Mechanische scheiding en eiwitsnoerlubilisatie van de buitenste en binnenste Perivitelline-sublagen van kippeneieren

Summary

Dit artikel rapporteert een eenvoudige methode om de buitenste en binnenste perivitelline-sublagen van kippeneieren te isoleren terwijl structurele verandering wordt geminimaliseerd en om de eiwitoplosbaarheid van elke onderlaag te optimaliseren voor proteomische analyses.

Abstract

De perivitellinelaag die de eierdooier omringt, speelt een fundamentele rol bij de bevruchting, bij de eiverdediging en bij de ontwikkeling van het aviaire embryo. Het wordt gevormd door twee eiwithoudende onderlagen die nauw met elkaar verbonden zijn en gevormd worden door verschillende vrouwelijke voortplantingsorganen. Beide structuren worden verondersteld hun eigen functionele specifieke kenmerken te hebben, die nog moeten worden gedefinieerd. Om de functie van eiwitten die elke onderlaag vormen te karakteriseren, is de eerste uitdaging om de omstandigheden vast te stellen die de mechanische scheiding van deze twee ingewikkelde lagen mogelijk maken, terwijl eventuele structurele schade wordt beperkt. De tweede stap is het optimaliseren van de experimentele omstandigheden om eiwitoplosbaarheid van deze twee sublagen te vergemakkelijken, voor daaropvolgende biochemische analyses. De efficiëntie van deze aanpak wordt beoordeeld door het eiwitprofiel van elke onderlaag te analyseren door Sodium Dodecyl Sulfate-Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE), dat naar verwachting tussen de twee structuren zal worden onderscheiden. Deze procedure in twee stappen blijft eenvoudig; het vereist klassieke biochemische apparatuur en reagentia; en is compatibel met verdere diepgaande proteomics. Het kan ook worden omgezet in andere aviaire eieren voor vergelijkende biologie, wetende dat de structuur en de samenstelling van de perivitellinelaag soortspecifieke kenmerken hebben. Bovendien maken de niet-denaturerende omstandigheden die zijn ontwikkeld voor scheiding van sublagen (stap 1) hun structurele analyses mogelijk door elektronenmicroscopie te scannen en over te brengen. Het kan ook de eerste stap zijn voor latere eiwitzuivering om hun respectieve biologische activiteiten en 3D-structuur te analyseren, of om verdere immunohistochemische of functionele analyses uit te voeren. Dergelijke studies zouden helpen om de fysiologische functie van deze twee onderlagen te ontcijferen, waarvan de structurele en functionele integriteiten bepalende criteria van het reproductieve succes zijn.

Introduction

Het doel van deze methode is om een protocol te bieden dat latere biochemische karakterisering van de perivitellinelaag (PL) mogelijk maakt, een dunne eiwitachtige laag die de eigeel omsluit en een fundamentele rol speelt bij de reproductie van vogelsoorten. De PL, in de literatuur ook wel "vitellinemembraan" genoemd, is een driedimensionaal netwerk van dikke vezels bestaande uit verschillende soorten glycoproteïnen. Het bestaat uit een binnenste perivitellinelaag (IPL) (in contact met de dooier) die in de eierstok wordt geassembleerd, en uit een buitenste perivitellijnlaag (OPL, in contact met het wit), liggend op de IPL (figuur 1) en geproduceerd door de infundibulum. Dit laatste weefsel is het trechterachtige bovenste segment van de eileider die de volwassen dooierachtige follikel ontvangt na de ovulatie en de plaats waar de bevruchting plaatsvindt. De afscheiding van OPL vindt plaats na deze twee gebeurtenissen en wordt gevolgd door de opeenvolgende afzetting van het eiwit en de eierschaal in andere specifieke segmenten van de eileider. De fysiologische functies van PL zijn niet alleen gerelateerd aan bevruchting en vroege stadia van embryogenese, maar ook aan de fysieke en moleculaire bescherming van het embryo. De proteomische analyse van kippenei uitgevoerd op de hele PL onthulde de aanwezigheid van 137 verschillende eiwitten¹, maar de verdeling van de meeste van deze eiwitten tussen IPL en OPL moet nog worden opgehelderd. De minimale hoeveelheid beschikbare gegevens in het literatuurrapport dat IPL en OPL zeer verschillende eiwitprofielen^{vertonen 2,3,4}, wat verschillende structurele en functionele eigenschappen suggereert. De relatieve schaarste aan gegevens over de verdeling van eiwitten tussen OPL en IPL is waarschijnlijk te wijten aan de moeilijkheid om beide dun en ingebedde sublagen te scheiden.

De hier gepresenteerde methode beschrijft de voorwaarden die moeten worden gebruikt om de twee onderlagen met een beperkte impact op hun respectieve histologische structuur te scheiden met behoud van hun eiwitgehalte, en om het protocol te verstrekken dat de volledige oplosbaarheid van eiwitten mogelijk maakt voor latere analyse door proteomics. Het omvat twee hoofdstappen: 1) PL-bemonstering en OPL/ IPL-scheiding en 2) PL-, OPL- en IPL-behandeling voor eiwitoplosbaarheid en elektroforese voor massaspectrometrieanalyse. De werkstroom wordt weergegeven in figuur 2. Hoewel het huidige protocol is geoptimaliseerd voor proteomische analyses (stap 2.2), kan het in sommige stappen worden gestopt voor histologische (bijv. elektronenmicroscopie), immunohistochemische analyses, functionele studies (stap 1) en voor zuivering van in zout oplosbare eiwitten om hun structuur en biologische activiteit te karakteriseren (stap 2.1) (figuur 2).

De eerste stap is het verwijderen van de totale PL uit de eigeel(figuur 2,stap 1.1). Alle gepubliceerde methoden beginnen met de scheiding van het eiwit van de dooier handmatig of met behulp van een eierscheider. Het wordt gevolgd door het verwijderen van het resterende eiwit en de dikke chalazae met behulp van een tang of door adsorptie op een filterpapier⁵ (figuur 2A). Vervolgens zijn de technieken die zijn geselecteerd om PL te bemonsteren variabel, afhankelijk van de gepubliceerde artikelen. Sommige documenten omvatten verscheidene wasbeurten van de dooier, in gedeïoniseerd of gedestilleerd water^1,5,6, in 0.85 tot 1% zoute oplossing^2,7,8, in bufferoplossingen zoals 0.15 M NaCl/N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-2-aminoethanesulfonzuur, pH 7,4⁴, of in 0,01N HCl (pH 2)³. Deze procedures werden toegepast op kip, eend, ringhals fazant, grijze patrijs, cockatiel papegaai, binnenlandse duif, of loopvogels eieren^2,6,9. Het verwijderen van PL terwijl de eigeel wordt onderhouden in een Petrischaal zonder waterige oplossingen kan zeer bewerkelijk zijn, omdat de PL kwetsbaar is en eigeel de neiging heeft om vast te houden aan PL^1,5 en daarom moeilijk achteraf te elimineren blijft. Het gebruik van zure buffer of oplossing gedurende een uur bij 37 °C³ heeft ook geen voorkeur, omdat dergelijke omstandigheden de PL-structuur kunnen veranderen en kunnen leiden tot eiwitverlies. Het is ook belangrijk om het gebied met de kiemschijf te verwijderen, omdat deze zone waarschijnlijk een duidelijk structureel en moleculair patroon heeft, dat niet het hele PL^4,6,10 ( figuur2B) weerspiegelt. Deze methode maakt gebruik van ideeën die door sommige gepubliceerde artikelen worden benadrukt en stelt enkele verbeteringen voor om PL-bemonstering te vergemakkelijken met behoud van de integriteit ervan (figuur 2C).

De tweede stap bestaat uit het scheiden van de twee sublagen (figuur 2, stap 1.2). Deze stap is van cruciaal belang omdat OPL en IPL nauw met elkaar verbonden zijn. Deze stap moet zorgvuldig worden uitgevoerd met een tang onder een verrekijker ontleedmicroscoop. Publicaties die opL/IPL-scheiding rapporteren, zijn vrij beperkt^2,3,7,11 en sommige van hen gebruiken specifieke aandoeningen (zure buffer bij 37 °C gedurende 1 uur^2,3) die de histologische structuur van de sublagen kunnen beïnvloeden en/of kunnen bijdragen aan eiwitverlies of dooier- of witte verontreinigingen. Om de OPL beter te onderscheiden van de IPL, meldden sommige auteurs het gebruik van het toluidineblauw om de OPL enigszins te kleuren (de binnenste laag blijft kleurloos)¹¹. In de ontwikkelde methode hebben we de omstandigheden geoptimaliseerd zodat de scheiding gemakkelijk kan worden bereikt en geen kleurstof hoeft te worden gebruikt (figuur 2D).

De tweede belangrijkste stap is de oplosbaarheid van eiwitten die elke onderlaag vormen. Klassiek wordt het bereikt door schone lyophilized^1,gedroogde^{2, 6,}of vers bereide^3,4,11 PL / sublagen rechtstreeks te mengen met de Laemmli-buffer die wordt gebruikt voor elektroforese. Andere auteurs gaven de voorkeur aan een voorlopige oplosbaarheid van lagen in 1% NaCl, in een 1% SDS-bufferoplossing^2,3,11 of in een oplossing die proteaseremmers en SDS⁶ bij kamertemperatuur of Triton bevat, gevolgd door incubatie bij 45 °C¹², onder constant krachtig roeren. Sommige auteurs beschreven ook een protocol waarbij de PL werd geïncubeerd in fosfaatbuffer zoutoplossing of ureum en onderworpen aan sonicatie¹³. Deze behandelingen werden allemaal gevolgd door een centrifugatie en verdunning in de Laemmli-buffer en delen allemaal het nadeel van onvolledige eiwitoplosbaarheid uit lagen, omdat de onoplosbare stof (de pellet verkregen na centrifugatie) uit het te analyseren monster wordt verwijderd.

Bovendien is het gebruik van denatureringsomstandigheden (ureum, wasmiddel, hoge temperatuur, enz.) door bepaalde auteurs voor eiwitoplosbaarheid niet compatibel met daaropvolgende eiwitzuivering voor karakterisering, omdat ze waarschijnlijk eiwitten onomkeerbaar inactiveren, hun biologische activiteiten verstoren en ook hun 3D-structuur aantasten. Voor deze specifieke stap 2, het protocol bevat een eerste substap die oplosbaarheid van de meest voorkomende eiwitten mogelijk maakt onder niet-denaturerende omstandigheden na PL/OPL/IPL mechanische destructuratie, die verdere eiwitstudies, indien nodig (figuur 2,stap 2.1) niet zal verstoren, en een tweede substap die volledige oplosbaarheid van eiwitten voor elektroforese en diepgaande proteomics mogelijk maakt (figuur 2, stap 2.2). Het combineert suggesties uit verschillende gepubliceerde papers en aanpassingen als gevolg van nieuwe ideeën gevalideerd door experimentele studies.

Protocol

1.PL, IPL en OPL-bemonstering

1. PL-bemonstering
   1. Breek het vers gelegde onbevruchte ei handmatig en gebruik een eischeider die op een glazen beker ligt om de dooier van het wit te scheiden. Verwijder de chalazae met een kleine schaar en rol de dooier over een filterpapier om aanhangend albumen te verwijderen dat verschijnt als een transparante en zichtbare structuur (figuur 2A).
      LET OP: Let op dat u de PL niet met een schaar doorboort. Het gebruik van een pincet in plaats van een schaar om chalazas te verwijderen, kan PL-breuk en daaropvolgende dooierlekkage veroorzaken. De rolstap op het filterpapier is van cruciaal belang en moet zeer snel worden uitgevoerd vanwege de absorberende eigenschappen van het papierfilter die PL-breuk kunnen veroorzaken. Het is ook erg belangrijk om een onbevrucht ei te gebruiken vanaf de dag van leggen, om het succes van deze eerste stap en alle volgende stappen te optimaliseren. Als alternatief kunnen eieren worden gebruikt die minder dan 10 dagen in een gekoelde omgeving zijn opgeslagen, maar experimenten moeten rekening houden met mogelijke risico's van PL-wijzigingen.
   2. Dooier onderdompelen in een kristallisator met 10 mM Tris-HCl pH 8 die eerder is afgekoeld tot 4 °C en verwijder het PL-gebied over de kiemschijf binnen een zone van 1 cm met een stompe schaar (figuur 2B).
      OPMERKING: Aanvankelijk werd PL ondergedompeld in gedeïnioniseerd water, maar deze aanpak heeft enkele nadelen, zoals het gebrek aan pH-controle en de moeilijkheden om sublagen daarna te scheiden (stap 1.2). Daarom werden verschillende aandoeningen getest, waaronder tris-concentratie (figuur 3A) en pH (figuur 3B). Het gebruik van een buffer bij pH 8, in plaats van gedeïmpioniseerd of gedemineraliseerd water, is in overeenstemming met de eifysiologie (de pH van eiwit is ongeveer 7,8 op de dag van leggen)¹⁴ en minimaliseert eiwitverlies. Daarentegen wordt vermoed dat zure of zeer alkalische pH PL-destructuratie en vroege eiwitsanering veroorzaakt (figuur 3B). De buffer bestaande uit 10 mM Tris-HCl pH 8 bleek optimaal te zijn, omdat deze de eifysiologie respecteert en geen significante eiwitoplosbaarheid veroorzaakt (de eiwitconcentratie in de werkbuffer blijft minimaal, figuur 3A,B).
   3. Breek de PL met een kleine schaar in de buffer. Houd de twee randen van de gescheurde PL met een tang vast en pel de PL van de dooier.
   4. Onderhoud de PL met een tang en spoel de PL meerdere keren in verschillende baden van 10 mM Tris-HCl, pH 8 totdat er geen spoor van dooier zichtbaar is. Zorg er in dit stadium voor dat de PL schoon, wit en zwevend in de buffer is. Het kan worden verwerkt in stap 1.2 voor sublaagscheiding of rechtstreeks naar stap 2.1 voor biochemische analyses.
2. OPL- en IPL-bemonstering
   1. Spreid het hele PL-monster uit door OPL naar boven in een plastic Petrischaal te doen en het plat te houden met zo min mogelijk rimpels. Bedek het monster met 10 mM Tris-HCl pH 8, 50 mM NaCl. Gebruik een plastic Petrischaal (en niet glas) om PL-bewegingen te beperken, omdat PL beter aan plastic kleeft.
      1. Om de OPL-kant te lokaliseren, kijkt u waar de locatie van de resterende chalazae die aan de OPL zijn bevestigd en niet de IPL. Deze stap vereist een kleine NaCl-concentratie (50 mM) om de scheiding van de onderlaag te vergemakkelijken.
         OPMERKING: Op basis van de grafiek in figuur 3C en literatuur¹¹mag deze concentratie niet leiden tot groot eiwitverlies. Aanvankelijk werd gedeïnsioniseerd water gebruikt om de onderdoders te scheiden, zoals eerder beschreven^1,5,6, maar deze techniek bleek zeer bewerkelijk te zijn en resulteerde in de wijziging van de structurele PL-integriteit. Daarom werden verschillende NaCl-concentraties (figuur 3C) getest omdat zout de scheiding van de twee sublagen vergemakkelijkte. Het is echter opmerkelijk dat het gebruik van nacl-concentratie >100 mM de oplosbaarheid/afgifte van eiwitten uit de PL verhoogt, wat hier niet het doel is (dit zal de doelstelling zijn in stap 2) (figuur 3C). Het toevoegen van 50 mM NaCl aan de 10 mM Tris-HCl pH 8 buffer vergemakkelijkt de scheiding van de twee sublagen en minimaliseert eiwitverlies.
   2. Snijd de totale PL in stukjes van ongeveer 2 cm x 3 cm met een kleine schaar. Scheid mechanisch de twee lagen van elk PL-stuk met ultranauwkeurige tipdop onder een verrekijker ontleedmicroscoop (figuur 4). Bewaar de resulterende IPL- en OPL-monsters afzonderlijk in microbuisjes bij -80 °C, tot verder gebruik.
      OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd. Opgemerkt moet worden dat de efficiëntie en de mogelijkheid van scheiding van de twee lagen sterk afhangt van de versheid van het ei. Opgeslagen eieren vertonen inderdaad drastische interne wijzigingen als gevolg van de snelle toename van de pH van eiwit en de daaropvolgende wijziging van de dooierindex als gevolg van het losraken (en verzwakken van de PL). IPL is kwetsbaarder in vergelijking met OPL. Het verdient daarom de voorkeur om het gezicht van de OPL hierboven te plaatsen en de twee sublagen te scheiden door met de tang aan OPL te trekken. Beide onderlagen moeten met kostbare zorg worden behandeld.

2. Monsterbehandeling voor eiwitoplosbaarheid en SDS-PAGE analyses

1. Oplosbaarheid van primaire eiwitten
   1. Vriesdroog IPL- en OPL-monsters afzonderlijk. Zodra het vriesdrogen is voltooid, snijdt u ongeveer 1 mg van elk monster in schone microbuizen met een lekvrije schroefdop. Bewaar de resterende monsters in goed gesloten buizen voor langdurige opslag bij -80 °C.
      OPMERKING: Het gebruik van microbuizen met een lekvrije schroefdop zorgt voor hermetische en lekvrije sluiting om rehydratatie van monsters te voorkomen en dat zal de monsters beveiligen.
   2. Meng 1 mg van elke gelyophiliseerde sublaag met 400 μL van 50 mM Tris pH 7, 500 mM NaCl. Gebruik een mixer-mill gedurende 2 keer gedurende 5 minuten bij 30 Hz om OPL- en OPL-structuren in microdeeltjes te desintegreren en eiwitoplosbaarheid te vergemakkelijken. Verzamel 400 μL van de monsters die de OPL en IPL bevatten in twee schone microbuisjes.
      OPMERKING: De buffer die hier wordt gebruikt, is gekozen om de eiwitsamenstelling te verhogen (in tegenstelling tot stap 1). Deze buffer was gebaseerd op de resultaten in figuur 3, die een toename van de eiwitsamenstelling bij pH 7 (figuur 3B) en het gebruik van 0,5 M NaCl (figuur 3C) laten zien. Het protocol kan hier worden gepauzeerd. In dit stadium kunnen monsters worden gebruikt voor de eiwitzuivering van de belangrijkste PL-eiwitten of worden verwerkt tot stap 2.2.
2. Eiwitsuspensatie voor elektroforese
   1. Voeg 5x SDS-PAGE monsterbuffer (100 μL, 0,25 M Tris-HCl, 0,05% bromophenolblauw, 50% glycerol, 5% SDS, 5% bèta-mercaptoethanol, pH 6,8) toe aan elke 400 μL van het monster en verwarm gedurende 5 minuten bij 100 °C.
      OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd en monsters kunnen worden opgeslagen bij -80 °C. In deze fase van het protocol zijn OPL en IPL volledig ontbonden. De efficiëntie van de monstersamenstelling kan worden beoordeeld door monsters gedurende 5 minuten bij 10.000 x gte centrifugeren. Volledige oplosbaarheid wordt gekenmerkt door een afwezigheid van zichtbare pellet na centrifugatie. Zo wordt hier na volledige oplosbaarheid geoordeeld dat 1 mg lyophilized sublaag overeenkomt met 1 mg eiwitten (de eiwitconcentratie in het 500 μL-monster is 2 mg/ml). PL bestaat namelijk voor meer dan 80% uit eiwit^2,15. Het gebruik van een 5x monsterbuffer beperkt de verdunning van het monster, maar een 1x of 2x monsterbuffer kan ook worden gebruikt.
   2. Laad maximaal 20 μg eiwitten/lane op een SDS polyacrylamide gel (4%–20% gradiëntgel) en voer elektroforese uit bij 120 V met behulp van een verticaal elektroforesesysteem.
      OPMERKING: Het gebruik van een 4%-20% gradiëntgel is niet verplicht, maar heeft hier de voorkeur omdat OPL en IPL eiwitten vertonen met moleculaire gewichten variërend van <10 kDa tot >250 kDa. Het kan ook nuttig zijn om de stapelgel (die meestal wordt verwijderd) te houden, omdat de aanwezigheid van onoplosbare eiwitten of eiwitaggregaten aan de onderkant van putten zou wijzen op een slechte oplosbaarheid en een mogelijke ontbrekende stap tijdens het monsterpreparaat.
   3. Verwijder na elektroforese gels van de glasplaten en beits met Coomassie Brilliant Blue-oplossing (50% H₂O, 40% EtOH, 10% azijnzuur en R250 Coomassie Brilliant Blue) gedurende 30 minuten.
   4. Ontvlek met een oplossing bestaande uit 50% H₂O, 40% EtOH, 10% azijnzuuroplossing totdat de gelachtergrond lichtblauw lijkt.
   5. Breng ten slotte de gel over in Petri-gerechten die gedeïoniseerd water bevatten, om kleuring en rehydratie van polyacrylamidegels te bereiken. Eiwitten moeten verschijnen als blauwe banden met een transparante achtergrond.

Results

OPL en IPL werden gescheiden van de PL van een vers gelegd onbevrucht ei om hun eiwitprofielen te analyseren door SDS-PAGE. De experimentele workflow van het hele protocol wordt geïllustreerd in figuur 2. Figuur 3 toont eiwitafgifte bij verschillende Tris-concentraties (figuur 3A),verschillende pH (figuur 3B) en verschillende NaCl-concentraties (figuur 3C). De resulterende twee sublagen werden waargenomen onder het licht van de verrekijker ontleedmicroscoop en worden weergegeven in figuur 4, waar IPL doorschijnend is terwijl OPL dicht, troebel en witachtig is. Deze kenmerken kunnen deels getuigen van de efficiëntie van de scheiding van de onderlaag.

Na de scheiding werden OPL en IPL onafhankelijk gelyophiliseerd en werd hun eiwitgehalte volledig opgelost dankzij een combinatie van mechanisch slijpen, het gebruik van een anionisch wasmiddel (SDS) en een reductiemiddel (bèta-mercaptoethanol), gevolgd door koken. Na migratie in een polyacrylamidegel (SDS-PAGE elektroforese) vertonen OPL- en IPL-monsters zoals verwacht verschillende elektroforetische profielen (figuur 5).

Figuur 1: Structuur van de PL van een vers gelegd onbevrucht ei. Schematische weergave en transmissie elektronenmicroscopie micrograaf van de gehele PL in dwarsdoorsnede (persoonsgegevens, ©Plateforme IBiSA de Microscopie Electronique, Universiteit en CHRU van Tours, Frankrijk, S. Georgeault). Merk op dat dit beeld is verkregen van PL, opgesteld zoals gepresenteerd in dit protocol. OPL, buitenste perivitellinelaag; IPL, binnenste perivitelline laag. Zwarte pijlpunt geeft het continue membraan aan dat de twee onderlagen scheidt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Workflow met een samenvatting van de twee belangrijkste stappen van het protocol en voorbeelden van toepassingen. Het protocol is geoptimaliseerd voor proteomische analyse van PL-lagen, maar het kan bij sommige stappen worden gestopt voor andere toepassingen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Optimalisatie van de buffersamenstelling voor PL-bemonstering. Kortom, schone PL (n = 4) werd geïncubeerd in hetzelfde volume van de verschillende bufferoplossingen gedurende 2 uur.PL werd verwijderd en de eiwitconcentratie werd geschat door absorptie te meten op 280 nm in de resterende buffer. (A) Effect van tris-HCl-concentratie bij pH 8. (B) Effect van de pH (7 tot en met 9). (C) Effect van de NaCl-concentratie. Uit deze resultaten concludeerden we dat de buffer bestaande uit 10 mM Tris-HCl, pH 8, 50 mM NaCl het meest geschikt is omdat het eiwitverlies beperkt. De resultaten worden uitgedrukt als een gemiddelde ± standaarddeviatie van vier verschillende PL-monsters. Statistische analyses werden uitgevoerd met behulp van eenrichtings-ANOVA gevolgd door een Tukey's multiple comparisons test. P-waarde <0,05 werd als significant beschouwd (ns, niet significant; * p<0,05, *** p<0,001, **** p<0,0001). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: OPL- en IPL-kenmerken onder een verrekijker ontledende microscoop. Na de scheiding leek IPL (rechts) doorschijnend en was OPL (links) ondoorzichtig. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: SDS-PAGE analyse van gescheiden OPL en IPL van vers gelegd onbevrucht ei. 4%–20% acrylamide gel gevolgd door Coomassie briljant blauwe kleuring. De massa van standaardbanden voor moleculair gewicht wordt aangegeven in kDa. Het OPL-profiel bestaat voornamelijk uit eiwitten met een moleculaire massa >30 kDa, terwijl de belangrijkste banden die op het IPL-profiel worden gedetecteerd moleculaire massa's hebben <30 kDa. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Het succes van het huidige protocol is gebaseerd op twee kritieke stappen die onafhankelijk zijn geoptimaliseerd: de mechanische scheiding van OPL en IPL die zo min mogelijk moeten worden gedestructureerd, gevolgd door de volledige eiwitoplosbaarheid van elke onderlaag, die omgekeerd destructuring en denaturering is. Het wijst ook op enkele specifieke punten waarmee rekening moet worden gehouden om ervoor te zorgen dat elke stap succesvol wordt gehaald.

Het protocol hangt niet af van de eierschaalkleur, het eigewicht, het type productie of de genetische stam van de kip. Het hangt echter af van de versheid van het ei. Het ei ondergaat immers snel na het leggen diepgaande interne fysisch-chemische modificaties, hoewel deze veranderingen kunnen worden vertraagd wanneer de opslag onder gekoelde omstandigheden wordt uitgevoerd^14,15. Het verlies van kooldioxide door de eierschaalporiën tijdens opslag resulteert in de toename van de pH van eiwit (van 7,8 tot 9,5), terwijl sommige wateruitwisselingen plaatsvinden tussen de dooier en het wit, over de PL. Beide wijzigingen hebben een negatieve invloed op de moleculaire en histologische structuur van de PL die verzwakt en minder gespannen wordt^14,15, waarschijnlijk als gevolg van fysicochemische modificaties van het eiwitgehalte^16,17,18. Er wordt aangenomen dat de scheiding van onderlagen erg moeilijk zal worden met opgeslagen eieren, vooral als de opslag gedurende een lange periode bij kamertemperatuur wordt uitgevoerd. Tot op heden is het protocol uitgevoerd met eieren die minder dan 4 dagen bij 4 °C zijn opgeslagen en de maximale opslagduur voor een ei om efficiënt PL-sublagen te bemonsteren is nog niet bekend. Bovendien, als het doel de analyse van elke onderlaag is, is het cruciaal om onbevruchte eieren te gebruiken. Op de dag van leggen is het embryo van een bevrucht ei 23 uur oud en de ontwikkeling ervan is daarna zeer snel, als het ei wordt geïncubeerd. Inderdaad, embryonale ontwikkeling en de groei van sommige extraembryonische structuren breiden zich uit met BEHULP van PL als een substratum, dat dus snel wordt afgebroken en vervangen door de extra-mbryonische dooierzak¹⁹.

Na handmatige scheiding van de dooier en het eiwit moet de dooier worden gereinigd van eiwitsporen en van chalazae die stevig aan de PL is bevestigd. De tip is om de dooier voorzichtig op een filterpapier te rollen en uitgebreide wasbeurten van de dooier uit te voeren in gebufferde oplossingen (10 mM Tris-HCl pH 8). De pH die voor de buffer wordt gebruikt, komt overeen met de fysiologische pH van het eiwit¹⁴ en is aangetoond dat het eiwitverlies wordt geminimaliseerd (figuur 3). Het gebruik van een gekoelde buffer zal dan helpen om de PL uit de dooier te verwijderen, omdat bij 4 °C de buffer pl-verwijdering vergemakkelijkt naarmate de lipidedooier zich terugtrekt en minder vloeibaar wordt bij deze temperatuur. Extra wasbeurten maken het mogelijk om dooierresten uit de PL te verwijderen. Het is ook belangrijk om de zone die overeenkomt met de kiemschijf uit te snijden, omdat deze structuur die vrouwelijke pronucleus bevat mogelijk niet representatief is voor de PL. Het is de plaats van bevruchting en vermenigvuldiging van de embryonale cellen wanneer het ei wordt bevrucht. Het zou een bepaalde samenstelling moeten hebben die mogelijk niet representatief is voor de hele PL, en dat is de reden waarom het is verwijderd. Deze specifieke stap wordt sterk vergemakkelijkt wanneer de dooier wordt ondergedompeld in een koude buffer. Hoewel deze kiemschijfstructuur in dit protocol (buiten de doelstellingen) wordt weggegooid, kunnen specifieke analyses van dit gebied in bevruchte eieren zeer nuttig zijn voor wetenschappers die geïnteresseerd zijn in het bestuderen van de evolutie van het PL-gehalte (proteomics en activiteit) en structuur (elektronenmicroscopie), in de vroege stadia van embryogenese^19,20,21. In dit stadium is de hele PL structureel intact en kan worden verwerkt voor verdere structurele analyse door elektronenmicroscopie (figuur 2), naar stap 1.2 of naar stap 2.1 (als het doel is om de hele PL te analyseren).

Stap 1.2 moet worden uitgevoerd onder een verrekijker ontleedmicroscoop, omdat de PL erg dun en breekbaar is (ongeveer 10 μm dik). De scheiding van onderlagen is bijna onmogelijk in water of in buffer zonder minimaal zout, en eerste pogingen met behulp van deze opties hebben geleid tot ernstige PL-schade. De buffer die voor deze stap is geselecteerd, blijft dus op fysiologische pH (pH 8) en bevat 50 mM NaCl. Deze stap is zwaar en moet zorgvuldig en voorzichtig worden uitgevoerd om PL-scheuren te voorkomen. Eenmaal gescheiden, kunnen de twee sublagen gemakkelijk worden geïdentificeerd omdat ze eigenaardige fysieke kenmerken vertonen (ondoorzichtig versus doorschijnend). Een gebrek aan homogeniteit van de IPL onder het licht van de microscoop moet een onvolledige scheiding weerspiegelen en dus de aanwezigheid van de resterende vlekken van OPL die op IPL aanwezig zijn. Bovendien is het erg moeilijk om het hele membraan te behandelen en het gebruik van stukken van 2 cm x 3 cm vergroot de kans op succes aanzienlijk. De verkregen sublaag is geschikt voor histologische studie door elektronenmicroscopie (figuur 1). Het is opmerkelijk dat een specifieke lineaire structuur (0,05 tot 1 μm dik) met de naam continu membraan (CM) zichtbaar is op de micrograaf (figuur 1) en tijdens het scheidingsproces meestal aan een of de andere onderlaag blijft hechten. Eerder is gepubliceerd dat bij het gebruik van een relatief hoge zoutmoerheid voor scheiding (500 mM), de CM aan OPL⁷ is bevestigd, terwijl het gebruik van water⁵ de bevestiging van CM aan IPL zal bevorderen. In dit protocol wordt een lage zout molariteit gebruikt om de specifieke doelstellingen te bereiken (PL-onderlaag structureel intact en minimaal verlies van eiwitten), wat betekent dat deze CM waarschijnlijk geassocieerd is met IPL. Aanvullende analyse van IPL en OPL door transmissie-elektronenmicroscopie zou echter duidelijk op deze hypothese worden vermeld. PL-, OPL- of IPL-lagen die aan het einde van stap 1 zijn verkregen , kunnen ook worden gebruikt voor in vitro tests voor sperma-eibindingsanalyses²² of om de vroege stappen van embryonale ontwikkeling te analyseren^23,24.

Stap 2 verwijst naar de oplosbaarheid van het eiwitgehalte, gedeeltelijk (stap 2.1) of volledig (stap 2.2). PL en/of OPL worden eerst gelyophiliseerd om watermoleculen te verwijderen en nauwkeurige gewichtsmetingen mogelijk te maken. Pl bestaat namelijk voornamelijk uit water (88%)⁷, terwijl de droge stof hoofdzakelijk eiwitten bevat (80% tot 90% afhankelijk van studies), koolhydraten, vetten en mineralen^2,7,25. Aangezien het water in PL wordt verwijderd door vriesdrogen, dat koolhydraten in wezen worden teruggewonnen in PL-glycoproteïnen en dat vet en mineralen afkomstig zijn van dooier in wezen worden weggegooid door uitgebreide wasbeurten, wordt aangenomen dat de resulterende PL bijna uitsluitend uit eiwitten bestaat. De gewichtswaarde die na volledige lyophilisatie wordt verkregen, moet dus voornamelijk overeenkomen met eiwitten. Gelijke hoeveelheid PL, OPL en/of IPL worden vervolgens verdund in de buffer met 0,5 M NaCl. De hoge zout molariteit gecombineerd met de mechanische vernietiging van het vezelige netwerk door slijpen vergemakkelijkt sterk eiwitoplosbaarheid onder niet-denaturerende omstandigheden. Deze stap wordt gevolgd door de volledige oplosbaarheid met behulp van koken, SDS-reinigingsmiddel en het reducerende middel beta-mercaptoethanol (stap 2.2). Sommige IPL-eiwitten zijn SDS-oplosbare glycoproteïnen^25,26,27 en de belangrijkste bestanddelen van OPL zijn NaCl-oplosbaar^1,11. Met behulp van dit protocol zagen we geen resterende pellet onoplosbare eiwitten na centrifugatie, wat aangeeft dat de oplosbaarheid waarschijnlijk compleet was. Eiwitten van PL, OPL en/of IPL werden vervolgens geanalyseerd door SDS-PAGE. Resulterende eiwitprofielen zijn consistent met gepubliceerde literatuur^2,4,11,16, maar de resolutie en intensiteit van het signaal is sterk verbeterd en veel homogener tussen verschillende IPL- en OPL-onafhankelijke bemonsteringen.

Bovendien wordt kwantitatieve vergelijking tussen OPL en IPL mogelijk gemaakt dankzij de nauwkeurigheid van het gewicht dat we voor de respectieve sublagen^2,7hebben afgeleid . Bovendien zijn zowel OPL- als IPL-profielen zeer verschillend en behalve een zwakke band met 14 kDa en 75 kDa delen beide PL-sublagen niet zichtbaar banden met hetzelfde molecuulgewicht. Deze observatie bevestigt de efficiëntie van de scheiding van onderlagen zonder significante kruisbesmetting. Volgens de enige PL proteomische analyse gepubliceerd¹, moeten de meest intense banden in OPL (<30 kDa) overeenkomen met lysozym (14 kDa), vitelline membraan buitenste laag eiwit 1 (17 kDa), aviaire bèta-defensin 11 (schijnbaar molecuulgewicht van 12 kDa), terwijl de intense banden van IPL (>30 kDa) waarschijnlijk Zona-Pellucida-eiwit 1 (102 kDa) en Zona-Pellucida-eiwit 3 (47 kDa) zijn. De verdeling van de zeer overvloedige PL-eiwitten ovotransferrine (78 kDa), ovalbumine-gerelateerd eiwit X (45 kDa), ovalbumine (43 kDa)¹ tussen onderlagen moet nog worden opgehelderd. Inderdaad, het hoge molecuulgewicht van deze eiwitten (>30 kDa) suggereert dat het IPL-eiwitten zijn op basis van het SDS-PAGE-profiel, maar hun weefselspecifiekheid (eileider-uitgedrukte eiwitten) zou deze eiwitten liever associëren met OPL^28,29. Bovendien hebben sommigen een mogelijke besmetting van PL-monsters door eiwit en eigeeleiwitten gesuggereerd als gevolg van onvoldoende wasbeurten¹. Dit gebrek aan informatie is de basis voor de ontwikkeling van dit protocol, dat verder zal worden gebruikt voor diepgaande kwantitatieve proteomics van PL, OPL en IPL.

Als alternatief is het vanaf stap 2.1 en na centrifugatie om de onoplosbare materie te verwijderen mogelijk om enkele specifieke eiwitten te extraheren voor verdere biochemische en biologische karakterisering. Een dergelijke benadering is onlangs toegepast om de biologische activiteiten en/of de 3D-structuur van de twee belangrijkste componenten van de OPL, het vitellinemembraan buitenste laageiwit 1 (VMO1) en aviaire bèta-defensin 11 (AvBD11)³⁰,^31tekarakteriseren. De beschikbaarheid van deze eiwitten als gezuiverde moleculen kan ook helpen om specifieke antilichamen te produceren voor aanvullende experimenten zoals immunohistochemie of voor de ontwikkeling van kwantitatieve tests, waaronder Enzyme-Linked Immunosorbent Assays.

De twee belangrijkste beperkingen van dit protocol zijn (1) de uitdaging met scheiding van onderlagen, vooral als eieren meer dan 4 dagen bij 4 °C zijn opgeslagen en (2) het feit dat de volledige eiwitoplosbaarheid het verminderen en denatureren van buffers vereist, wat de intrinsieke biologische activiteit van de resulterende monsters aantast. Wat de eerste beperking betreft, vereist mechanische scheiding technische vaardigheden, maar kan gemakkelijk worden bereikt na 2 of 3 experimentele trainingen. Sommige IPL-kleine stukjes kunnen aan de OPL blijven zitten en vice versa, omdat beide sublagen nauw met elkaar verbonden zijn. Verontreiniging van de ene onderlaag door de andere moet echter minimaal zijn als de mechanische scheiding voorzichtig wordt uitgevoerd. Typische IPL- en OPL-SDS-PAGE-profielen na optimale scheiding van de onderlaag worden geïllustreerd in figuur 5. Met betrekking tot de tweede beperking zijn de in dit artikel gepresenteerde experimentele stappen geoptimaliseerd voor proteomische analyses, om een uitputtende lijst van eiwitten te bieden die elke onderlaag vormen. Voor verdere karakterisering van de biologische activiteiten van elk eiwit is het noodzakelijk om te stoppen bij stap 2.1.2, voordat u denatureringsomstandigheden gebruikt (stap 2.2.1, gebruik van buffer met SDS en bèta-mercaptoethanol gevolgd door koken). Het is echter opmerkelijk dat eiwitten die voortvloeien uit stap 2.1.2 alleen in zout oplosbare eiwitten zijn, terwijl zoutoplosbare eiwitten aggregaten vormen. Een optie om hun respectieve activiteit verder te beoordelen, kan zijn om zoutoplosbare eiwitten te produceren als recombinante eiwitten met behulp van heterologe systemen(E. coli,baculovirus, gist, enz.).

Dit protocol kan worden aangepast aan andere aviaire eieren voor vergelijkende studies om de originaliteit van elke soort beter te kunnen waarderen. Pl vertoont inderdaad enkele vogelspecifiekheden, zowel structureel als qua eiwitsamenstelling , waarschijnlijk als gevolg van aanpassing aan nieuwe omgevingen , maar ook aan ontwikkelingsspecificiteiten^2,6,9,32. De ontwikkeling van dit protocol dat gematigde technicity en klassieke apparatuur/materialen vereist opent nieuwe onderzoeksmogelijkheden op het gebied van vogelreproductie en speciatiestudies.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Binocular dissecting microscope	Vision Engineering, France		Model Mantis Elite
Lyophilizer	Cryotec, France		Model Cosmos 80
Mini-Protean II electrophoresis cell	Biorad, Hercules, USA	1652960	Any apparatus adapted for protein electrophoresis
Mixer Mill MM400	Retsch, Hann, Germany	20.745.0001	Mixer mill adapted for for dry, wet, and cryogenic grinding of small amounts of sample
Ultra fine dissection scissors in stainless steel length 12 cm	Dutscher, Brumath	5066
Ultra precise tip forceps anti-magnetic stainless steel 9.5x 109.3 mm	Dutscher, Brumath	327005