendien maakt het protocol het mogelijk om organismen tot 100 nm groot te onderzoeken, met uitzondering van de mogelijkheid om het te gebruiken voor kleinere structuren. Hoewel dit kan worden ondervangen met behulp van een andere laser (bijvoorbeeld kwantumcascadelaser die de ruimtelijke resolutie van 20 nm kan bereiken), wordt het ook geassocieerd met een beperkt spectraal bereik en moeilijkheden bij het verkrijgen van een goede signaal-ruisverhouding. Ten slotte kan het tasten van zachte oppervlakken een uitdaging vormen waarbij de punt het oppervlak niet goed detecteert en voorbij het contactpunt gaat, totdat het breekt. Hoewel dit meestal geen probleem is met bacteriële monsters, kan het optreden bij metingen van zachtere monsters. In dergelijke gevallen wordt aanbevolen om te proberen deel te nemen aan een schoon oppervlak van het substraat in de nabijheid van het monster.

Het beschreven protocol kan worden gebruikt voor tal van soorten bacterieel onderzoek, waaronder vergelijkende studies tussen verschillende monsters en subcellulair onderzoek. De gegevens kunnen worden geanalyseerd met behulp van chemometrische benaderingen voor enkelvoudige spectra en beeldvormingsmodaliteiten³⁵, afhankelijk van het doel van het onderzoek. Bovendien kan het protocol ook worden aangepast voor toepassing op ander biologisch materiaal (zoals schimmels, gist, cellen, enz.), Door toevoeging van fixatie.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
AFM metal specimen disc	PST ProSciTech Pty Ltd	GA530-15	Aanbevolen 15 mm
Anasys AFM-IR nanoIR2	Anaysys Instruments		model: nanoIR2
Contact mode NIR2 Probes for nanoIR 2	Bruker / Anasys Instruments	-	Model: Model: PR-EX-NIR2
Heraeus Pico 17 Microcentrifuge	Thermo Scientific	-	-
Matlab	Mathworks Inc	-	Multivariate data-analysesoftware
Micro-centrifuge tubes, 1.5 mL	Heathrow Scientific	HEA4323	Kan worden vervangen door elke andere microcentrifugebuis
NanoIR 2 instrument	Bruker / Anasys Instruments	-	-
PLS toolbox	Mathworks Inc	-	GUI voor Matlab
Geselecteerd bacterieel medium (bijv. HBA Columbia Plates)	Thermo Fisher	PP2001	Aangegeven type medium is een voorbeeld en kan worden vervangen door andere, afhankelijk van het type experiment
Geselecteerde bacteriestam	-	-	De bron hangt af van het doel van het onderzoek (patiëntisolaten, ATCC-stammen, enz.)
Substraat (bijv. Raman grade CaF2)	Crystran	CAFP13-2R	Aanbevolen grootte: 13 mm Ø x 2,0 mm
Tip pipette 1000 µl	Axygen	T-1000-B	-
Tip pipette 200 µl	Axygen	T-200-C	-
Tip pipette 0,5-10 µl	Axygen	T-300-R	-
Ultrazuiver water	-	-	-