Method Article

Generatie van dynamische omgevingsomstandigheden met behulp van een microfluïdisch apparaat met hoge doorvoer

DOI:

10.3791/61735

⸱

April 17th, 2021

 ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Cultivation Base for Photoelectric Technology and Functional Materials, State Key Laboratory of Photon-Technology in Western China Energy, Institute of Photonics and Photon-Technology, Northwest University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We presenteren een microfluïdisch systeem voor studies met hoge doorvoer op complexe levensmachines, dat bestaat uit 1500 kweekeenheden, een reeks verbeterde peristaltische pompen en een on-site mengmodulus. De microfluïdische chip maakt de analyse van de zeer complexe en dynamische micromilieuomstandigheden in vivo mogelijk.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het nabootsen van in vivo omgevingsomstandigheden is cruciaal voor in vitro studies naar complexe levensmachines. De huidige technieken gericht op levende cellen en organen zijn echter ofwel zeer duur, zoals robotica, of missen nanolitervolume en millisecondetijdnauwkeurigheid bij vloeistofmanipulatie. Hierin presenteren we het ontwerp en de fabricage van een microfluïdisch systeem, dat bestaat uit 1.500 kweekeenheden, een reeks verbeterde peristaltische pompen en een on-site mengmodulus. Om de capaciteiten van het microfluïdische apparaat aan te tonen, worden neurale stamcelbollen (NSC) in het voorgestelde systeem gehandhaafd. We merkten op dat wanneer de NSC-bol wordt blootgesteld aan CXCL op dag 1 en EFG op dag 2, de ronde conformatie goed wordt gehandhaafd. Variatie in de invoervolgorde van 6 geneesmiddelen veroorzaakt morfologische veranderingen in de NSC-bol en de representatieve marker van het expressieniveau voor NSC-stemheid (d.w.z. Hes5 en Dcx). Deze resultaten geven aan dat dynamische en complexe omgevingsomstandigheden grote effecten hebben op NSC-differentiatie en zelfvernieuwing, en het voorgestelde microfluïdische apparaat is een geschikt platform voor studies met hoge doorvoer over de complexe levensmachines.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Technieken met een hoge doorvoer zijn cruciaal voor biomedische en klinische studies. Door parallel miljoenen chemische, genetische of levende cel- en organoïdetests uit te voeren, kunnen onderzoekers snel genen identificeren die een biomoleculaire route moduleren en sequentiële medicijninvoer aanpassen aan iemands specifieke behoeften. Robotica1 en microfluïdische chips in combinatie met een apparaatbesturingsprogramma maken het mogelijk complexe experimentele procedures te automatiseren, waaronder cel-/weefselmanipulatie, vloeistofbehandeling, beeldvorming en gegevensverwerking/-controle2,3. Daarom kunnen honderden en duizenden experimentele omstandigheden op één chip worden gehandhaafd, volgens de gewenste doorvoer4,5.

In dit protocol beschreven we de ontwerp- en fabricageprocedure van een microfluïdisch apparaat, dat bestaat uit 1500 kweekeenheden, een reeks verbeterde peristaltische pompen en on-site mengmodulus. De celkweekkamer met 2 niveaus voorkomt onnodige afschuiving tijdens medium uitwisseling, wat zorgt voor een ongestoorde kweekomgeving voor langdurige live celbeeldvorming. De studies tonen aan dat het voorgestelde microfluïdische apparaat een geschikt platform is voor studies met hoge doorvoer over de complexe levensmachines. Bovendien maken de geavanceerde kenmerken van de microfluïdische chip geautomatiseerde reconstitutie van zeer complexe en dynamische micromilieuomstandigheden in vivo mogelijk, zoals de steeds veranderende cytokinen en ligandsamenstellingen6,7, waarvan de voltooiing maanden duurt voor conventionele platforms zoals 96-put plaat.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Microfluïdisch chipsontwerp

  1. Ontwerp de microfluïdische multiplexer bestaande uit 18 inhammen, die elk worden aangestuurd door een individuele klep en een peristaltische pomp. Om het vloeistofvolume per pompcyclus te verhogen, moet de peristaltische pomp bestaan uit 3 regelkanalen, die doelbewust zijn verbreed tot 200 μm, en 10 aangesloten stroomleidingen.
  2. Ontwerp de afschuifvrije kweekkamer. Replicatie van de 2-niveau kweekeenheid bestaat uit een lagere celkweekkamer (400 μm x 400 μm x 150 μm) en een hogere bufferlaag (400 μm x 400 μm x 75 μm), die ongewenste schuifspanning op cellen tijdens medium uitwisseling voorkomt (figuur 1).
  3. Ontwerp functies met hoge doorvoer. Dupliceer de kweekeenheid om een matrixlay-out van 30 x 50 te vormen, met een oppervlakte van ongeveer 7 cm bij 5 cm groot.

2. Spaanderfabricage en verrichting

  1. Fabricage van de replicalijst met behulp van UV-lithografie
    OPMERKING: De replicalijst is vervaardigd op siliciumwafel volgens het standaard fotolithografieprotocol8.
    1. Fabricage van de kanaalstructuren
      1. Draaiende fotoresist: Spinlaag 5 ml van de SU-8 3025 negatieve fotoresist op een siliciumwafel bij 500 tpm voor 10 s en 3000 tpm voor 30 s.
      2. Zacht bakken: Leg het wafeltje 2 minuten op een kookplaat op 65 °C en vervolgens 95 °C gedurende 10 minuten, koel het af tot kamertemperatuur.
      3. Uitlijnen en uitharden: Bevestig de wafer en het masker op de houder van de aligner en schakel de lichtbron 18 s in om de blootgestelde fotoresist uit te harden.
      4. Pre-post blootstelling bakken: Verhoog de wafer tot 95°C bij 110°C/h van kamertemperatuur en bewaar deze minstens 40 min tot het verwijderen.
      5. Ontwikkelen: Dompel de wafer in de ontwikkeloplossing (SU-8 developer) en roer deze 2,5 min om redundante fotoresist af te wassen en de 25 μm hoge kanaalstructuur te krijgen.
      6. Hard bakken: Bedek de wafel met glazen Petrischaal en bak gedurende 2 minuten op 65 °C, verhoog vervolgens tot 160 °C bij 120 °C / h en bewaar deze gedurende 3 uur.
    2. Fabricage van de celkweekkamer met de bufferlaag
      1. Gebruik de parameters van stap 2.1.1.1 om 7 ml van de SU-8 3075 negatieve fotoresist op de bovenstaande wafer te draaien.
      2. Bak het wafeltje zacht (beschreven in stap 2.1.1.2) en verwissel het masker om goed af te stemmen op de markeringen op de wafer. Schakel vervolgens de lichtbron 24 s in om de blootgestelde fotoresist te genezen.
      3. Dompel de wafer naar de ontwikkelende oplossing (SU-8 developer) en roer deze gedurende 4 minuten en 40 seconden om redundante fotoresist af te wassen en een 75 μm hoge laagstructuur te krijgen die rond de 25 μm hoge kanaalstructuur die eerder is vervaardigd. Hard bakken (beschreven in stap 2.1.1.6) de wafel om de complexe structuur sterker te maken.
      4. Herhaal stap 2.1.2.1-2.1.2.3 om een 75 μm hoge kamerstructuur te fabriceren die op de laagstructuur stapelt.
    3. Fabricage van de klepstructuren
      1. Gebruik de parameter van stap 2.1.1.1 om 5 ml van de AZ 50x positieve fotoresist op de bovenstaande wafer te draaien.
      2. Bak het wafeltje zacht (beschreven in stap 2.1.1.2) en maak het masker goed uitgelijnd met markeringen op het wafeltje, houd vervolgens de lichtbron 20 s aan en onmiddellijk 30 s uit. Herhaal de licht aan/uit procedure in 5 cirkels om de blootgestelde fotoresist te genezen.
      3. Dompel de wafer naar de ontwikkelaar en roer hem ongeveer 8 minuten om redundante fotoresist af te wassen en de ronde kleppen te krijgen die overlappen met de besturingskanalen om een goede verbinding te garanderen. Hard bakken (beschreven in stap 2.1.1.6) de patroonwafel om het hele model sterker te maken.
  2. Microfluïdische chipproductie met behulp van zachte lithografie
    1. Behandel de patroon- en blanco siliciumwafels gedurende 15 minuten met rimethylchlorosilane.
    2. Bereid 3 porties PDMS-gel (10:1 monomeer/katalysatorverhouding) die overeenkomen met respectievelijk 50 g debietlaag, 20 g regellaag 2 en 20 g membraan.
    3. Giet 50 g PDMS-gel op de siliconenwafel met patroon en de-gas ze gedurende 1-2 uur in de vacuümkamer bij -0,85 MPa om de stroomlaag te kopiëren.
    4. Ontgast de 2 porties van 20 g PDMS en draai deze op de wafer met patroon en een blanco siliciumwafel bij 2000-2800 tpm gedurende 30 s om een controlelaag en membraanlaag voor te bereiden.
    5. Zet de met PDMS bedekte wafels gedurende 60 minuten in de ventilatieoven bij 80 °C voor incubatie.
    6. Lijn de verschillende lagen uit en hecht ze aan elkaar via een aangepast optisch apparaat (zoom in 100x) en een plasma-etsmachine. Bewaar het vervolgens 2 uur in een ventilatieoven bij 80 °C om de hechting van de chip te verbeteren.
    7. Pons de inlaatgaten op de chip en bind deze vervolgens op een pdms-gecoate afdeklip en laat deze voor gebruik minstens 12 uur uitharden bij 80 °C.
  3. Spaanwerking
    1. Sluit miniatuur pneumatische magneetventielen aan op de regellaag van de chip en open de aangepaste MATLAB grafische gebruikersinterface8 om de schakelaar te koppelen en te bedienen.
    2. Stel de sluitdruk van push-up PDMS membraankleppen in op 25 psi.
    3. Lever dynamisch veranderende combinatorische/sequentiële ingangen aan aangewezen kamers (figuur 2d) door tijdige uitloop van de kleppen.

3. Generatie van dynamische inputs in cellulaire micromilieus

  1. Spaanbehandeling en celbelasting
    1. Houd de standaard kweekomstandigheden (37 °C, 5% CO2) gedurende ten minste 5 uur op de microscoop.
    2. Vul de chip met een coatingmedium (d.w.z. vermeld in de NOTE) en incubeer deze onder de standaard kweekomstandigheden (beschreven in stap 3.1.1) gedurende ten minste één uur.
    3. Spoel de chip door fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) of celkweekmedium (Dulbecco's Modified Eagle's medium, DMEM) om een gezonde kweekomgeving op te bouwen.
    4. Oogst cellen bij 80% samenvloeiing en resuspendeer de cellen met behulp van kweekmedia (DMEM) met een dichtheid van ~ 106/ml. Laad vervolgens cellen in de chip door de celbevattende oplossing onder druk te zetten.
      OPMERKING: Voor het cultiveren van verschillende cellijnen op de chip is een overeenkomstig coatingmedium nodig om de celkweekkamer te behandelen. Typisch, voor experimenten op 3T3 fibroblast en aanhangend cultuur van kip zijn alle kleppen die de kweekkamers regelen open, cellen stromen in alle kweekkamers binnen dezelfde kolom.
  2. Instellingen voor live-cell imaging met hoge doorvoer
    OPMERKING: Voor beeldverwerving werd een omgekeerde microscoop met een geautomatiseerde translationele fase en een digitale complementaire CMOS-camera (Metal-Oxide Semiconductor) gebruikt. Het podium en de beeldverwerving werden aangestuurd via de maatwerksoftware.
    1. Visualiseer de matrix van kweekkamers met behulp van 10x objectieve lens in helder veld om de locatiecoördinaten van elke kamer van de 30 bij 50 kamermatrix te bevestigen en te definiëren.
    2. Transformeer de objectieve lens naar de 20x of 40x en selecteer vervolgens de locatiecoördinaten van de gewenste kamer en de vertaalfase gaat na bevestiging naar de toegewezen positie. Verfijn het x-, y- en z-brandpuntsvlak om een optimaal beeld te krijgen.
    3. Optimale lichtintensiteit, belichtingstijd en andere afgebeelde parameters werden individueel bepaald voor elk kanaal (d.w.z. helderveld- en fluorescentiebeeldvorming).
    4. Stel het interval en de duur van de beeldvormingscyclus in, sla het pad op en begin met beeldvorming.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De conventionele on-chip peristaltische pomp werd voor het eerst beschreven door Stephen Quake in 2000, waarbij de peristaltiek werd bediend door het patroon 101, 100, 110, 010, 011, 001 8,10. Het getal 0 en 1 geven "open" en "sluiten" van de 3 horizontale bedieningslijnen aan. Studies met meer dan 3 kleppen (bijv. vijf) zijn ook gerapporteerd11. Hoewel de peristaltische pomp bestaande uit 3 regellijnen en 3 stroomlijnen nanoliternauwkeuri...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Verschillende microfluïdische apparaten zijn ontwikkeld om multiplexed en complexe experimenten uit te voeren17,18,19,20. Microwells gemaakt van een reeks topologische uitsparingen kunnen bijvoorbeeld individuele cellen vangen zonder het gebruik van externe kracht, met gunstige karakters, waaronder kleine steekproefgrootte, parallellisatie, lagere materiaalkosten, snellere respons, hoge gevoeli...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets bekend te maken.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Auteurs erkennen de technische ondersteuning van Zhifeng Cheng van Chansn Instrument (China) LTD. Dit werk werd ondersteund door subsidies (National Natural Science Foundation of China,51927804).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2713 Loker Avenue WestTorrey pines scientific
AZ-50XAZ Electronic Materials, Luxembourg
Chlorotrimethylsilaan(TMCS) 92360-25mLSigma
CO2 Incubator HP151Heal Force
Desktop Hole Puncher voor PDMS chips WH-CF-14Suzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd.
DMEM(L-glutamine, Hoge Glucose, fenol Rood)Invitrogen
Elektronische Weegschaal UTP-313 Max:600g, e:0.1g, d:0.01gShanghai Hochoice Apparatus Manufacturer Co.,LTD.
FBSSigma
Fibronectine 0.25 mg/mLMillipore, Oostenrijk
Glutamax 100xGibco
Verwarmings-Incubator BGG-9240AShanghai bluepard instruments Co.,Ltd.
Nikon Model Eclipse Ti2-ENikon
Pen/Strep 10 Eenheden/mL Penicilline 10 ug/mL StreptomycineInvitrogen
Plasma cleaner PDC-002Harrick Plasma
polydimethylsiloxaan(PDMS)Momentive
polylysine 0.01%Sigma
Spin coater ARE-310Awatori Rentaro
Spin coater TDZ5-WSCence
Spin coater WH-SC-01Suzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd.
SU-8 3025MicroChem, Westborough, MA, USA
SU-8 3075MicroChem, Westborough, MA, USA

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Michael, S., et al. A robotic platform for quantitative high-throughput screening. Assay and Drug Development Technologies. 6 (5), 637-657 (2008).
  2. Kim, S. J., Lai, D., Park, J. Y., Yokokawa, R., Takayama, S. Microfluidic automation using elastomeric valves and droplets: reducing reliance on external controllers. Small. 8 (19), 2925-2934 (2012).
  3. Melin, J., Quake, S. R. Microfluidic large-scale integration: the evolution of design rules for biological automation. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 36, 213-231 (2007).
  4. Tsui, J. H., Lee, W., Pun, S. H., Kim, J., Kim, D. H. Microfluidics-assisted in vitro drug screening and carrier production. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (11-12), 1575-1588 (2013).
  5. Junkin, M., et al. High-content quantification of single-cell immune dynamics. Cell Reports. 15 (2), 411-422 (2016).
  6. Obernier, K., Alvarez-Buylla, A. Neural stem cells: origin, heterogeneity and regulation in the adult mammalian brain. Development. 146 (4), (2019).
  7. Kageyama, R., Shimojo, H., Ohtsuka, T. Dynamic control of neural stem cells by bHLH factors. Neuroscience Research. 138, 12-18 (2019).
  8. Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography. Science. 288 (5463), 113-116 (2000).
  9. Zhang, C., et al. Ultra-multiplexed analysis of single-cell dynamics reveals logic rules in differentiation. Science Advances. 5 (4), (2019).
  10. Quake, S. R., Scherer, A. From micro-to nanofabrication with soft materials. Science. 290 (5496), 1536-1540 (2000).
  11. Okandan, M., Galambos, P., Mani, S. S., Jakubczak, J. F. Development of surface micromachining technologies for microfluidics and BioMEMS. Microfluidics and BioMEMS. 4560, International Society for Optics and Photonics. 133-139 (2001).
  12. Freshney, R. I. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications, Sixth Edition. , (1983).
  13. Niu, W., et al. SOX2 reprograms resident astrocytes into neural progenitors in the adult brain. Stem Cell Reports. 4 (5), 780-794 (2015).
  14. Sarkar, D. K., et al. Cyclic adenosine monophosphate differentiated β-endorphin neurons promote immune function and prevent prostate cancer growth. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (26), 9105-9110 (2008).
  15. Watanabe, J., et al. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide-induced differentiation of embryonic neural stem cells into astrocytes is mediated via the β isoform of protein kinase. C. Journal of Neuroscience Research. 84 (8), 1645-1655 (2006).
  16. Watanabe, J., et al. Involvement of protein kinase C in the PACAP-induced differentiation of neural stem cells into astrocytes. Annals of the New York Academy of Sciences. 1070 (1), 597-601 (2006).
  17. Thorsen, T., Maerkl, S. J., Quake, S. R. Microfluidic large-scale integration. Science. 298 (5593), 580-584 (2002).
  18. Khademhosseini, A., et al. Cell docking inside microwells within reversibly sealed microfluidic channels for fabricating multiphenotype cell arrays. Lab on a Chip. 5 (12), 1380-1386 (2005).
  19. Martinez, A. W., Phillips, S. T., Whitesides, G. M. Three-dimensional microfluidic devices fabricated in layered paper and tape. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (50), 19606-19611 (2008).
  20. Zhang, Y., et al. DNA methylation analysis on a droplet-in-oil PCR array. Lab on a Chip. 9 (8), 1059-1064 (2009).
  21. Huang, N. T., Hwong, Y. J., Lai, R. L. A microfluidic microwell device for immunomagnetic single-cell trapping. Microfluidics and Nanofluidics. 22 (2), 16(2018).
  22. Galler, K., Bräutigam, K., Große, C., Popp, J., Neugebauer, U. Making a big thing of a small cell-recent advances in single cell analysis. Analyst. 139 (6), 1237-1273 (2014).
  23. Grünberger, A., Wiechert, W., Kohlheyer, D. Single-cell microfluidics: opportunity for bioprocess development. Current Opinion in Biotechnology. 29, 15-23 (2014).
  24. Lin, H., Mei, N., Manjanatha, M. G. In vitro comet assay for testing genotoxicity of chemicals. Optimization in Drug Discovery. , Humana Press. Totowa, NJ. 517-536 (2014).
  25. Bai, H., et al. Efficient water collection on integrative bioinspired surfaces with star-shaped wettability patterns. Advanced Materials. 26 (29), 5025-5030 (2014).
  26. Zhao, J., Chen, S. Following or against topographic wettability gradient: movements of droplets on a micropatterned surface. Langmuir. 33 (21), 5328-5335 (2017).
  27. Theberge, A. B., et al. Microfluidic platform for combinatorial synthesis in picolitre droplets. Lab on a Chip. 12 (7), 1320-1326 (2012).
  28. Zhang, L., et al. Fabrication of ceramic microspheres by diffusion-induced sol-gel reaction in double emulsions. ACS Applied Materials & Interfaces. 5 (22), 11489-11493 (2013).
  29. Moerman, R., et al. Quantitative analysis in nanoliter wells by prefilling of wells using electrospray deposition followed by sample introduction with a coverslip method. Analytical Chemistry. 77 (1), 225-231 (2005).
  30. Zhou, X., Lau, L., Lam, W. W. L., Au, S. W. N., Zheng, B. Nanoliter dispensing method by degassed poly (dimethylsiloxane) microchannels and its application in protein crystallization. Analytical Chemistry. 79 (13), 4924-4930 (2007).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microfluidic DeviceHigh Throughput CultureDynamic Environmental ConditionsNeural Stem CellsPeristaltic PumpsSequential Signal InputsCell DifferentiationPDMS MicrofabricationInverted MicroscopyCell Microenvironment

Related Articles