Methodenartikel

Visualiseren van de Calcitonine Gen-Gerelateerde Peptide Immunoreactieve Innervation van de Rat Cranial Dura Mater met Immunofluorescentie en Neural Tracing

DOI:

10.3791/61742

⸱

6 januari 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Acupuncture and Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een protocol om ruimtelijke correlatie van calcitonine gen-gerelateerde peptide (CGRP)-immunoreactieve zenuwvezels en bloedvaten in de schedel dura mater te visualiseren met behulp van immunofluorescentie en fluorescerende histochemie met respectievelijk CGRP en falloïdine. Bovendien was de oorsprong van deze zenuwvezels retrograde getraceerd met een fluorescerende neurale tracer.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het doel van deze studie was om de verdeling en oorsprong van het calcitonine gen-gerelateerde peptide (CGRP)-immunoreactieve sensorische zenuwvezels van de craniale dura mater te onderzoeken met behulp van immunofluorescentie, driedimensionale (3D) reconstructie en retrograde tracing techniek. Hier werden de zenuwvezels en bloedvaten gekleurd met behulp van immunofluorescentie- en histochemietechnieken met respectievelijk CGRP en fluorescerende falloïdine. De ruimtelijke correlatie van dural CGRP-immuoreactieve zenuwvezels en bloedvaten werd aangetoond door 3D-reconstructie. Ondertussen werd de oorsprong van de CGRP-immunoreactieve zenuwvezels gedetecteerd door neurale tracing techniek met fluorogold (FG) van het gebied rond de middelste meningeale slagader (MMA) in de craniale dura mater naar het trigeminus ganglion (TG) en cervicale (C) dorsale wortel ganglia (DRG's). Bovendien werden de chemische kenmerken van FG-gelabelde neuronen in de TG en DRG's ook samen met CGRP onderzocht met behulp van dubbele immunofluorescenten. Gebruikmakend van het transparante whole-mount monster en 3D-reconstructie, werd aangetoond dat CGRP-immunoreactieve zenuwvezels en arteriolen met falloidine-label samen lopen of afzonderlijk een dural neurovasculaire netwerk vormen in een 3D-weergave, terwijl de FG-gelabelde neuronen werden gevonden in de oogheelkundige, maxillaire en mandibulaire takken van TG, evenals de C2-3 DRGs ipsilaterale toepassing. Met deze benaderingen hebben we de distributiekenmerken van CGRP-immunoreactieve zenuwvezels rond de bloedvaten in de craniale dura mater aangetoond, evenals de oorsprong van deze zenuwvezels uit TG en DRG's. Vanuit het perspectief van de methodologie kan het een waardevolle referentie zijn voor het begrijpen van de gecompliceerde neurovasculaire structuur van de craniale dura mater onder de fysiologische of pathologische aandoening.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De craniale dura mater is de buitenste laag van hersenvliezen om de hersenen te beschermen en bevat overvloedige bloedvaten en verschillende soorten zenuwvezels1,2. Vele studies hebben aangetoond dat gesensibiliseerde craniale dura mater de belangrijkste factor kan zijn die leidt tot het optreden van hoofdpijn, waarbij de abnormale vasodilatatie en innervatie3,4,5betrokken zijn . De kennis van de neurovasculaire structuur in de craniale dura mater is dus belangrijk voor het begrijpen van de pathogenese van hoofdpijn, vooral voor migraine.

Hoewel de dura-innervatie eerder is bestudeerd met de conventionele immunohistochie , werd de ruimtelijke correlatie van zenuwvezels en bloedvaten in de craniale dura mater minder bestudeerd6,7,8,9. Om de dural neurovasculaire structuur in meer detail te onthullen, werden calcitonine gen-gerelateerde peptide (CGRP) en phalloïdine geselecteerd als de markers voor respectievelijk het kleuren van de dural zenuwvezels en bloedvaten in de hele schedel dura mater met immunofluorescentie en fluorescerende histochemie10. Het kan een optimale keuze zijn om een driedimensionale (3D) weergave van de neurovasculaire structuur te verkrijgen. Bovendien werd fluorgoud (FG) aangebracht op het gebied rond de middelste hersenvliesslagader (MMA) in de schedel dura mater om de oorsprong van CGRP-immunoreactieve zenuwvezels te bepalen, en getraceerd naar het trigeminus ganglion (TG) en cervicale (C) dorsale wortel ganglia (DRG's), terwijl de FG-gelabelde neuronen verder werden onderzocht samen met CGRP met behulp van immunofluorescentie.

Het doel van deze studie was om een effectief hulpmiddel te bieden voor het onderzoeken van de neurovasculaire structuur in de craniale dura mater voor de CGRP-immunoreactieve innervatie en de oorsprong ervan. Door gebruik te maken van de transparante whole-mount dura mater en de combinatie van de immunofluorescentie, retrograde tracing, confocale technieken en 3D-reconstructie, verwachtten we een nieuw 3D-beeld van de neurovasculaire structuur in de craniale dura mater te presenteren. Deze methodologische benaderingen kunnen verder worden gediend voor het onderzoeken van de pathogenese van verschillende hoofdpijnen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie werd goedgekeurd door de Ethische Commissie van het Institute of Acupuncture and Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences (referentienummer D2018-09-29-1). Alle procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Academy Press, Washington, D.C., 1996). Twaalf volwassen Sprague-Dawley mannelijke ratten (gewicht 220 ± 20 g) werden gebruikt in deze studie. Dieren [licentienummer SCXK (JING) 2017-0005] werden verstrekt door de National Institutes for Food and Drug Control.

1. Innervation van rat cranial dura mater

  1. Perfusies
    1. Injecteer intraperitoneaal een overdosis tribromoethanoloplossing (250 mg/kg) aan de rat om euthanasie te induceren.
    2. Zodra de adem stopt, transcardiaal perfuseren met 100 ml 0,9% normale zoutoplossing gevolgd door 250-300 ml 4% paraformaldehyde in 0,1 M fosfaatbuffer (PB, pH 7,4).
    3. Verwijder na perfusie de hoofdhuid en open de schedel om de dura mater en dorsale kant van de hersenen bloot te leggen. Ontleed vervolgens de craniale dura mater langs de hersenstam naar de olfactorische bol in het hele mount-patroon (figuur 1). Voer postfixatie uit in 4% paraformaldehyde gedurende 2 uur en cryoprotect in 25% sacharose in 0,1 M PB gedurende meer dan 24 uur bij 4 °C.
  2. Fluorescentie immunohistochie voor CGRP en falloïdine labeling
    OPMERKING: Een combinatie van fluorescerende kleuring van CGRP en falloïdine werd toegepast om de ruimtelijke correlatie van dural zenuwvezels en bloedvaten in de schedel dura mater van de rat in het hele monteringspatroon te onthullen.
    1. Spoel de craniale dura mater ongeveer 1 min. af in 0,1 M PB.
    2. Incubeer de dura mater in een blokkerende oplossing met 3% normaal ezelsserum en 0,5% Triton X-100 in 0,1 M PB gedurende 30 minuten.
    3. Breng de dura mater over in muis anti-CGRP antilichaam (1:1000) in 0,1 M PB met 1% normaal ezelsserum en 0,5% Triton X-100 's nachts bij 4 °C11.
    4. Was de dura mater de volgende dag driemaal in 0,1 M PB.
    5. Incubeer de dura mater in een gemengde oplossing van ezel antimuis Alexa Fluor 488 secundair antilichaam (1:500) en falloïde 568 (1:1000) in 0,1 M PB met 1% normaal ezelsserum en 0,5% Triton X-100 gedurende 1,5 uur bij kamertemperatuur (26 °C).
    6. Was de dura mater driemaal in 0,1 M PB.
    7. Knip de randen af en monteer deze op microscoopglaasjes (zie Materialentabel).
    8. Doe coverlips met 50% glycerine voor observatie.
  3. Observatie en opname
    1. Observeer de fluorescerende monsters onder een fluorescerende microscoop of een confocaal beeldvormingssysteem.
    2. Maak de foto's van de dura mater met de hele houder door een fluorescerende microscoop uitgerust met een digitale camera (4x, NA: 0,13) en gebruik een belichtingstijd van 500 ms. De beeldmozaïeken van de dura mater werden aangevuld met een software van fluorescerende microscoop (zie Tabel van Materialen).
    3. Maak foto's van de CGRP-immunoreactieve zenuwvezels en falloïdine-gelabelde bloedvaten in de dura mater met behulp van een confocale microscoop. De excitatie- en emissiegolflengtes waren 488 nm (groen) en 594 nm (rood). Het confocale pinhole is 110 (20x) en 105 μm (40x). De resolutie van het vastleggen van afbeeldingen is 640 x 640 pixels.
    4. Leg 20 beelden vast in 2 frames van μm van elke 40 μm dikke sectie en voer enkele in-focus beeldintegratie uit met een confocale beeldverwerkings bijbehorend softwaresysteem voor 3D-analyse als volgt: Stel Start Focal Plane | Eind brandpuntsvlak instellen | Stapgrootte | instellen Dieptepatroon | kiezen | voor het vastleggen van afbeeldingen Z-serie.
    5. Gebruik een fotobewerkingssoftware om de helderheid en het contrast van afbeeldingen aan te passen om de visualisatie te optimaliseren. Let erop dat u geen gegevens uit de afbeeldingen verwijdert.

2. Retrograde tracing studie met FG

  1. Chirurgische ingrepen
    1. Bepaal het coördinatengebied van belang in rat cranial dura mater.
    2. Bereid een microspuit van 10 μL voor en test deze met vloeibare paraffine.
    3. Verdoof de ratten met tribromoethanoloplossing (150 mg/kg) via intraperitoneale injectie. Controleer op de diepte in anesthesie door het gebrek aan reactie op teenknijpen.
    4. Scheer het hoofd van de rat met een elektrisch scheermes.
    5. Plaats stompe oorstangen tegen de rat en plaats deze op het stereotaxic-apparaat. Plaats vervolgens de mondhouder en breng oogzalf aan op de ogen.
    6. Reinig de chirurgische plaats van de hoofdhuid met 10% povidonjodium gevolgd door 75% ethanol.
    7. Maak een incisie langs de middellijn van de hoofdhuid.
    8. Verwijder het periosteum en de spierweefsels botweg van de schedel met steriele applicatoren met katoenen punt (figuur 1A).
    9. Boor een klein gaatje (~5-7 mm) met behulp van een braamboor met een ronde punt (#106) op de linker pariëtale en temporale botten boven de MMA12, en zorg ervoor dat de craniale dura mater intact bleef (Figuur 1B).
    10. Bouw een bank rond het gat met tandsilicaatcement om de verspreiding van de tracer te beperken (figuur 1C).
    11. Voeg 2 μL van 2% FG toe aan het gat rond MMA met een microspuit van 10 μL (figuur 1D).
    12. Bedek het gat met een klein stukje hemostatische spons.
    13. Plaats een stuk paraffinefilm op het gat en sluit de randen af met botwas om lekkage van tracer te voorkomen en vervuiling van de omliggende weefsels te voorkomen.
    14. Hecht de wond met steriele draad.
    15. Houd de ratten in een warme omgeving totdat ze volledig zijn hersteld.
    16. Breng de ratten terug naar hun kooien en voeg een antibioticum en pijnstiller toe aan het drinkwater.
  2. Perfusies en secties
    1. Na 7 overlevingsdagen deze ratten perfuseren zoals hierboven vermeld in de procedures in rubriek 1.1.
    2. Ontleed de TG- en C1-4 DRG's, bevestig ze vervolgens en cryoprotect ze zoals hierboven vermeld in punt 1.1.3 (Figuur 1F).
    3. Snijd de TG en DRG's op een dikte van 30 μm op een cryostaat microtome systeem in de sagittale richting en monteer op silaan gecoate glazen dia's.
  3. Dubbele immunofluorescenten voor FG- en CGRP-etikettering in de TG- en DRG's
    OPMERKING: Hoewel de FG-etikettering direct kan worden waargenomen met UV-verlichting onder kwiklamp zonder extra kleuring13,14,15, 16, werden de gelabelde neuronen met FG verder onderzocht in TG en cervicale DRG's met behulp van dubbele immunofluorescenten met FG en CGRP voor het onthullen van de oorsprong van dural CGRP-immunoreactieve zenuwvezels in de TG en DRG's.
    1. Omcirkel de secties met de histochemische pen.
    2. Incubeer de secties gedurende 30 minuten in een blokkerende oplossing met 3% normaal ezelserum en 0,5% Triton X-100 in 0,1 M PB.
    3. Breng de monsters over in de oplossing van konijn anti-fluorgoud (1:1000) en muis anti-CGRP antilichaam (1:1000) in 0,1 M PB met 1% normaal ezelsserum en 0,5% Triton X-100 's nachts bij 4 °C.
    4. Was de secties de volgende dag driemaal in 0,1 M PB.
    5. Incubeer in een gemengde oplossing van ezel anti-konijn Alexa Fluor 594 (1:500) en ezel anti-muis Alexa Fluor 488 (1:500) secundaire antilichaam in 0,1 M PB met 1% normale ezel serum en 0,5% Triton X-100 voor 1,5 uur bij kamertemperatuur.
    6. Was en breng de afdeklips aan op de secties als de procedures in de stappen 1.2.6 en 1.2.8.
  4. Observatie en opname
    1. Maak foto's van de FG-gelabelde neuronen in TG en DRG's onder UV-verlichting door een fluorescerende microscoop uitgerust met een digitale camera.
    2. Leg beelden vast van de FG- en CGRP-gelabelde neuronen in TG en DRG's onder een fluorescerende microscoop uitgerust met een digitale camera.
    3. Gebruik de bewerkingssoftware om de helderheid en het contrast van afbeeldingen aan te passen en labels toe te voegen aan de afbeeldingen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neurovasculaire structuur van de craniale dura mater
Na immunofluorescente en fluorescerende histochemische kleuring met CGRP en falloïdine werden CGRP-immunoreactieve zenuwvezels en phalloidine-gelabelde dural arteriolen en bindweefsels duidelijk aangetoond in de hele craniale dura mater in een 3D-patroon(figuur 2C,D, E, F). Het werd aangetoond dat zowel dikke als dunne CGRP-immunoreactieve zenuwvezels parallel lopen met ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In deze studie hebben we met succes de distributie en de oorsprong van CGRP-immunoreactieve zenuwvezels in de craniale dura mater aangetoond met behulp van immunofluorescentie, 3D-reconstructie en neurale tracing-benaderingen met CGRP-antilichaam en FG neurale tracer, die de histologische en chemische bewijzen leveren om het auditieve neurovasculaire netwerk beter te begrijpen.

Zoals bekend speelt CGRP een cruciale rol bij de pathogenese van migraine4,

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets bekend te maken.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie werd ondersteund door het project van national key R&d program of China (projectcode nr. 2019YFC1709103; nr. 2018YFC1707804) en National Natural Science Foundation of China (projectcode nr. 81774211; nr. 81774432; nr. 81801561).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG (H+L)Invitrogen by Thermo Fisher ScientificA21202Bescherm tegen licht; RRID: AB_141607
Brain stereotaxis instrumentNarishigeSR-50
CellSens DimensionOlympusVersie 1.1Software van fluorescente microscoop
Confocal imaging systeemOlympusFV1200
Fluorogold (FG)Fluorochrome52-9400Bescherm tegen licht
Fluorescent beeldvormingssysteemOlympusBX53
Freezing microtomeThermoMicrom International GmbH
Olympus FV10-ASW 4.2aOlympusVersie 4.2Confocal beeldverwerkingssoftwaresysteem
Micro DrillSaeyang MicrotechMarathon-N7
Mouse anti-CGRPAbcamab81887RRID: AB_1658411
Normaal ezelsserumJackson ImmunoResearch017-000-121
Phalloidin 568Molecular ProbesA12380Bescherm tegen licht
Photoshop en  IllustrationAdobeCS6Fotobewerkingssoftware
Konijn anti- FluorogoldAbcamab153RRID: AB_90738
Sprague DawleyNational Institutes for Food and Drug ControlSCXK (JING) 2014-0013
Superfrost plus microscoopglazenThermo#4951PLUS-00125x75x1mm

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kekere, V., Alsayouri, K. Anatomy, Head and Neck, Dura Mater. StatPearls. , StatPearls Publishing. Treasure Island (FL). (2020).
  2. Shimizu, T., et al. Distribution and origin of TRPV1 receptor-containing nerve fibers in the dura mater of rat. Brain Research. 1173, 84-91 (2007).
  3. Jacobs, B., Dussor, G. Neurovascular contributions to migraine: moving beyond vasodilation. Neuroscience. 338, 130-144 (2016).
  4. Dodick, D. W. A phase-by-phase review of migraine pathophysiology. Headache. 58, Suppl 1 4-16 (2018).
  5. Amin, F. M., et al. Investigation of the pathophysiological mechanisms of migraine attacks induced by pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide-38. Brain: A Journal of Neurology. 137, Pt 3 779-794 (2014).
  6. Keller, J. T., Marfurt, C. F. Peptidergic and serotoninergic innervation of the rat dura mater. The Journal of Comparative Neurology. 309 (4), 515-534 (1991).
  7. Messlinger, K., Hanesch, U., Baumgärtel, M., Trost, B., Schmidt, R. F. Innervation of the dura mater encephali of cat and rat: ultrastructure and calcitonin gene-related peptide-like and substance P-like immunoreactivity. Anatomy and Embryology. 188 (3), 219-237 (1993).
  8. Lennerz, J. K., et al. Calcitonin receptor-like receptor (CLR), receptor activity-modifying protein 1 (RAMP1), and calcitonin gene-related peptide (CGRP) immunoreactivity in the rat trigeminovascular system: differences between peripheral and central CGRP receptor distribution. The Journal of Comparative Neurology. 507 (3), 1277-1299 (2008).
  9. Eftekhari, S., Warfvinge, K., Blixt, F. W., Edvinsson, L. Differentiation of nerve fibers storing CGRP and CGRP receptors in the peripheral trigeminovascular system. The Journal of Pain: Official Journal of the American Pain Society. 14 (11), 1289-1303 (2013).
  10. Xu, D. S., et al. Characteristics of distribution of blood vessels and nerve fibers in the skin tissues of acupoint "Taichong" (LR3) in the rat. Zhen Ci Yan Jiu. 41 (6), 486-491 (2016).
  11. Cui, J. J., et al. The expression of calcitonin gene-related peptide on the neurons associated Zusanli (ST 36) in rats. Chinese Journal of Integrative Medicine. 21 (8), 630-634 (2015).
  12. Andres, K. H., von Düring, M., Muszynski, K., Schmidt, R. F. Nerve fibres and their terminals of the dura mater encephali of the rat. Anatomy and Embryology. 175 (3), 289-301 (1987).
  13. Leng, C., Chen, L., Li, C. Alteration of P2X1-6 receptor expression in retrograde Fluorogold-labeled DRG neurons from rat chronic neuropathic pain model. Biomedical Reports. 10 (4), 225-230 (2019).
  14. Huang, T. L., et al. Factors influencing the retrograde labeling of retinal ganglion cells with fluorogold in an animal optic nerve crush model. Ophthalmic Research. 51 (4), 173-178 (2014).
  15. Huang, T. L., Chang, C. H., Lin, K. H., Sheu, M. M., Tsai, R. K. Lack of protective effect of local administration of triamcinolone or systemic treatment with methylprednisolone against damages caused by optic nerve crush in rats. Experimental Eye Research. 92 (2), 112-119 (2011).
  16. Tsai, R. K., Chang, C. H., Wang, H. Z. Neuroprotective effects of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) in neurodegeneration after optic nerve crush in rats. Experimental Eye Research. 87 (3), 242-250 (2008).
  17. Iyengar, S., Ossipov, M. H., Johnson, K. W. The role of calcitonin gene-related peptide in peripheral and central pain mechanisms including migraine. Pain. 158 (4), 543-559 (2017).
  18. Russell, F. A., King, R., Smillie, S. J., Kodji, X., Brain, S. D. Calcitonin gene-related peptide: physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 94 (4), 1099-1142 (2014).
  19. Kou, Z. Z., et al. Alterations in the neural circuits from peripheral afferents to the spinal cord: possible implications for diabetic polyneuropathy in streptozotocin-induced type 1 diabetic rats. Frontiers in neural circuits. 8, 6(2014).
  20. Alarcon-Martinez, L., et al. Capillary pericytes express α-smooth muscle actin, which requires prevention of filamentous-actin depolymerization for detection. eLife. 7, 34861(2018).
  21. Wang, J., et al. A new approach for examining the neurovascular structure with phalloidin and calcitonin gene-related peptide in the rat cranial dura mater. Journal of Molecular Histology. 51 (5), 541-548 (2020).
  22. Liu, Y., Broman, J., Edvinsson, L. Central projections of sensory innervation of the rat superior sagittal sinus. Neuroscience. 129, 431-437 (2004).
  23. Liu, Y., Broman, J., Edvinsson, L. Central projections of the sensory innervation of the rat middle meningeal artery. Brain Research. 1208, 103-110 (2008).
  24. Schmued, L. C., Fallon, J. H. Fluoro-Gold: a new fluorescent retrograde axonal tracer with numerous unique properties. Brain Research. 377 (1), 147-154 (1986).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Immunofluorescent kleuringneurale traceringstechniekretrograde labelen met Fluorogoldconfocale microscopie beeldvormingtrigeminusganglioncervicale dorsale wortelganglia3D reconstructiewhole mount preparatie

Gerelateerde artikelen