Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Een minimaal invasieve methode voor intratracheale instillatie van geneesmiddelen bij neonatale knaagdieren om longziekte te behandelen

6.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/61729

⸱

4 augustus 2021

 ,  , 
1Department of Pediatrics, Case Western Reserve University

In dit artikel

Samenvatting

Deze techniek om geneesmiddelen rechtstreeks in de luchtpijp van neonatale knaagdieren in te brengen, is belangrijk bij het bestuderen van de impact van lokaal toegediende geneesmiddelen of biologicals op neonatale longziekten. Bovendien kan deze methode ook worden gebruikt voor het induceren van longletsel in diermodellen.

Samenvatting

Behandeling van neonatale knaagdieren met geneesmiddelen die rechtstreeks in de luchtpijp zijn ingebracht, kan dienen als een waardevol hulpmiddel om de impact van een lokaal toegediend medicijn te bestuderen. Dit heeft een directe translationele impact omdat oppervlakteactieve stoffen en geneesmiddelen lokaal in de longen worden toegediend. Hoewel de literatuur veel publicaties bevat die minimaal invasieve transorale intubatie van volwassen muizen en ratten in therapeutische experimenten beschrijven, ontbreekt deze benadering bij neonatale rattenjongen. De kleine omvang van orotracheale regio / keelholte in de pups maakt visualisatie van larynx lumen (stembanden) moeilijk, wat bijdraagt aan het variabele slagingspercentage van intratracheale medicijnafgifte. We tonen hierbij effectieve orale intubatie van neonatale rattenjong - een techniek die niet-traumatisch en minimaal invasief is, zodat deze kan worden gebruikt voor seriële toediening van geneesmiddelen. We gebruikten een werkende otoscoop met een verlichtingssysteem en een vergrootglas om de tracheale opening van de ratten neonaten te visualiseren. Het medicijn wordt vervolgens ingebracht met behulp van een spuit van 1 ml die is aangesloten op een pipetpunt. De nauwkeurigheid van de toedieningsmethode werd aangetoond met behulp van Evans blue dye-toediening. Deze methode is gemakkelijk te trainen en kan dienen als een effectieve manier om medicijnen in de luchtpijp te brengen. Deze methode kan ook worden gebruikt voor toediening van entmateriaal of agentia om ziekteomstandigheden bij dieren te simuleren en ook voor celgebaseerde behandelingsstrategieën voor verschillende longziekten.

Inleiding

Pasgeborenen die te vroeg zijn geboren, hebben slecht ontwikkelde longen die veel interventionele therapieën vereisen, zoals langdurige beademing. Deze ingrepen plaatsen de overlevende pasgeborenen op een hoog risico op latere gevolgen1. Experimentele diermodellen dienen als een belangrijk hulpmiddel bij het simuleren van verschillende ziekteomstandigheden, het bestuderen van de pathobiologie van ziekten en het evalueren van therapeutische interventies. Hoewel er een breed scala aan diermodellen beschikbaar is, van muizen, ratten en konijnen tot premature lammeren en varkens, worden muizen en ratten het meest gebruikt.

Het belangrijkste voordeel van het gebruik van muizen en ratten zijn de relatief korte draagtijd en lagere kosten. Ze zijn ook gemakkelijk verkrijgbaar, gemakkelijk te onderhouden in ziektevrije omgevingen, genetisch homogeen en hebben relatief minder ethische zorg 2,3. Een ander groot voordeel van het knaagdiermodel is dat de neonatale pup zich bij de geboorte in een laat gonaal / vroeg sacculair stadium van longontwikkeling bevindt, wat morfologisch equivalent is aan de long van een 24 weken te vroeg geboren neonatale menselijke zuigeling die bronchopulmonale dysplasieontwikkelt 4. Bovendien, naarmate hun longontwikkeling snel vordert tot voltooiing binnen de eerste 4 weken van het leven, is het mogelijk om de postnatale longrijping binnen een redelijk tijdsbestek tebestuderen 4. Ondanks deze voordelen is de kleine omvang van de muizen en rattenpups een bron van zorg voor verschillende interventies, die de meeste onderzoekers dwingt om volwassen dieren te gebruiken in plaats van pups5. Neonatale longen bevinden zich in een ontwikkelingsstadium en de reactie van een pasgeborene op een opruiend middel verschilt van die van een volwassene. Dit maakt het geschikt om neonatale diermodellen te gebruiken om de aandoeningen van menselijke neonatale aandoeningen te bestuderen.

Er zijn verschillende methoden om medicijnen / biologische agentia aan de longen toe te dienen. Dit omvat intranasale 6,7 of intratracheale 8,9,10 instillatie en aerosolinhalatie11,12. Elke aanpak heeft zijn eigen technische uitdagingen, voordelen en beperkingen13. Intratracheale toedieningsweg van therapeutische middelen heeft de voorkeur om de directe therapeutische impact in het orgaan te bestuderen die de systemische effecten omzeilt. Deze route kan ook worden gebruikt om longpathologie te bestuderen die wordt veroorzaakt door opruiende middelen. Er zijn zowel invasieve als minimaal invasieve technieken om dit te doen en is gemakkelijk uit te voeren bij volwassenen. Bij pups zijn er echter, vanwege de kleine omvang van het dier, technische uitdagingen verbonden aan het intubatieproces. De huidige studie presenteert een eenvoudige, consistente, niet-chirurgische intratracheale instillatie (ITI) -methode bij rattenjongen die kan worden gebruikt om de werkzaamheid van verschillende neonatale therapeutische interventies te bestuderen en om diermodellen te genereren die neonatale ademhalingsziekten simuleren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle experimenten werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (protocol # 2020-0035) aan de Case Western Reserve University. Alle dieren werden behandeld in overeenstemming met de NIH-richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van proefdieren.

1. Dieren

  1. Commercieel verkrijgen zwangere Sprague Dawley ratten.
  2. Houd dieren in een erkende veterinaire faciliteit met een licht-donkercyclus van 14 uur /10 uur en een relatieve vochtigheid van 45-60%.

2. Bereiding van de teststof

  1. Gebruik Evans blauwe kleurstof als teststof om de werkzaamheid van de intratracheale instillatieprocedure te beoordelen.
  2. Bereid een 0,25% (w/v) oplossing van de kleurstof in fosfaat-gebufferde zoutoplossing (pH 7,2) en filter steriliseren met behulp van een 0,45 μm spuitfilter.

3. Toediening van anesthesie

  1. Verdoving rattenjongen met behulp van gasanesthesie (3% isofluraan in 100% zuurstof), met behulp van een aangepast toedieningssysteem dat is aangepast voor pasgeborenen van kleine ratten.
  2. Controleer op het verlies van staart- en pedaalreflexen en oppervlakkige ademhaling om de juiste diepte van anesthesie te garanderen voor het uitvoeren van de procedure.

4. Intratracheale instillatie (ITI)

  1. Gebruik rattenjongen op postnatale dag 5 (PN 5) voor de ITI. Het gemiddelde gewicht van een PN 5 rattenjong is 12 gram.
  2. Houd de verdoofde rattenpup vast op een hellend plat platform met behulp van laboratoriumlabeltape. De pup wordt in rugligging onder een hoek van ongeveer 45° in bedwang gehouden.
  3. Open de mond van de pasgeborene en trek de tong voorzichtig naar één kant met een stompe tang.
  4. Gebruik een klein otoscoopspeculum met een diameter van 2 mm verbonden met de otoscoop om de tong zachtjes vast te houden en voor een goede visualisatie van het strottenhoofd.
  5. Gebruik het keelverlichtingssysteem, d.w.z. de werkende otoscoop en de vergrootglas voor een goede visualisatie van stembanden (figuur 1).
  6. Plaats de dieren onder een hoek van 45° in een hellend vlak. De bedrade staafdeksels van muizenkooien worden gebruikt (figuur 2).
    OPMERKING: Het plaatsen van het dier onder een hoek van 45° zorgt voor een betere visualisatie van de tracheale opening zonder de interferentie van de epiglottis.
  7. Neem een pipetpunt met een lange hoek die wordt gebruikt voor het laden van western blot-gels. Snijd de basis van de pipetpunt met een chirurgisch mes zodat deze goed in de punt van de 1 cc spuit past.
  8. Gebruik de steriele spuit van 1 ml die in een pipetpunt met lange hoek is geplaatst om 30-50 μL van de stof in de longen af te geven. Keer de spuit om en zuig bijna 0,9 cc lucht op in de spuit van 1 ml die is aangesloten op de pipetpunt, gevolgd door de kleurstof of de af te leveren stof. Hierdoor kan de lucht achter de kleurstof in de luchtpijp worden geduwd nadat de kleurstof is toegediend, zoals weergegeven in figuur 3. De intratracheale toediening wordt bereikt door het larynxlumen (stembanden) te visualiseren en de pipetpunt die op een spuit is gemonteerd in het tracheale lumen in te brengen.
  9. Gebruik het speculum van de otoscoop om de tong vast te houden en de stembanden bloot te leggen. Speculum dient de rol van het blad van een laryngoscoop. Buig de pipetpunt onder een hoek van 30° om het middel gemakkelijk door het kegelvormige speculum in de tracheale opening te brengen.
  10. Breng de pipetpunt in de tracheale opening tot ongeveer 2 mm voorbij de stembanden. Duw de zuiger van de spuit om de kleurstof of het geneesmiddel door het speculum van de operatieotoscoop toe te dienen, zoals weergegeven in figuur 3. De introductie van lucht in de longen kort na de toediening van het middel voorkomt dat de stof terugkomt naar de larynxholte.
  11. Nadat u de pup de kleurstof of normale zoutoplossing hebt toegediend, plaatst u de pups op een geïntegreerd verwarmingskussen voor circulerende vloeistof (38 °C) totdat hun ademhalingsbewegingen regelmatig zijn. Na volledig herstel van de anesthesie, herenig de pups met de moeder.

5. Karakterisering van ITI-levering

  1. Euthanaseer na ITI de rattenjongen door overmatige anesthesie te geven (Ketamine 100 mg / kg en Xylazine 10 mg / kg) / thiopenton gevolgd door exsanguinatie op een geschikt moment na toediening. Euthanasie werd uitgevoerd als onderdeel van het experiment om longweefsel te verzamelen om de werkzaamheid aan te tonen.
  2. Zet de geëuthanaseerde rattenjong vast op een dissectieplank en veeg de borst en buik af met 70% ethylalcohol.
  3. Voor het evalueren van de verdeling van de kleurstof door de longen, verwijdert u de longen van het dier met behulp van steriele techniek en toont u de longen waar nodig voor beeldvorming (figuur 4A, B).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De instillatie van Evans blauw onthulde multifocale verdeling van de kleurstof waarbij alle longlobben betrokken waren (figuur 4A,B). Ons resultaat zoals weergegeven in figuur 4 toont de werkzaamheid van distributie naar alle lobben. De foto is genomen direct na ITI van de kleurstof in de luchtpijp. 100% werkzaamheid werd bereikt bij het inbrengen van de kleurstof in de luchtpijp, gevolgd door de verspreiding ervan in alle lobben aan beide zijde...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Intratracheale instillatie is een uitstekende methode die verschillende voordelen biedt ten opzichte van de bestaande methoden voor respiratoire ziekte-interventies en de ontwikkeling van ziektemodellen. Het is een snelle methode en kan met ervaring worden uitgevoerd met een gemiddelde snelheid van 2-3 minuten per dier. De belangrijkste overwegingen voor een succesvolle intubatie zijn een goede sedatie van het dier, de juiste positionering, vooral het hoofd, evenals een nauwkeurige diepte van plaatsing / grootte van de s...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door R01HD090887-01A1 van NICHD naar AH. De auteurs erkennen ook de faciliteiten die het laboratorium van Dr. Peter Mc Farlane biedt, zoals inhalatie-anesthesie / verwarmingskussensysteem. De waardevolle hulp van mevrouw Catherine Mayer bij het opzetten van het systeem wordt op prijs gesteld. De financierende instantie heeft geen rol gespeeld bij de opzet van de studie, verzameling, analyse en interpretatie van gegevens of bij het schrijven van het manuscript.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Evans Blue kleurstofSigma-Aldrich, St Louis, MO, VS314-13-6Bevestiging van medicijntoediening in longen
Ketamine HydrochlorideHospira. Inc, Lake Forest, IL, VSUitgedeeld door DierenzorgVoor sedatie
Operatieve OtoscoopWelch Allyn, Hillrom, Chicago, IL, VS21770- 3.5VVoor visualisatie van stembanden
Oplaadbare otoscoopgreepWelch Allyn, Hillrom, Chicago, IL, VS71050-C
Pipettip (Gel laden)Fisherbrand02-707-139Toediening van het medicijn
Platform voor fixatie (schuine vlak)DierenzorgUitgedeeld door DierenzorgHet bedraad dak van muizenkooi kan worden gebruikt
3M Micropore chirurgisch wit papier (hechttape)3M, St. Paul, MN, VS1530-2
Luer Lock SpuitSpuiten (1 ml)BD Franklin Lakes, NJ, VSNBD2515Toediening van het medicijn
XylacineHospira. Inc, Lake Forest, IL, VSVoor sedatie

Referenties

  1. Prakash, Y. S. Pulmonary Cell Biology Lab: Neonatal Lung Disease. Mayo Clinic. , Available from: https://www.mayo.edu/research/labs/pulmonary-cell-biology/projects/neonatal=lung-disease (2020).
  2. Martínez-Burnes, J., López, A., Lemke, K., Dobbin, G. Transoral intratracheal inoculation method for use with neonatal rats. Comparative Medicine. 51 (2), 134-137 (2001).
  3. Pinkerton, K. E., Crapo, J. D. Morphometry of the alveolar region of the lung. Toxicology of Inhaled Materials Handbook of Experimental Pharmacology. Witschi, H., Brain, J. D. 95, Springer, Berlin. 259-285 (1985).
  4. Nardiello, C., Mižíková, I., Morty, R. E. Looking ahead: where to next for animal models of bronchopulmonary dysplasia. Cell and Tissue Research. 367 (3), 457-468 (2017).
  5. Sugimoto, M., Ando, M., Senba, H., Tokuomi, H. Lung defenses in neonates: Effects of bronchial lavage fluids from adult and neonatal rabbits on superoxide production by their alveolar macrophages. Journal of the Reticuloendothelial Society. 27 (6), 595-606 (1980).
  6. Grayson, M. H., et al. Controls for lung dendritic cell maturation and migration during respiratory viral infection. Journal of Immunology. 179 (3), Baltimore, Md. 1438-1448 (2007).
  7. Moreira, A., et al. Intranasal delivery of human umbilical cord Wharton's jelly mesenchymal stromal cells restores lung alveolarization and vascularization in experimental bronchopulmonary dysplasia. Stem Cells Translational Medicine. 9 (2), 221-234 (2020).
  8. Bar-Haim, E., et al. Interrelationship between dendritic cell trafficking and Francisella tularensis dissemination following airway infection. PLoS Pathogens. 4 (11), 1000211(2008).
  9. Linderholm, A. L., Franzi, L. M., Bein, K. J., Pinkerton, K. E., Last, J. A. A quantitative comparison of intranasal and intratracheal administration of coarse PM in the mouse. Integrative Pharmacology, Toxicology and Genotoxicology. 1 (1), 5-10 (2015).
  10. Guerra, K., et al. Intra-tracheal administration of a naked plasmid expressing stromal derived factor-1 improves lung structure in rodents with experimental bronchopulmonary dysplasia. Respiratory Research. 20 (1), 255(2019).
  11. Thomas, R., et al. Influence of particle size on the pathology and efficacy of vaccination in a murine model of inhalational anthrax. Journal of Medical Microbiology. 59, Pt 12 1415-1427 (2010).
  12. Sakurai, R., et al. A combination of the aerosolized PPAR-γ agonist pioglitazone and a synthetic surfactant protein B peptide mimic prevents hyperoxia-induced neonatal lung injury in rats. Neonatology. 113 (4), 296-304 (2018).
  13. Rayamajhi, M., et al. Non-surgical intratracheal instillation of mice with analysis of lungs and lung draining lymph nodes by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (51), e2702(2011).
  14. Brain, J. D., Knudson, D. E., Sorokin, S. P., Davis, M. A. Pulmonary distribution of particles given by intratracheal instillation or by aerosol inhalation. Environmental Research. 11 (1), 13-33 (1976).
  15. Pritchard, J. N., et al. The distribution of dust in the rat lung following administration by inhalation and by single intratracheal instillation. Environmental Research. 36 (2), 268-297 (1985).
  16. Ruzinski, J. T., Skerrett, S. J., Chi, E. Y., Martin, T. R. Deposition of particles in the lungs of infant and adult rats after direct intratracheal administration. Laboratory Animal Science. 45 (2), 205-210 (1995).
  17. Sun, B., Curstedt, T., Song, G. W., Robertson, B. Surfactant improves lung function and morphology in newborn rabbits with meconium aspiration. Biology of the Neonate. 63 (2), 96-104 (1993).
  18. Nicholson, J. W., Kinkead, E. R. A simple device for intratracheal injections in rats. Laboratory Animal Science. 32 (5), 509-510 (1982).
  19. Carlon, M., et al. Efficient gene transfer into the mouse lung by fetal intratracheal injection of rAAV2/6.2. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 18 (12), 2130-2138 (2010).
  20. Chen, C. -M., Chen, Y. -J., Huang, Z. -H. Intratracheal Instillation of Stem Cells in Term Neonatal Rats. Journal of Visualized Experiments. (159), e61117(2020).
  21. Reynolds, R. D. Preventing maternal cannibalism in rats. Science. 213 (4512), New York, N.Y. 1146(1981).
  22. Park, C. M., Clegg, K. E., Harvey-Clark, C. J., Hollenberg, M. J. Improved techniques for successful neonatal rat surgery. Laboratory Animal Science. 42 (5), 508-513 (1992).
  23. Cleary, G. M., et al. Exudative lung injury is associated with decreased levels of surfactant proteins in a rat model of meconium aspiration. Pediatrics. 100 (6), 998-1003 (1997).
  24. Das, S., MacDonald, K., Chang, H. -Y. S., Mitzner, W. A simple method of mouse lung intubation. Journal of Visualized Experiments. (73), e50318(2013).
  25. Oka, Y., et al. A reliable method for intratracheal instillation of materials to the entire lung in rats. Journal of Toxicologic Pathology. 19 (2), 107-109 (2006).
  26. Watanabe, A., Hashimoto, Y., Ochiai, E., Sato, A., Kamei, K. A simple method for confirming correct endotracheal intubation in mice. Laboratory Animals. 43 (4), 399-401 (2009).
  27. Kim, J. -S., et al. An automatic video instillator for intratracheal instillation in the rat. Laboratory Animals. 44 (1), 20-24 (2010).
  28. Lawrenz, M. B., Fodah, R. A., Gutierrez, M. G., Warawa, J. Intubation-mediated intratracheal (IMIT) instillation: a noninvasive, lung-specific delivery system. Journal of Visualized Experiments. (93), e52261(2014).
  29. Ordodi, V. L., Mic, F. A., Mic, A. A., Sandesc, D., Paunescu, V. A simple device for intubation of rats. Lab Animal. 34 (8), 37-39 (2005).
  30. Cleary, G. M., Wiswell, T. E. Meconium-stained amniotic fluid and the meconium aspiration syndrome. An update. Pediatric Clinics of North America. 45 (3), 511-529 (1998).
  31. Vandivort, T. C., An, D., Parks, W. C. An improved method for rapid intubation of the trachea in mice. Journal of Visualized Experiments. (108), e53771(2016).
  32. Litvin, D. G., Dick, T. E., Smith, C. B., Jacono, F. J. Lung-injury depresses glutamatergic synaptic transmission in the nucleus tractus solitarii via discrete age-dependent mechanisms in neonatal rats. Brain, Behavior, and Immunity. 70, 398-422 (2018).
  33. Spoelstra, E. N., et al. A novel and simple method for endotracheal intubation of mice. Laboratory Animals. 41 (1), 128-135 (2007).
  34. Kim, Y. E., et al. Intratracheal transplantation of mesenchymal stem cells simultaneously attenuates both lung and brain injuries in hyperoxic newborn rats. Pediatric Research. 80 (3), 415-424 (2016).
  35. Chang, Y. S., et al. Intratracheal transplantation of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells dose-dependently attenuate hyperoxia-induced lung injury in neonatal rats. Cell Transplantation. 20 (11-12), 1843-1854 (2011).
  36. Chang, Y. S., et al. Timing of umbilical cord blood derived mesenchymal stem cells transplantation determines therapeutic efficacy in the neonatal hyperoxic lung injury. PloS One. 8 (1), 52419(2013).
  37. Mowat, V., Alexander, D. J., Pilling, A. M. A comparison of rodent and nonrodent laryngeal and tracheal bifurcation sensitivities in inhalation toxicity studies and their relevance for human exposure. Toxicologic Pathology. 45 (1), 216-222 (2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Gebruik van otoscoopdirecte visualisatieEvans Blue-kleurstofdistributie in longweefseltoediening van geneesmiddelenintratracheale toedieningvisualisatie van de stembandenpasgeboren ratten
Een minimaal invasieve methode voor intratracheale instillatie van geneesmiddelen bij neonatale knaagdieren om longziekte te behandelen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.