Method Article

Cryogene monster laden in een magische hoek spinnen nucleaire magnetische resonantie spectrometer die cellulaire levensvatbaarheid behoudt

DOI:

10.3791/61733

⸱

September 1st, 2020

 ,  ,  , 
1Department of Biophysics, University of Texas Southwestern Medical Center, 2Center for Alzheimer's and Neurodegenerative Disease and Center for Systems Biology, University of Texas Southwestern Medical Center

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor cryogene overdracht van bevroren monsters in de dynamische nucleaire polarisatie (DNP) magic angle spinning (MAS) nucleaire magnetische resonantie (NMR) sonde. Het protocol bevat aanwijzingen voor rotoropslag voorafgaand aan het experiment en aanwijzingen voor levensvatbaarheidsmetingen voor en na het experiment.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dynamische nucleaire polarisatie (DNP) kan de gevoeligheid van magic angle spinning (MAS) nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopie drastisch verhogen. Deze gevoeligheidswinsten nemen toe naarmate de temperaturen dalen en zijn groot genoeg om de studie van moleculen bij zeer lage concentraties bij de bedrijfstemperaturen (~ 100 K) van de meeste commerciële met DNP uitgeruste NMR-spectrometers mogelijk te maken. Dit leidt tot de mogelijkheid van in-cell structurele biologie op cryopreserved cellen voor macromoleculen op hun endogene niveaus in hun inheemse omgevingen. De vriessnelheden die nodig zijn voor cellulaire cryopreservatie worden echter overschreden tijdens typische monsterbehandeling voor DNP MAS NMR en dit resulteert in verlies van cellulaire integriteit en levensvatbaarheid. Dit artikel beschrijft een gedetailleerd protocol voor de bereiding en cryogene overdracht van een bevroren monster van zoogdiercellen in een MAS NMR-spectrometer.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De introductie van dynamische nucleaire polarisatie voor magische hoek spinnen nucleaire magnetische resonantie spectroscopie kan de gevoeligheid van MAS NMR verhogen met verschillende ordes van grootte. Dit heeft de detectie van biomoleculen in of nabij hun fysiologische concentraties mogelijk gemaakt. DNP kan en biedt de gevoeligheid die nodig is om een isotopisch gelabeld eiwit te detecteren bij endogene (~1 μM) concentraties in complexe biologische omgeving1. Omdat er gevestigde protocollen zijn om isotopisch gelabelde moleculen in niet-gelabelde zoogdiercellen te introduceren zonder hun levensvatbaarheid te beïnvloeden, opent dit de mogelijkheid om isotopisch verrijkte biomoleculen op hun endogene niveaus in hun inheemse omgeving te bestuderen. Bovendien, omdat DNP-verbeteringen efficiënter zijn bij lagere temperaturen2,3,4, komen de experimentele temperaturen voor DNP MAS NMR netjes overeen met die welke nodig zijn voor langdurige opslag van levensvatbare zoogdiercellen5. De conventionele methode om een monster over te brengen in een DNP MAS NMR-spectrometer onderwerpt het echter aan temperatuurschommelingen die zoogdiercellen scheuren.

Mas NMR-experimenten vereisen dat het monster wordt geroteerd rond de magische hoek bij frequenties gelijk aan of groter dan de omvang van de anisotrope interactie om het gemiddeld tot nul te laten worden, meestal ten minste 4 kHz en vaak veel hoger6,7,8,9. Monsters worden daarom verpakt in rotoren met een vinpunt die wordt gebruikt om de rotatie van de rotor door een gasstroom aan te drijven en aan de andere kant een markering hebben, zodat de rotatiefrequentie kan worden bewaakt door een toerenteller. Monsteroverdracht voor de meeste MAS NMR-instrumenten wordt bereikt door de rotor van de buitenkant van het instrument in de stator aan het einde van de NMR-sonde te injecteren met een stroom droge lucht of stikstofgas. Nadat de rotor de stator heeft bereikt, die de rotor in de magische hoek houdt, wordt de monsterrotatie aangedreven door een luchtturbinemechanisme. Afzonderlijke stromen van gas ondersteunen, stuwen en regelen de temperatuur van de rotor. Het plaatsen van een rotor in de NMR-spectrometer en het bereiken van stabiele MAS-spins vereist fijn bewerkte aandrijfpunten en een strakke controle van de temperatuur en druk van de afzonderlijke gasstromen. Ondanks deze technische eisen zijn het inbrengen en bereiken van stabiele MAS grotendeels geautomatiseerd voor commerciële MAS NMR-sondes voor kamertemperatuurtoepassingen.

De situatie is echter ingewikkelder voor toepassingen met lage temperaturen. Monsters voor toepassingen met lage temperaturen worden meestal bij kamertemperatuur in de spectrometer gestoken en in de stator ingevroren. In de eerste minuut daalt de monstertemperatuur snel (> −100 °C/min) en de systeemtemperatuur duurt enkele minuten om te equilibreren. Door het samenspel van temperatuur en druk wordt het inbrengen en naderen van de gewenste MAS vaak handmatig behandeld voor toepassingen met lage temperaturen. Ondanks de vereiste handmatige interventie, is het bevriezen van de rotor in het instrument gunstig omdat het de introductie van water en condensatie in de sonde minimaliseert, wat van cruciaal belang is voor succesvol spinnen. Condensatie en ijsvorming door omgevingsvocht blokkeren niet alleen gasleidingen, condensatie of vorst op de rotor zelf kunnen MAS mechanisch voorkomen. Monsters voor MAS NMR bij lage temperatuur worden dus meestal in het instrument ingevroren met een temperatuur van meer dan -100 °C/min.

Zoogdiercellen kunnen hun integriteit behouden door middel van een vries-dooicyclus als de koeling traag is5,10,11,12, met een snelheid gelijk aan of langzamer dan 1 °C/min. Als alternatief behouden cellen ook hun integriteit als de koelsnelheid ultrasnel is13,14,15, met een snelheid die sneller is dan 104 °C/min. Tarieven tussen deze twee uitersten scheuren en doden zoogdiercellen als gevolg van ijskristalvorming zowel binnen als buiten de cellen, zelfs in aanwezigheid van cryoprotectieve middelen16. De monsterkoelingssnelheden voor een kamertemperatuurrotor in een voorgekoelde sonde vallen tussen deze twee uitersten, dus om cryogeen intacte intacte levensvatbare zoogdiercellen te bestuderen, moeten monsters worden ingevroren voordat ze in het instrument worden overgebracht en in het instrument worden overgebracht zonder temperatuurschommelingen die het monster of de ophoping van vorst op de rotor kunnen beschadigen die kan voorkomen dat de rotor draait. Het protocol beschrijft een methode voor vorstvrije, voorgekoelde rotorinvoeging in een cryogene MAS NMR-systeem voor de studie van cryogeen geconserveerde intacte levensvatbare zoogdiercelmonsters. De hier beschreven cryogene monsteroverdracht is ontwikkeld voor NMR-karakterisering van levensvatbare intacte cellen. Het is echter van toepassing op elk systeem waarbij temperatuurschommelingen de integriteit van de monsters in gevaar kunnen brengen. Dit omvat elke verscheidenheid aan complexe systemen, zoals vriesgevriesde reacties voor chemische en structurele karakterisering van gevangen reactietussenproducten17,18, enzymologie19,20 of eiwitvouwen21,22.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Cultuur en cryoprotectie van zoogdiercellen

  1. Kweek en oogsten van zoogdiercellen
    1. Ontdooi een aliquot bevroren menselijke embryonale niercellen (HEK 293).
    2. Kweek HEK 293 cellen in groeimedia (bijv. DMEM met 10% foetale runderserum en 1% Pen-Strep) bij 37 °C met 5% CO2 in 100 mm platen gedurende twee tot drie passages (7-10 dagen).
    3. Splits de cellen en cultuur in een plaat van 150 mm totdat de cellen 90-95% samenvloeiing bereiken.
      OPMERKING: Een plaat van 150 mm bij > 90% samenvloeiing volstaat om twee saffierrotors met een diameter van 3,2 mm te vullen.
    4. Oogst cellen met 4 ml trypsine (zie tabel met materialen)en 10 ml media. Breng de suspensie gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur over op een steriele conische 15 ml en centrifugeer bij 673 x g (1000 tpm). Verwijder het supernatant.
    5. Was de celkorrel met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) (pH 7,4, −CaCl2, −MgCl2).
  2. Cryoprotectie van cellen
    1. Verzamel een celkorrel van 50 μL in een microcentrifugebuis. Bereid een mengsel van 50 μL PBS en 18 μL glycerol in een aparte buis.
    2. Meng de 50 μL celkorrel voorzichtig met 68 μL glycerol-PBS mengsel door het glycerol-PBS mengsel aan de bovenkant van de pellet toe te voegen en de pellet opnieuw te gebruiken door zachtjes op de zijkant van de buis te tikken totdat er geen klontjes overblijven.
      OPMERKING: Zachte pipetten kunnen ook worden gebruikt om de cel te resuspenderen, maar zorg ervoor dat de cellulaire integriteit niet in het gedrang komt.

2. Cryopreservatie van zoogdiercellen in een NMR-rotor

  1. Overdracht van cellen in een saffierrotor van 3,2 mm.
    1. Om een trechter te maken, snijdt u een pipetpunt van 200 μL en steekt u het smalle uiteinde van de gesneden pipetpunt in de 3,2 mm rotor.
    2. Breng de cellen over in de trechter die op de rotor zit. Plaats de rotor samen met de trechter in een microcentrifugebuis en pellet de cellen in de bodem van de rotor door centrifugeren op 673 x g gedurende 2-3 minuten bij kamertemperatuur.
    3. Verwijder het supernatant en eventueel overtollig monster uit de rotor. Herhaal deze twee stappen totdat de rotor volledig vol zit met de cellen.
      OPMERKING: Bepaal eventueel de cellulaire levensvatbaarheid van het monster voordat het wordt bevriest. Resuspend 10 μL van de overtollige celkorrel in 100 μL FBS-vrije DMEM. Meng 10 μL van de suspensie met 0,4% trypan blauwe oplossing en beoordeel onmiddellijk de levensvatbaarheid met behulp van een geautomatiseerde celteller. Gebruik alleen FBS-vrije media om cellen te verdunnen, omdat serum de blauwe kleuring van de trypan verstoort.
    4. Sluit de rotor af met een siliconenplug met behulp van in de handel verkrijgbaar verpakkingsgereedschap.
    5. Sluit de rotor met een keramische aandrijfpunt door deze verticaal naar beneden te drukken. Raak de delicate vinnen aan de zijkant van de aandrijftip niet aan.
    6. Markeer de helft van de onderrand van de saffierrotor met een zilveren permanente markering en de andere helft van de onderrand van de rotor met een zwarte permanente markering om nauwkeurige bewaking van het draaien van de rotor in de spectrometer mogelijk te maken.
      OPMERKING: Onvolkomenheden in de markering van de rotor voorkomen een nauwkeurige telling van de spinfrequentie, wat resulteert in het niet bereiken van stabiel spinnen. Omdat markeringen niet op een bevroren rotor schrijven en rotorverwarming de monsterintegriteit in gevaar brengt, is het markeren van de rotor vóór het invriezen een kritieke stap.
  2. Cryopreservatie van cellen in een saffierrotor van 3,2 mm.
    1. Plaats een kussen gemaakt van een stuk tissue of keukenpapier onder het deksel en aan de onderkant van de cryogene flacon (zie tabel met materialen).
      OPMERKING: Het tissuepapier beschermt de rotormarkering tegen beschadigingen door stoten tegen de zijkanten van cryogene flacons.
    2. Plaats de saffierrotor van 3,2 mm in de cryogene flacon, opgevuld met het tissuepapier met gemarkeerd uiteinde naar de onderkant van de cryogene flacon.
    3. Vries de rotor langzaam in door de cryogene flacon in de koelcontainer met gecontroleerde snelheid (-1 °C/min) te plaatsen en plaats de container minimaal 3 uur in de vriezer van -80 °C.
    4. Breng de cryogene flacon met de bevroren rotor over in vloeibare stikstofopslag.

3. Cryogene overdracht van een bevroren monster in de NMR-spectrometer

  1. Transporteer het bevroren monster naar de NMR-faciliteit.
    1. Breng de cryogene flacon met de bevroren rotor over in een kleine dewar gevuld met vloeibare stikstof voor transport naar de NMR-faciliteit.
  2. Overdracht van bevroren rotor naar het vloeibare stikstofbad.
    1. Vul een droog, thermisch geïsoleerd breed mondschuim met 500 ml – 1 L vloeibare stikstof.
    2. Breng de rotor van de cryogene flacon over in het brede mondschuim met vloeibare stikstof.
      1. Neem de cryogene flacon uit de transferdewar in de hand en houd deze net boven het oppervlak van de vloeibare stikstof om deze tegen de atmosfeer te beschermen.
      2. Terwijl u de cryogene flacon vasthoudt terwijl de mond iets naar beneden wijst, schroeft u de dop los en laat u de rotor in het vloeibare stikstofbad glijden.
        OPMERKING: Zodra de dop is losgeschroefd, moet de rotor snel (minder dan 1 seconde) van de cryogene flacon in het vloeibare stikstofbad vallen om te voorkomen dat condensatie zich op de rotor verzamelt. De verdamping van vloeibare stikstof vormt een "stikstofwolk" in het brede mondschuim dewar en voorkomt condensatie op de rotor voordat deze wordt ondergedompeld in de vloeibare stikstof. Langere blootstelling van de rotor aan lucht kan leiden tot condensatie van vocht op rotorwanden die opnieuw condenseren in ijs.
  3. Cryogene overdracht van rotor naar NMR monstervanger.
    1. Prechill een 1,5 ml microcentrifugebuis door deze onder te dompelen in het vloeibare stikstofbad. Sluit de buis niet.
      OPMERKING: Inspecteer de rotor voordat u deze in de microcentrifugebuis overzet. Houd met een pincet de rotor net onder het oppervlak van de vloeibare stikstof en controleer of de rotormarkeringen intact zijn, of er geen ijsafzettingen op de wanden zijn gevormd en of de aandrijfpunt intact is. IJskristalafzettingen op de rotorwanden verschijnen als wit poeder. Zorg ervoor dat u de rotor altijd bij zijn lichaam houdt en niet bij de aandrijftip. Krab de markering niet van de rotor met de pincetpunten.
    2. Gebruik onder het oppervlak van het vloeibare stikstofbad een pincet om de rotor in de microcentrifugebuis over te brengen met de aandrijfpunt naar de bodem van de microcentrifugebuis en de markeringen naar de opening van de buis.
      OPMERKING: Droog het pincet altijd voordat u het onderdompelt in vloeibare stikstof of de rotor aanraakt.
    3. Houd met een pincet de buis met de rotor onder vloeibare stikstof bij de nek.
    4. Met een tweede pincet in de hand, bereid u voor om de NMR-monstervanger onder te dompelen in het vloeibare stikstofbad en deze zo vast te houden dat deze onder een scherpe hoek ten opzichte van de microcentrifugebuis staat.
      OPMERKING: Minimaliseer de tijd dat de monstervanger in contact komt met de vloeibare stikstof om bevriezing van de O-ring te voorkomen. Als de O-ring bevriest, zal het erg moeilijk zijn om de vanger in de spectrometer te plaatsen.
  4. Cryogene rotoroverdracht van de NMR-monstervanger naar de NMR-spectrometer
    OPMERKING: Voor deze stap zijn twee personen nodig, één om de cryocabinet te bedienen en één om het monster van de vloeibare stikstof in de sonde over te brengen.
    1. Plaats de cryocabinet in de uitwerpmodus door op 'EJECT' op de kast te drukken.
      OPMERKING: De uitwerpmodus zuivert de droge en koude stikstofgasstroom onder hoge druk van de sonde naar de atmosfeer om de intrede van atmosferisch vocht te voorkomen.
    2. Breng de rotor over in de NMR-monstervanger.
      1. Steek het open uiteinde van de NMR-monstervanger in de microcentrifugebuis terwijl deze zich nog onder het oppervlak van de vloeibare stikstof bevindt.
      2. Til zowel de microcentrifugebuis als de NMR-monstervanger op zodat de rotor in de monstervanger kan vallen. Schud de NMR-monstervanger en de microcentrifugebuis voor het geval de rotor op de rand van de monstervanger vastzit.
      3. Laat de lege microcentrifugebuis bovenop de NMR-monstervanger om de rotor tegen lucht te beschermen.
    3. Verwijder de andere lege NMR-monstervanger uit de sonde en leg deze op de grond.
    4. Breng de NMR-monstervanger met de rotor over naar uw vrije hand, verwijder de microcentrifugebuis en plaats deze onmiddellijk in de sonde.
      OPMERKING: Als de O-ring bevriest, zal het moeilijk zijn om de monstervanger vast te draaien. Blijf kracht uitoefenen totdat deze op zijn plaats glijdt.
    5. Geef de persoon die de cryocabinet bedient een seintje voor 'STOP EJECT' en 'INSERT'.
      OPMERKING: De insteekmodus leidt de rotor van de monstervanger naar de sonde.
    6. Draai het monster op de gewenste draaisnelheid (bijv. 12 kHz) door de lager- en rijstroomdruk aan te passen die door de cryocabinet wordt geregeld. (bijv. Verhoog het lagergas onmiddellijk tot ~200 mBar en het aandrijfgas tot 10 mBar. Zodra het monster draait, verhoogt u het lagergas tot 1000 mBar en drijft u het gas naar 200 mBar. Als het spinnen stabiliseert, verhoogt u het lager tot 2400 mBar en verhoogt u vervolgens het aandrijfgas van 200 mBar naar 1700 mBar over meerdere minuten. VT koelgas is constant bij ~1070 L/h.)
      OPMERKING: Wanneer u de microcentrifugebuis en NMR-monstervanger uit het vloeibare stikstofbad tilt, moet u ervoor zorgen dat de microcentrifugebuis voldoende vloeibare stikstof in zich heeft om de rotor te omringen. Minimaliseer de tijd tussen het overbrengen van de rotor in de NMR-monstervanger en het plaatsen van de NMR-monstervanger in de spectrometer. Alle stappen in 3.4 moeten binnen 30 s worden voltooid.

4. Cryogene verwijdering van het monster uit de NMR-spectrometer

  1. Bereiding van het vloeibare stikstofbad en de cryogene flacon
    1. Giet 500 ml - 1 L vloeibare stikstof in de dewar van breed mondschuim en plaats het bad onder de spectrometer.
    2. Koel de cryogene flacon voor. Dompel de lege cryogene flacon met een stuk tissuepapier onder in het vloeibare stikstofbad.
  2. Cryogene overdracht van rotor van sonde naar cryogene flacon
    1. Verminder de draaisnelheid tot 0 kHz door de rij- en lagergasstroom naar beneden te halen en de rotor uit te werpen door over te schakelen naar de uitwerpmodus.
    2. Houd de uitwerpmodus aan, verwijder de monstervanger uit de sonde, laat de rotor rechtstreeks in de dewar van breed mondschuim vallen die vloeibare stikstof bevat.
    3. Breng de rotor met een voorgekoeld pincet over in een voorgekoeld cryogene flacon onder het oppervlak van de vloeibare stikstof.
    4. Sluit de cryogene flacon af. Prechill de cryogene flacon dop door het onder te dompelen in vloeibare stikstof. Verwijder de cryogene flacon met de rotor en vloeibare stikstof uit het bad en sluit de buis af met een voorgekneed dop. Draai de dop niet vast zodat er veilig verdampende stikstof vrijkomt.
    5. Dompel de cryogene flacon opnieuw onder in vloeibare stikstof. Het monster kan worden overgebracht naar opslag van vloeibare stikstof op langere termijn of onmiddellijk worden uitgepakt voor verdere analyse.

5. Uitpakken van rotor- en levensvatbaarheidsmetingen

  1. Rotor uitpakken en levensvatbaarheid meten
    1. Pre-warme serumvrije media (DMEM) of PBS tot 37 °C.
    2. Verwijder de rotor van vloeibare stikstof. Verwijder de aandrijftip en de siliconenstekker.
      OPMERKING: Saffier is een uitstekende warmtegeleider. Raak de rotor niet aan met uw vingers, omdat warmteoverdracht lokale bevriezings-dooigebeurtenissen kan veroorzaken die de cellulaire levensvatbaarheid in gevaar brengen.
  2. Levensvatbaarheid meten
    1. Voeg 20 μL warme media toe aan de bevroren celkorrel in de rotor en resuspend cellen. Verwijder de suspensie met een pipet en meng de suspensie met 100 μL media.
    2. Verwijder 10 μL celsuspensie en meng met een gelijk volume van 0,4% trypan blauwe oplossing (v/v). Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 s tot 1 min.
    3. Meet de levensvatbaarheid met behulp van een geautomatiseerde celteller.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cryogene invoeging van voorgevroren monsters van zoogdiercellen in de NMR-spectrometer ondersteunt de levensvatbaarheid tijdens het NMR-experiment. Schema's van cryogene overdracht van een bevroren monster in een voorgekoelde NMR-sonde zijn weergegeven in figuur 1. Cellulaire levensvatbaarheid en intactheid kunnen worden beoordeeld met behulp van een verscheidenheid aan methoden. Hier gebruikten we een standaard op kleurstof gebaseerde maat voor membraanintegriteit, die goed aansluit bij andere methoden23. Intacte cellen zijn ondoordringbaar om blauw te proberen, terwijl cellen met aangetaste membraanintegriteit doorlaatbaar zijn. Het aantal trypanblauwe doorlaatbare en ondoordringbare cellen kan snel worden beoordeeld met behulp van een geautomatiseerde celteller. Volgens het hier beschreven protocol is de trypanblauwe permeabiliteit van zoogdiercellen na MAS NMR (d.w.z. in punt 5.2.3) vergelijkbaar met de trypanblauwe permeabiliteit van zoogdiercellen vóór elke temperatuurverandering (d.w.z. punt 2.1.3). Als cellen echter langzaam worden ingevroren en vervolgens worden opgewarmd tot kamertemperatuur voordat ze worden ingebracht (d.w.z. volgens het protocol bij punt 3 voordat de rotor op kamertemperatuur wordt gebracht voordat ze in de gekoelde sonde worden geplaatst), neemt de cellulaire levensvatbaarheid zoals beoordeeld door trypanblauw af tot minder dan 10% van de cellen (figuur 2). Het invriezen van cellen in de spectrometer resulteert dus in het verlies van cellulaire membraanintegriteit, terwijl cryogene invoeging van bevroren monsters van zoogdiercellen de levensvatbaarheid van cellen tijdens het NMR-experiment ondersteunt.

figure-results-1
Figuur 1: Schematische cryogene overdracht van een bevroren monster in een voorgekoelde NMR-sonde. (A) Benader het oppervlak van de vloeibare stikstof en schroef de bovenkant van de cryogene flacon los. (B) Schuif de rotor in het vloeibare stikstofbad. (C) Dompel een microcentrifugebuis onder met een pincet en houd deze op zijn plaats totdat deze volledig afkoelt. (D) Plaats de rotor in de microcentrifuge met de aandrijfpunt naar de onderkant van de buis gericht. Duw, in plaats van grijpen, met het pincet. (E) Houd de microcentrifugebuis net onder het oppervlak van het vloeibare stikstofbad en inspecteer de rotor visueel om er zeker van te zijn dat deze vorstvrij en goed gemarkeerd is. (F) Houd de monstervanger schuin boven het oppervlak. (G) Til de monstervanger en de buis uit de vloeibare stikstof zodra de monstervanger zich in de microcentrifugebuis bevindt. (H) Schud de monstervanger als de rotor op de rand is gevangen. (I) Verwijder de lege monstervanger uit de sonde en leg deze op de grond. (J) Verwijder de microcentrifugebuis van de monstervanger met de rotor erin, steek de monstervanger in de sonde vast en druk op "INSERT" op de bedieningsconsole. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Cryogene invoeging van een voorgevroren monster van zoogdiercellen resulteert in metingen van cellulaire intactheid die vergelijkbaar zijn met monsters van zoogdiercellen die nooit zijn ingevroren. Het percentage trypanblauwe ondoordringbare cellen voor monsters die nooit zijn ingevroren (bijv. stap 2.1.3) is vergelijkbaar met dat van cellen voor monsters na MAS NMR (bijv. stap 5.2.3 met 12 kHz MAS). Langzaam ingevroren cellen (bijv. stap 3) die werden opgewarmd tot kamertemperatuur voordat ze in het NMR-instrument werden ingebracht dat was voorgekoeld tot 100 K, hadden veel lagere percentages intacte cellen na MAS NMR met 12 kHz MAS. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De cryogene overdracht van bevroren monsters in een NMR-spectrometer is succesvol in het behoud van de levensvatbaarheid van bevroren zoogdiercellen door de NMR-gegevensverwerving. Het succes van deze methodologie wordt aangetoond in pre- en post-MAS NMR-levensvatbaarheidsmetingen. Deze aanpak is succesvol en generaliseerbaar voor elk systeem waar temperatuurschommelingen de integriteit van de monsters in gevaar kunnen brengen. Het momenteel gepresenteerde protocol wordt uitgevoerd met de HEK 293 cellijn. Omdat cryopreservatieomstandigheden voor veel zoogdiercellijnen erg op elkaar lijken, is het waarschijnlijk dat de hier gerapporteerde omstandigheden vertaalbaar zijn naar andere cellulaire systemen; ze kunnen echter verdere optimalisatie van cryoprotectanten, monstervolumes en vriessnelheden vereisen om dezelfde resultaten te bereiken.

Deze methodologie kan worden verbeterd door het sneller uitpakken van de rotor na nmr-experiment. Deze stap is momenteel suboptimaal en de uitvoering ervan beïnvloedt de levensvatbaarheid van de cellen. Voordat de cellen in media kunnen worden geresuspendeerd, moeten de aandrijftip en de siliconenplug van de rotor worden verwijderd. Het monster ontdooit ongelijkmatig wanneer de rotor wordt vastgehouden tijdens het verwijderen van de aandrijfpunt en de siliconenplug, zodat kortere rotorbehandelingstijden resulteren in hogere viabilities. De ontwikkeling van rotorhouders of andere hulpmiddelen om een uniforme ontdooiing en snelle verwijdering van de aandrijfpunt en de siliciumplug te vergemakkelijken, zou helpen om de beoordeling van de levensvatbaarheid na NMR nauwkeuriger te maken.

De in dit artikel beschreven benadering van cryogene monsterbelasting is beperkt tot NMR-sondes die het inbrengen en uitwerpen van monsters ondersteunen met de sonde op zijn plaats in de boring van de NMR-magneet. Hoewel het inbrengen en uitwerpen van externe monsters standaard is voor commerciële DNP-systemen, hebben aangepaste sondes deze optie niet altijd. Ook kan deze benadering van cryogene monsterbelasting enige aanpassing vereisen voor NMR-sondes die zijn gebouwd om compatibel te zijn met rotoren van verschillende grootte. Dit protocol is geoptimaliseerd voor rotoren van 3,2 mm en kan worden gewijzigd als de buitendiameter van de monstervanger de binnendiameter van een microcentrifugebuis overschrijdt (bijv. stap 3.4.2).

Met de toepassing van DNP op MAS NMR is het nu mogelijk om eiwitten en andere biomoleculen te detecteren bij endogene fysiologische concentraties24,25,26. Dit opent de mogelijkheid om biomoleculen te bestuderen in hun inheemse omgevingen. Het behoud van cellulaire integriteit en levensvatbaarheid tijdens het experiment is waarschijnlijk van cruciaal belang bij het verbinden van de experimentele resultaten van de spectroscopie met biologische verschijnselen. Ongecontroleerd invriezen van monsters die gezuiverde eiwitten of cellulaire lysaten bevatten , doet doorgaans geen afbreuk aan de monsterkwaliteit7,27, hoewel er aanwijzingen zijn dat de vriessnelheid zelfs in gezuiverde systemen een belangrijke variabele kan zijn28. Monsters van zoogdiercellen moeten echter in gecontroleerde snelheid worden ingevroren als het behoud van cellulaire intactheid en levensvatbaarheid belangrijk is voor de interpretatie. Hier presenteren we een protocol voor het invriezen en overbrengen van bevroren monsters van zoogdiercellen in een voorgekoeld DNP MAS NMR-instrument dat potentieel schadelijke temperatuurschommelingen voorkomt en metingen op levensvatbare cellen ondersteunt.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets bekend te maken.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door subsidies van het Cancer Research Prevention & Research Institute of Texas [RR150076], de National Science Foundation [1751174]; de Nationale Gezondheidsinstituten [NS-111236], de Welch Foundation [1-1923-20170325]; de Lupe Murchison Foundation, de Ted Nash Long Life Foundation en de Kinship Foundation (Searle Scholars Program) aan K.K.F.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.4% Trypan blue stainInvitrogenT10282
100 mm cell culture dishThomas Scientific430167
150 mm cell culture dishNunc157150
3.2 mm sapphire rotorBruker
45 ° angled forcepsHampton ResearchHR4-859
AMUPolCortecnetC010P005
Black and Silver markerSharpie
Cap removal toolBrukerHZ16913
Cell culture grade waterHyCloneSH30529.03
Ceramic capCortecnetHZ12372
CoolCellCorning/ BiocisionUX-04392-00 (Corning) / BCS-405 (Bioscion)
Countess Cell Counting Chamber SlidesInvitrogenC10288
Countess II automated cell counterInvitrogenAMQAF1000
Cryogen tubesNalgene03-337-7Y
d8-glycerolAldrich447498
Deuterium oxide, 99.8 % atom DAldrich756822-1
DMEMGibco10569-010
DNP NMR system with frequency-matched gyrotronBruker
Foam dewarSpearlabFD-800
KimwipesKimwipes
Packing toolBruker
Pen-StrepGibco15140-122
Powdered PBSVWRVWRRV0780
Protonated PBSGibco10010-023
Silicon plugBrukerB7089
Standard Vessel forceps
Tryp-LGibco12605010

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Costello, W. N., Xiao, Y., Frederick, K. K. DNP-Assisted NMR Investigation of Proteins at Endogenous Levels in Cellular Milieu. Methods Enzymology. 615 (1), 373-406 (2019).
  2. Hall, D. A., et al. Polarization-Enhanced NMR Spectroscopy of Biomolecules in Frozen Solution. Science. 276 (5314), 930-932 (1997).
  3. Akbey, Ü, Oschkinat, H. Structural biology applications of solid state MAS DNP NMR. Journal of Magnetic Resonance. 269 (1), 213-224 (2016).
  4. Matsuki, Y., et al. Helium-cooling and -spinning dynamic nuclear polarization for sensitivity-enhanced solid-state NMR at 14T and 30K. Journal of Magnetic Resonance. 225 (1), 1-9 (2012).
  5. Miyamoto, Y., Ikeuchi, M., Noguchi, H., Hayashi, S. Long-term Cryopreservation of Human and other Mammalian Cells at -80 °C for 8 Years. Cell Medicine. 10 (1), 1-7 (2018).
  6. Lopez del Amo, J. M., Schneider, D., Loquet, A., Lange, A., Reif, B. Cryogenic solid state NMR studies of fibrils of the Alzheimer's disease amyloid-β peptide: perspectives for DNP. Journal of Biomolecular NMR. 56 (4), 359-363 (2013).
  7. Gupta, R., et al. Dynamic nuclear polarization enhanced MAS NMR spectroscopy for structural analysis of HIV-1 protein assemblies. The Journal of Physical Chemistry B. 120 (2), 329-339 (2016).
  8. Lim, B. J., Ackermann, B. E., Debelouchina, G. T. Targetable Tetrazine-Based Dynamic Nuclear Polarization Agents for Biological Systems. ChemBioChem. 21 (9), 1315-1319 (2020).
  9. Jaudzems, K., et al. Dynamic nuclear polarization-enhanced biomolecular NMR spectroscopy at high magnetic field with fast magic-angle spinning. Angewandte Chemie International Edition. 57 (25), 7458-7462 (2018).
  10. Chaytor, J. L., et al. Inhibiting ice recrystallization and optimization of cell viability after cryopreservation. Glycobiology. 22 (1), 123-133 (2012).
  11. Mazur, P. Kinetics of water loss from cells at subzero temperatures and the likelihood of intracellular freezing. The Journal of General Physiology. 47 (2), 347-369 (1963).
  12. Lovelock, J. E., Bishop, M. W. H. Prevention of Freezing Damage to Living Cells by Dimethyl Sulphoxide. Nature. 183 (4672), 1394-1395 (1959).
  13. Bald, W. B. The relative merits of various cooling methods. Journal of Microscopy. 140 (1), 17-40 (1985).
  14. Akiyama, Y., Shinose, M., Watanabe, H., Yamada, S., Kanda, Y. Cryoprotectant-free cryopreservation of mammalian cells by superflash freezing. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (16), 7738-7743 (2019).
  15. Shi, M., et al. High-throughput non-contact vitrification of cell-laden droplets based on cell printing. Scientific Reports. 5 (1), 17928(2015).
  16. Pegg, D. E. Principles of cryopreservation. Methods in Molecular Biology. 1257, 3-19 (2015).
  17. Ramilo, C., et al. Detection of the covalent intermediate of UDP-N-acetylglucosamine enolpyruvyl transferase by solution-state and time-resolved solid-state NMR spectroscopy. Biochemistry. 33 (50), 15071-15079 (1994).
  18. Jeon, J., Thurber, K. R., Ghirlando, R., Yau, W. M., Tycko, R. Application of millisecond time-resolved solid state NMR to the kinetics and mechanism of melittin self-assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (34), 16717(2019).
  19. Pievo, R., et al. A rapid freeze-quench setup for multi-frequency EPR spectroscopy of enzymatic reactions. Chemphyschem. 14 (18), 4094-4101 (2013).
  20. Cherepanov, A. V., de Vries, S. Microsecond freeze-hyperquenching: development of a new ultrafast micro-mixing and sampling technology and application to enzyme catalysis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1656 (1), 1-31 (2004).
  21. Hu, K. N., Tycko, R. What can solid state NMR contribute to our understanding of protein folding. Biophysical Chemistry. 151 (1), 10-21 (2010).
  22. Hu, K. N., Yau, W. M., Tycko, R. Detection of a transient intermediate in a rapid protein folding process by solid-state nuclear magnetic resonance. Journal of the American Chemical Society. 132 (1), 24-25 (2010).
  23. Johnson, S., Nguyen, V., Coder, D. Assessment of cell viability. Current Protocols in Cytometry. 64 (1), 1-26 (2013).
  24. Frederick, K. K., et al. Sensitivity-enhanced NMR reveals alterations in protein structure by cellular milieus. Cell. 163 (3), 620-628 (2015).
  25. Van Der Cruijsen, E. A. W., et al. Biomolecular DNP-supported NMR spectroscopy using Site-directed spin labeling. Chemistry. 21 (37), 12971-12977 (2015).
  26. Schlagnitweit, J., et al. Observing an antisense drug complex in intact human cells by in-cell NMR spectroscopy. ChemBioChem. 20 (19), 2474-2478 (2019).
  27. Debelouchina, G. T., et al. Dynamic nuclear polarization-enhanced solid-state NMR spectroscopy of GNNQQNY nanocrystals and amyloid fibrils. Physical Chemistry Chemical Physics : PCCP. 12 (22), 5911-5919 (2010).
  28. Schmidt, T., et al. Submillisecond freezing permits cryoprotectant-free EPR doubled electron-electron resonance spectroscopy. ChemPhysChem. 21, 1224-1229 (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cryogenic Sample LoadingMagic Angle Spinning NMRDynamic Nuclear PolarizationCellular Viability PreservationLiquid Nitrogen TransferSapphire Rotor HandlingControlled Rate CoolingNMR Spectrometer OperationMammalian Cell CryopreservationSample Integrity Maintenance

Related Articles