Dit protocol beschrijft een doorsnijding van de oogzenuw die de oogzenuwschede bij ratten in stand houdt. Hydrostatische druk van micro-injecties in de oogzenuw genereert een volledige transsectie, waardoor hechtingsloze herpositionering van de doorgesneden oogzenuwuiteinden mogelijk is en directe targeting van het axonale compartiment in een transsectiemodel.
Methodenartikel
Omhulselbehoudende doorsnijding van de oogzenuw bij ratten om axonregeneratie en interventies gericht op het axon van de retinale ganglioncel te beoordelen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Axonen van retinale ganglioncellen (RGC) komen samen bij de kop van de oogzenuw om visuele informatie van het netvlies naar de hersenen over te brengen. Pathologieën zoals glaucoom, trauma en ischemische optische neuropathieën beschadigen RGC-axonen, verstoren de overdracht van visuele stimuli en veroorzaken verlies van gezichtsvermogen. Diermodellen die RGC-axonletsel simuleren, omvatten paradigma's voor het verbrijzelen en doorsnijden van de oogzenuw. Elk van deze modellen heeft inherente voor- en nadelen. Een verbrijzeling van de oogzenuw is over het algemeen minder ernstig dan een doorsnede en kan worden gebruikt om de axonregeneratie op de plaats van de laesie te testen. Verschillen in verbrijzelingskracht en -duur kunnen echter de weefselrespons beïnvloeden, wat resulteert in variabele reproduceerbaarheid en volledigheid van de laesie. Bij doorsnijding van de oogzenuw is er een ernstige en reproduceerbare verwonding die alle axonen volledig laeseert. Het doorsnijden van de oogzenuw verandert de bloed-hersenbarrière echter drastisch door de oogzenuwschede te schenden, waardoor de oogzenuw wordt blootgesteld aan de perifere omgeving. Bovendien kan regeneratie voorbij een doorsnijdingsplaats niet worden beoordeeld zonder de doorgesneden zenuwuiteinden opnieuw te apen. Bovendien worden duidelijke degeneratieve veranderingen en cellulaire routes geactiveerd door een verbrijzelings- of transsectieletsel.
De hier beschreven methode omvat de voordelen van zowel oogzenuwverbrijzelings- als transsectiemodellen en verzacht tegelijkertijd de nadelen. Hydrostatische druk die door micro-injectie in de oogzenuw wordt afgegeven, doorsnijdt de oogzenuw volledig met behoud van de integriteit van de oogzenuwschede. De doorgesneden uiteinden van de oogzenuw worden opnieuw aangelegd om axonregeneratietests mogelijk te maken. Een mogelijke beperking van deze methode is het onvermogen om de volledige doorsnede te visualiseren, een potentiële bron van variabiliteit. Visuele bevestiging dat het zichtbare deel van de oogzenuw is doorgesneden, is echter een indicatie van een volledige doorsnijding van de oogzenuw met 90-95% succes. Deze methode kan worden toegepast om axonregeneratiebevorderende strategieën te beoordelen in een transsectiemodel of om interventies te onderzoeken die gericht zijn op de axonale compartimenten.
Inleiding
Axonaal letsel en degeneratie komen voor in retinale ganglioncellen (RGC's) na trauma of bij neurodegeneratieve ziekten zoals glaucoom 1,2. Het verlies van RGC's en verstoring van retinofugale projecties resulteren in permanent verlies van het gezichtsvermogen3. Om de moleculaire routes te begrijpen die verantwoordelijk zijn voor de degeneratieve processen en om strategieën te ontwikkelen om axonaal en RGC-verlies te verminderen of om RGC-axonen te regenereren, zijn experimentele diermodellen gebruikt om oogzenuwbeschadiging te simuleren, waaronder oogzenuwverbrijzeling en oogzenuwtranssectiemodellen. Bij het selecteren van een experimenteel model moet men rekening houden met de voor- en nadelen van elke benadering, evenals met de moleculaire routes die door de verwonding worden geactiveerd4.
De grondgedachte voor het ontwikkelen van de hier beschreven methode is om gebruik te maken van de voordelen van oogzenuwverbrijzeling5 en transsectie6-modellen en tegelijkertijd de nadelen te verzachten. De doelstellingen van deze methode waren het genereren van een reproduceerbare oogzenuwbeschadiging waarbij alle axonen onbetwistbaar en volledig worden doorgesneden, blootstelling aan het perifere immuunsysteem wordt geminimaliseerd en de doorgesneden uiteinden van de oogzenuw gemakkelijk kunnen worden heroogst om de evaluatie van RGC-regeneratie mogelijk te maken. Bovendien is de methode ontwikkeld om gecompartimenteerde toegang tot het axonale deel van gewonde RGC's mogelijk te maken en om axonspecifieke interventies (bijv. neurotrofe factoren, cellulaire transplantaties) lokaal aan de retroorbitale oogzenuw toe te dienen.
Er zijn meerdere voordelen van deze techniek ten opzichte van alternatieve methoden. In vergelijking met een oogzenuwverbrijzeling doorsnijdt deze methode de oogzenuw volledig en betrouwbaar; Dit lost een mogelijk probleem van ongewenste axonsparende7 op. Bovendien veroorzaakt de beschreven methode een ernstig axonaal letsel dat niet afhankelijk is van de hoeveelheid en duur van de kracht die door de operator wordt uitgeoefend zoals bij een verbrijzelingsletsel, waardoor devariabiliteit 8 wordt verminderd. In tegenstelling tot gevestigde methoden voor het doorsnijden van de oogzenuw, behoudt de aanpak die in dit protocol wordt beschreven de integriteit van de oogzenuwschede. Een voordeel van het behoud van de oogzenuwschede is dat het voorkomt dat de oogzenuw wordt blootgesteld aan het perifere immuunsysteem. Bovendien worden de mechanische krachten die door de oogzenuwschede op de doorgesneden oogzenuw worden uitgeoefend, de doorgesneden zenuwuiteinden opnieuw geoogst zonder dat er uitdagende microchirurgische manipulaties nodig zijn 9,10,11. Ten slotte, met de oogzenuwschede intact, produceert de methode een fysieke ruimte tussen de stompen van de oogzenuw waarin stamcellen, neurotrofe factoren of polymeren rechtstreeks in beschadigde RGC-axonen kunnen worden ingebracht.
De oogzenuwverbrijzeling is het gouden standaardmodel waarin strategieën voor de regeneratie van de oogzenuw worden beoordeeld om de effectiviteit van behandelingen te bepalen. De grootte van de oogzenuw bij knaagdieren beperkt de mogelijke manipulaties, met name de doorsnijding en heraanpassing van de zenuw. Op het gebied van ruggenmergletsel en regeneratie is men het er echter over eens dat een volledige doorsnede het ideale model is om axonale regeneratie te onderscheiden van gespaard axon12. De hier beschreven methode verlaagt de technische barrières om regeneratieve strategieën in een oogzenuwtranssectiemodel te beoordelen. Als zodanig zou dit model kunnen worden gebruikt om veelbelovende strategieën te valideren die zijn geïdentificeerd in paradigma's van oogzenuwverbrijzeling met een doorsnijding van de oogzenuw. Aangezien dit model zich rechtstreeks richt op het axonale compartiment, maakt het bovendien studies mogelijk van interventies op gewonde volwassen RGC-axonen en de mechanismen die verantwoordelijk zijn voor axonale degeneratieve en regeneratieve processen.
Het model van oogzenuwdoorsnede dat in deze studie wordt beschreven, doorsnijdt de oogzenuw volledig met behoud van de oogzenuwschede. Deze nieuwe benadering is geschikt voor experimenten die gericht zijn op het beoordelen van axonregeneratie in een transsectiemodel zonder de noodzaak van het technisch uitdagende proces van het opnieuw apen van de oogzenuwuiteinden. Aspecten van de techniek zijn vergelijkbaar met het uitvoeren van een oogzenuwverbrijzeling; Daarom kan de aanpak worden uitgevoerd door operators die ervaring hebben met een oogzenuwverbrijzeling. De chirurgische aanpak vereist geen speciaal ontworpen instrumenten en kan worden aangevuld met direct verkrijgbare chirurgische instrumenten en een micro-injectiesysteem, waardoor het toegankelijk en economisch is.
Protocol
Procedures met dieren werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van het Veterans Affairs San Diego Healthcare System. Chirurgische instrumenten en oplossingen werden voorafgaand aan de operatie gesteriliseerd om postoperatieve infecties en complicaties te beperken.
1. Chirurgische techniek
- Voer experimenten uit met behulp van aseptische technieken en volgens instellingsspecifieke protocollen voor het gebruik van dieren.
- Steriliseer instrumenten en materialen die in contact komen met levende weefsels om infecties te voorkomen, vermijd een negatieve invloed op het dierenwelzijn en minimaliseer mogelijke negatieve invloeden op het onderzoek. Reinig chirurgische instrumenten grondig met water en wasmiddel of enzymatische producten om vreemde materialen te verwijderen en steriliseer ze door stoom of flitssterilisatie.
- Aliquot vloeistoffen in steriele recipiënten in een weefselkweekkap. Steriliseer de microliterspuit door deze te spoelen met 70% ethanol en te spoelen met steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
2. Anesthesie
- Verdoof ratten met behulp van een isofluraan-verdampersysteem. Verdamp isofluraan met een concentratie van 4,5% met behulp van zuurstof van medische kwaliteit met een snelheid van 1 l/min in een aangesloten anesthesiebox. Plaats het dier in de anesthesiebox totdat de ademhaling vertraagt en het dier verdoofd is.
OPMERKING: Deze eerste stap met behulp van anesthesie met een gasverdoving is niet nodig als de bediener vertrouwd en vertrouwd is met het toedienen van injecteerbare anesthetica aan niet-verdoofde dieren. - Zuig een voldoende hoeveelheid van een verdovingscocktail bestaande uit ketamine (50 mg/kg), xylazine (2,6 mg/kg) en acepromazine (0,5 mg/kg) op in een tuberculinespuit van 30 G. Haal het verdoofde dier uit de anesthesiebox. Dien de injectie van anesthesie intraperitoneaal toe om tijdens de procedure een consistente diepte van sedatie te bereiken en breng het dier terug naar zijn kooi.
- Begin de procedure wanneer een teenbeknelling geen reactie oproept. Evalueer het dier op diepte en ademhalingssnelheid en knijp elke 5 minuten in de teen tijdens de procedure om ervoor te zorgen dat er geen pijn is.
- Na voltooiing van de operatie verwijdert u het dier uit het stereotactische frame. Dien een subcutane injectie toe met zoutoplossing (3 ml), ampicilline (0,15-0,2 mg/kg) en banamine (2,5-5 mg/kg) om analgesie en vochtondersteuning te bieden. Breng het dier over naar een verwarmde couveuse om de lichaamstemperatuur op peil te houden.
3. Chirurgische aanpak
- Plaats de rat (7-8 weken oud, Fischer 344 stam) in een stereotactisch hoofdframe en op een verwarmd kussen. Plaats het stereotactische frame met de rattenkop naar links van de chirurg gericht en centreer de linkeroogkas in het chirurgische gezichtsveld.
- Breng op het linkeroog een druppel proparacaïne aan en reinig het oog door 5% povidon-jodium op het ooglid en het oog aan te brengen. Smeer oogzalf op het hoornvlies van beide ogen om het vocht van het hoornvlies op peil te houden en staarvorming te voorkomen.
- Breng een 4-0 polyglactine-hechting door de epidermis van het bovenste ooglid naar het centrale aspect van de ooglidrand, en gebruik deze hechtdraad voor een tijdelijke tarsorragie in latere stappen. Gebruik de hechtdraad om het ooglid naar voren te brengen en de superieure fornix bloot te leggen.
- Plak de polyglactine-hechtdraad vast aan het stereotactische frame om constante tractie en belichting toe te passen. Vermijd overmatige tractie, omdat dit de blootstelling van de retroorbitale inhoud kan beperken.
- Gebruik een Colibri-tang om het superieure bindvlies op te tillen en snijd het bindvlies langs de limbus in met een Vannas-schaar. Maak een peritomie van 4 uur langs de bovenste limbus.
- Breng een lichte inferieure tractie aan op de bol door een lusvormige polypropyleen hechtdraad langs de bovenste limbus te plaatsen met de vrije uiteinden onder de bol. Restweefsel langs de superieure limbus na de peritomie is voldoende om tractie op de hechtlus te bieden zonder dat de hechtdraad door de sclera of limbus hoeft te worden geleid.
- Zet de uiteinden van de lus vast met een bulldogklem en laat de klem vrij in de lucht bungelen. Het gewicht van de klem zal een inferieure tractie op de wereldbol uitoefenen en meer van de retroorbitale ruimte blootleggen.
- Stompe ontleed met Vannas-schaar langs de sclera langs het achterste aspect van de bol en onder de superieure rectus. Verwijder de superieure rectusspieren van de bol door de spierpees door te knippen met een Vannas-schaar om toegang te krijgen tot de retroorbitale ruimte.
4. Toegang tot de oogzenuw
- Stomp ontleed met Dumont #5/45 pincet langs het temporele aspect van de achterste bol en identificeer de superieure laterale vortexader. Verdere stompe ontleed de neus van de superieure laterale vortexader om de orbitale spierkegel rond de oogzenuw bloot te leggen en voortijdige beschadiging van de oogzenuw te voorkomen. Vermijd verwonding van de vortexader, omdat dit aanzienlijke bloedingen kan veroorzaken. Als er een bloeding optreedt, kan een applicator met wattenstaafjes worden aangebracht totdat het bloeden stopt.
- Gebruik de Dumont #5/45 pincet om de punt voorzichtig in het temporele aspect van de orbitale spierkegel te steken en open de tang evenwijdig aan de loop van de spiervezels om de oogzenuw te onthullen. Gebruik de tang om de spiervezels die over de oogzenuw liggen zijdelings te verplaatsen en de zenuw volledig bloot te leggen. Zorg ervoor dat alleen de oogzenuwschede de oogzenuw bedekt, aangezien resterende spiervezels voorkomen dat de getrokken glazen capillaire pipet gemakkelijk in de oogzenuw doorboort.
- Houd de blootheid van de zenuw in stand door twee Dumont #5/45 tangen langs beide laterale aspecten van de zenuw te plaatsen en de tang te openen. De mate van blootstelling moet het mogelijk maken om de oogzenuw 1,5-2,0 mm achter de bol te verpletteren en om een getrokken glazen capillaire pipet vanuit het dorsale aspect in de oogzenuw in te brengen.
5. Transectie van de oogzenuw in de oogschede
- Gebruik een Dumont #5/45-tang om de uiteinden aan weerszijden van de oogzenuw ten minste 1,5-2,0 mm achter de bol te plaatsen. Zorg ervoor dat de uiteinden van de tang de diameter van de zenuw overspannen. Sluit de tang gedurende 5 s volledig af om de oogzenuw te verpletteren en noteer de positie van de verbrijzelingsplaats.
- Vul met een spuit van microliter een glazen getrokken capillaire pipet met 1-2 μl PBS en bevestig de pipet aan een pipethouder. Monteer de pipethouder op een micromanipulator en bevestig de micromanipulator op het stereotactische frame.
- Pas het micro-injectiesysteem aan om bij elke druk op de knop een enkele puls van 4 ms af te geven bij een druk van 20 psi. Plaats de pipet in het operatieveld.
- Gebruik onder de operatiescoop een #55-tang om de pipetpunt te breken en af te schuinen tot een grootte (~20-30 μm diameter) die een klein volume kan afleveren, maar groot genoeg om voldoende stijfheid te bieden om de oogzenuwschede binnen te dringen. Bevestig de doorgankelijkheid van de pipetpunt door een enkele puls te geven en te kijken of er vloeistof is bij de pipetpunt.
- Verfijn de positie van de pipetpunt tot net boven de plaats van de oogzenuwverbrijzeling in het midden van de oogzenuw en in contact met de oogzenuwschede. Noteer de verticale positie van de pipet op de micromanipulator om later een diepte van 200 μm te bepalen.
- Laat de pipet zakken terwijl u de punt onder de operatiescoop observeert totdat de pipet de oogzenuw binnendringt. Als de pipetpunt buigt en niet stijf genoeg is om de oogzenuwschede binnen te dringen, trekt u de pipet terug en gebruikt u een pincet #55 om de lengte te verkleinen en de diameter van de pipetpunt te vergroten. Nadat de pipetpunt is afgesteld, probeert u opnieuw met de pipet de oogzenuwschede binnen te dringen.
- Bij het binnendringen in de oogzenuw met de pipetpunt, trekt u de pipet indien nodig terug. De positie van de pipetpunt, zoals aangegeven door de stereotactische micromanipulator, moet 200 μm onder het oppervlak van de oogzenuw zijn vanaf de beginpositie vermeld in stap 5.5.
- Terwijl u de oogzenuw onder de operatiescoop observeert, past u pulsen van hydrostatische druk toe met het micro-injectiesysteem. Terwijl pulsen worden toegepast, moet een lineaire scheiding tussen de distale en proximale uiteinden van de oogzenuw worden opgemerkt om de doorsnijding van de oogzenuw te verifiëren.
OPMERKING: Een injectievolume van 250-500 nL is over het algemeen voldoende om de kracht te leveren die nodig is om de oogzenuw te transecteren. Injecties die meer dan 1 μl vereisen, kunnen erop wijzen dat de injectieplaats moet worden verplaatst. Grotere hoeveelheden die in het intacte parenchym worden geïnjecteerd, veroorzaken mogelijk geen extra RGC-schade, aangezien de methode de oogzenuw volledig doorsnijdt, maar het is waarschijnlijker dat ze langs de bundels van de oogzenuw volgen. Het niet waarnemen van een lineaire doorsnede van de oogzenuw ondanks injectie van een voldoende vloeistofvolume duidt waarschijnlijk op een verkeerde positionering van de pipet op de plaats van de verbrijzeling en de noodzaak van herpositionering. Een verhoging van de injectiedruk met 50% kan ook nodig zijn.
6. Afsluiting en herstel
- Trek de pipet terug en verwijder de intrektang Dumont #5/45. Breng het oog terug naar een neutrale positie door de bulldogklem en de lusvormige polypropyleen hechtdraad van de wereldbol te verwijderen.
- Verplaats het bindvlies naar de limbus van het hoornvlies en zorg ervoor dat het omgekeerd bindvlies wordt losgemaakt om een goede aanhechting van het weefsel en genezing mogelijk te maken. Breng oogheelkundige topische antibiotische zalf aan op het oog.
- Verwijder de tape van de ooglid 4-0 polyglactine-hechtdraad en houd de hechtdraad op zijn plaats voor gebruik voor een tijdelijke tarsorrhaphy. Steek de hechtdraad door de ooglidrand van het onderste ooglid, door het subcuticulaire gebied inferieur en verlaat het via de opperhuid. Bind de hechtdraad vast met net genoeg druk om het oog te sluiten.
- Dien postoperatieve pijnstillers toe volgens de institutionele protocollen en de richtlijnen van de dierenverzorgingsautoriteit. Huisvesting van het dier zelfstandig in een verwarmde kooi om te herstellen na de operatie. Plaats geen beddengoed in de herstelkooi om onbedoelde aspiratie te voorkomen.
Resultaten
Doorsnede van de oogzenuw resulteert doorgaans in het apoptotisch verlies van 80-90% van de geblesseerde RGC's binnen 14 dagen na het letsel. De beschreven techniek doorsnijdt de oogzenuw met behoud van de integriteit van de oogzenuwschede (Figuur 1). De mate van RGC-verlies is vergelijkbaar met traditionele oogzenuwtranssectie- en oogzenuwverbrijzelingsmodellen met als voordeel dat de doorgesneden zenuwuiteinden na transsectie moeiteloos worden aangebracht met de hier beschreven methode (Figuur 2). Het op deze manier opnieuw verbinden van de doorgesneden oogzenuwuiteinden maakt evaluatie van RGC-axonale regeneratie in een transsectiemodel mogelijk door een substraat te bieden waarop axonen kunnen groeien en zonder de noodzaak van microchirurgische manipulatie om de doorgesneden zenuwuiteinden opnieuw te verbinden (Figuur 3). Anterograde tracering van RGC-axonen met choleratoxine B-subeenheid (CTB) toont aan dat CTB-positieve axonen volledig worden doorgesneden na een omhulsel dat de doorsnijding van de oogzenuw behoudt (Figuur 4). Door de oogzenuwschede te behouden tijdens het doorsnijden van de oogzenuw ontstaat ook een afgesloten ruimte waarin onderzoeksmateriaal, zoals neurotrofe factoren of cellen, kan worden afgeleverd bij beschadigde RGC-axonen en op zijn plaats kan worden gehouden (Figuur 5). Tijdens de eerste fasen van de training is er een verwacht slagingspercentage van 60-70% van de totale doorsnijding. Met ervaring is het slagingspercentage van de totale doorsnede ongeveer 90-95%.
Figuur 1: Transectie van de oogzenuw met behoud van de oogzenuwschede. (A) Foto van het operatieveld dat de blootstelling van de intacte oogzenuw vóór de transsectie aantoont. (B) Foto van de oogzenuw na doorsnijding. Een fijne glazen pipet doorboorde de oogzenuwschede op de doorsnijdingsplaats en bracht een celsuspensie (troebele oplossing) af in de ruimte tussen de uiteinden van de oogzenuw. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Verlies van retinale ganglioncellen na een oogzenuwschede met behoud van de doorsnijding van de oogzenuw. Representatieve platte ramen van het hele netvlies komen uit ogen met (A) een intacte oogzenuw, (B) een oogzenuwschede die de doorsnijding van de oogzenuw behoudt, (C) een traditionele doorsnijding van de oogzenuw, of (D) oogzenuwverbrijzeling 14 dagen eerder werden immunogelabeld voor gammasynucleïne (SNCG). Beelden werden verkregen van een fluorescentiemicroscoop met behulp van een 10x-objectief, gecorrigeerd voor schaduw en samengevoegd om een enkel beeld te genereren. Het verlies van retinale ganglioncellen (RGC) door het hele netvlies was duidelijk in beschadigde ogen. Inzetstukken tonen beelden met een hogere vergroting van het netvlies en vertonen een significant verlies van RGC's na beschadiging van de oogzenuw. (E) Kwantificering van de RGC-overleving toont significant RGC-verlies aan na beschadiging van de oogzenuw in vergelijking met controle van intacte oogzenuwen. *p< 0,05 ten opzichte van intact; eenrichtings-ANOVA met post-hoc Tukey-test. n = 3 dieren per groep; foutbalken vertegenwoordigen SD. SP-ONT, schede-behoudende doorsnijding van de oogzenuw; ONT, doorsnijding van de oogzenuw; ONC, oogzenuw verbrijzeling. Schaalbalken = 1.000 μm. Schaalbalken in inzetstukken = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: Secties van oogzenuwen na beschadiging van de oogzenuw. Representatieve beelden van longitudinale doorsnede door oogzenuwen 14 dagen na (A-C) een oogzenuwschede met behoud van transsectie, (D-F) traditionele oogzenuwtranssectie of (G-I) oogzenuwverbrijzeling. (A,D,G) Immunolabeling voor gliaal fibrillair zuur eiwit (GFAP) bakent de omvang van de laesie af, terwijl (B,E,H) DNA-labeling met 4′,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) aaneengesloten cellulariteit aantoont langs de lengte van de oogzenuw en binnen de plaats van de laesie. (C,F,I) Samengevoegde afbeeldingen die de lokalisatie van GFAP-positief neuraal weefsel en cellulariteit op de plaats van de laesie aantonen. Schaalbalken = 200 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: Doorsnede van een oogzenuw na een oogzenuwschede met behoud van de doorsnijding van de oogzenuw. Representatieve beelden van een longitudinale doorsnede door een oogzenuw 14 dagen na een oogzenuwschede met transsectie met anterograde axontracering met een intravitreale choleratoxine B-subeenheid (CTB)-injectie. (A) Er kan volledige laesie van CTB-gelabelde RGC-axonen worden waargenomen die zich uitstrekken van de bol (links) naar de hersenen (rechts). (B) Immunolabeling voor gliaal fibrillair zuur eiwit (GFAP) bakent een uitgebreide laesie af die de gehele diameter van de oogzenuw omvat. (C) DNA-labeling met 4′,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) toont cellulariteit aan op de plaats van de laesie. (D) Een samengevoegd beeld dat de lokalisatie van CTB-gelabelde axonen, GFAP-positief neuraal weefsel en cellulariteit op de plaats van de laesie aantoont. Schaalbalken = 200 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5: Longitudinale doorsnede van een doorgesneden oogzenuw die een celtransplantaat heeft gekregen. Representatieve beelden van een longitudinale doorsnede door een oogzenuw 14 dagen na een oogzenuwschede met behoud van doorsnede en transplantatie van neurale stamcellen (NSC's) die het fluorescerende eiwit tdTomato tot expressie brengen. (A) Immunolabeling voor gliaal fibrillair zuur eiwit (GFAP) toonde volledige scheiding van de doorgesneden uiteinden van de oogzenuw aan. (B) NSC's die tdTomato tot expressie brengen, bevonden zich in de ruimte die door de beschreven techniek was gecreëerd en bleven na transplantatie overleven. (C) Getransplanteerde NSC's werden direct aangebracht op beide doorgesneden uiteinden van de doorgesneden oogzenuw. Schaalbalken, 200 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussie
Chirurgische ingrepen die het transsectiemodel van de oogzenuw beschrijven zijn eerder gepubliceerd6. De technieken die in die protocollen worden beschreven, omvatten echter het insnijden van de meningeale schede om de oogzenuw te transecteren. Om de regeneratie van RGC-axonen in eerdere transsectiemodellen te beoordelen, waren bovendien uitdagende microchirurgische manipulaties nodig om ofwel de doorgesneden oogzenuwuiteinden ofwel een perifeer zenuwtransplantaat aan de proximale oogzenuwstomp te bevestigen10,13. Het hier beschreven protocol verstoort minimaal de oogzenuwschede tijdens het doorsnijden van de oogzenuw en maakt evaluaties van RGC-axonregeneratie in een transsectiemodel mogelijk zonder de noodzaak van technisch uitdagende microchirurgische manipulaties.
Verschillende stappen zijn van cruciaal belang in dit protocol. Er moet voor worden gezorgd dat de oogslagader en het vaatstelsel dat de oogzenuwkop voedt, niet worden beschadigd. Daarom moet stap 5.1 ten minste 1,5-2,0 mm achter de bol worden voltooid. Als er schade aan de oogslagader optreedt en de bloedtoevoer naar het netvlies wordt verstoord, moet het oog worden uitgesloten van verdere experimenten, omdat phthisis waarschijnlijk zal volgen. Tijdens de stappen 5.4-5.6 is het belangrijk om de integriteit van de oogzenuwschede te behouden en de grootte van de opening waardoor de glazen pipet de oogzenuw binnenkomt te minimaliseren. Hierdoor ontstaat een goede afdichting rond de pipetpunt om vloeistofreflux te verminderen en kan voldoende hydrostatische druk worden gegenereerd om de oogzenuw te doorsnijden. Het afschuinen van de punt van de glazen pipetten zal het gemak verbeteren waarmee de pipet de oogzenuw binnendringt zonder nevenschade te veroorzaken.
Er zijn mogelijke wijzigingen die exploitanten kunnen aanbrengen om de toegankelijkheid van deze methode te verbeteren. De beschreven procedures omvatten minimale dissectie en verwijdering van orbitaal weefsel met behoud van de aangezichts- en trigeminuszenuw. Hoewel dit de morbiditeit en het risico op bloedingen vermindert, kunnen weefsels zoals orbitaal vet en de traanklier de visualisatie van cruciale structuren beperken. Zorgvuldige verwijdering van weefsel dat het operatieveld blokkeert, kan nodig zijn om de visualisatie te verbeteren, vooral bij oudere dieren. Een laterale benadering kan ook worden gebruikt om de toegang tot de oogzenuw te verbeteren. Een laterale dissectie brengt echter het risico met zich mee dat andere structuren, waaronder de nervus trigeminus, meer betrokken zijn en zijn eigen uitdagingen kunnen opleveren voor het aansturen van instrumenten voor injecties.
Een mogelijke beperking van deze methode is het onvermogen om de oogzenuw direct te manipuleren en de gehele doorsnede volledig te visualiseren. Daarom bestaat de mogelijkheid van een onvolledige doorsnede. We hebben echter gezien dat visuele bevestiging van het scheiden van de zenuwuiteinden tijdens stap 5.8 een betrouwbare indicator is voor een succesvolle en volledige transsectie. Als de zenuwuiteinden niet uit elkaar komen, moet het verplaatsen van de injectiepipet of het verhogen van de druk van de injectie met 50% voldoende kracht leveren om de zenuw volledig te transecteren.
Ten opzichte van de bestaande methoden behoudt deze aanpak de integriteit van de oogzenuwschede. Bij het behoud van de integriteit van de oogzenuwschede worden de uiteinden van de doorgesneden oogzenuw niet blootgesteld aan de orbitale omgeving en het perifere immuunsysteem, waardoor de blootstelling aan immuunfactoren die mogelijk de RGC-responsen kunnen beïnvloeden, wordt beperkt. Bovendien creëert het behoud van de integriteit van de oogzenuwschede tijdens het doorsnijden van de oogzenuw een afgesloten fysieke ruimte die wordt begrensd door de uiteinden van de oogzenuw en de oogzenuwschede. Gelokaliseerde afgifte van neurotrofe factoren, cellen of polymeren aan het axonale compartiment van de gewonde RGC's kan worden bereikt door te injecteren in de nieuw gevormde ruimte. 14 Als alternatief kan RGC-axonregeneratie worden geëvalueerd in een transsectiemodel door de doorgesneden uiteinden van de oogzenuw anastomose te laten zijn zonder dat er uitdagende microchirurgische technieken nodig zijn.
Toepassingen van deze methode omvatten de evaluatie van het beschadigde RGC-axonale compartiment met axonspecifieke interventies om routes te identificeren die verantwoordelijk zijn voor axonale degeneratie en axonaal verlies na een transsectieletsel te voorkomen. Bovendien maakt deze methode studies van RGC axonale regeneratie in een transsectiemodel toegankelijk voor de bredere onderzoeksgemeenschap door de noodzaak van technisch moeilijke oogzenuwanastomoseprocedures weg te nemen. Interventies die gericht zijn op het bevorderen van RGC-axonregeneratie kunnen worden geëvalueerd met dit model voor ernstige verwonding en consistente en reproduceerbare resultaten opleveren zonder dat u zich zorgen hoeft te maken over gespaard axonen.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen concurrerende of belangenconflicten om bekend te maken.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door een K12 Career Development-beurs (5K12EY024225-04, National Eye Institute), een P30-kernbeurs (P30EY022589, National Eye Institute), een Mentoring for the Advancement of Physician Scientists-prijs (American Glaucoma Society) en een onbeperkte subsidie van Research to Prevent Blindness (New York, NY).
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 4-0 Polyglactin hechtdraad | Ethicon | J315H | |
| 9-0 Polypropyleen hechtdraad | Ethicon | 1754G | |
| Acepromazine | Butler | 003845 | 0.5-4 mg/kg Voorraadconcentratie: 10 mg/mL Uiteindelijke concentratie: 0,25 mg/mL |
| Ampicilline | Sandoz | 0781-3404-85 | 80-100 mg/kg Uiteindelijke concentratie: 50 mg/mL |
| Anesthesiesysteem | VetEquip | 901806 | |
| Dierlijke incubator | Precision Incubators | Chick Chalet II | |
| Banamine | Schering-Plough | 0061-0851-03 | 2.5-5 mg/kg Voorraadconcentratie: 50 mg/mL Uiteindelijke concentratie: 0,5 mg/mL |
| Borosiliekaatglazen capillairen | World Precision Instruments | 1B150F-4 | |
| Colibri-tang | Katena | K5-1500 | |
| Dumont #5/45-tang | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Warmtetherapiepomp | Kent Scientific | HTP-1500 | |
| Isofluraan | Covetrus | 29404 | |
| Johns Hopkins Bulldog-klem | Roboz | RS-7440 | |
| Ketamine | Putney | 26637-411-01 | 40-80 mg/kg Voorraadconcentratie: 100 mg/mL Uiteindelijke concentratie: 25 mg/mL |
| Micro-injectiesysteem (Picospritzer II) | General Valve, Inc | ||
| Microliter spuit 5 µL | Hamilton | 88000 | |
| Micropipet puller | Sutter Instrument Co. | Model P-77 Brown-Flaming | |
| Neomycine/Polymyxine B sulfates/Bacitracine Zink Oogzalf | Bausch + Lomb | ||
| PBS | Millipore | BSS-1005-B | |
| Povidon-jodium | Healthpets | BET16OZ | |
| Proparacaine hydrochloride 0,5% | Bausch + Lomb | ||
| Ringers | Abbott | 04860-04-10 | 2-3 mL/injectie |
| Stereotaxisch frame | Kopf | ||
| Chirurgische microscoop | Zeiss | ||
| Vannas-schaar | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Xylazin | Lloyd | 0410 | 2.5-8 mg/kg Voorraadconcentratie: 100 mg/mL Uiteindelijke concentratie: 5,8 mg/mL |
Referenties
- Quigley, H. A. Optic Nerve Damage in Human Glaucoma. Archives of Ophthalmology. 99 (4), 635(1981).
- Steinsapir, K. D., Goldberg, R. A. Traumatic optic neuropathy: An evolving understanding. American Journal of Ophthalmology. 151 (6), 928-933 (2011).
- Kerrigan-Baumrind, L. A., Quigley, H. A., Pease, M. E., Kerrigan, D. F., Mitchell, R. S. Number of ganglion cells in glaucoma eyes compared with threshold visual field tests in the same persons. Investigative Ophthalmology and Visual Sciences. 41 (3), 741-748 (2000).
- Agudo, M., et al. Time course profiling of the retinal transcriptome after optic nerve transection and optic nerve crush. Molecular Visison. 14, 1050-1063 (2008).
- Cameron, E., Xia, X., Galvao, J., Ashouri, M., Kapiloff, M., Goldberg, J. Optic nerve crush in mice to study retinal ganglion cell survival and regeneration. Bio-Protocol. 10 (6), 139-148 (2020).
- Magharious, M. M., D'Onofrio, P. M., Koeberle, P. D. Optic nerve transection: A model of adult neuron apoptosis in the central nervous system. Journal of Visualized Experiments. (51), e2241(2011).
- Fischer, D., Harvey, A. R., Pernet, V., Lemmon, V. P., Park, K. K. Optic nerve regeneration in mammals: Regenerated or spared axons. Experimental Neurology. 296, 83-88 (2017).
- Kim, J., Sajid, M. S., Trakhtenberg, E. F. The extent of extra-axonal tissue damage determines the levels of CSPG upregulation and the success of experimental axon regeneration in the CNS. Science Report. 8 (1), 1-10 (2018).
- Inoue, T., Hosokawa, M., Morigiwa, K., Ohashi, Y., Fukuda, Y. Bcl-2 overexpression does not enhance in vivo axonal regeneration of retinal ganglion cells after peripheral nerve transplantation in adult mice. Journal of Neuroscience. 22 (11), 4468-4477 (2002).
- Fischer, D., Heiduschka, P., Thanos, S. Lens-injury-stimulated axonal regeneration throughout the optic pathway of adult rats. Experimental Neurology. 172 (2), 257-272 (2001).
- Cui, Q., Harvey, A. R. CNTF promotes the regrowth of retinal ganglion cell axons into murine peripheral nerve grafts. Neuroreport. 11 (18), 3999-4002 (2000).
- Tuszynski, M. H., Steward, O. Concepts and methods for the study of axonal regeneration in the CNS. Neuron. 74 (5), 777-791 (2012).
- You, S. W., et al. Large-scale reconstitution of a retina-to-brain pathway in adult rats using gene therapy and bridging grafts: An anatomical and behavioral analysis. Experimental Neurology. 279, 197-211 (2016).
- Wang, D., et al. Localized co-delivery of CNTF and FK506 using a thermosensitive hydrogel for retina ganglion cells protection after traumatic optic nerve injury. Drug Delivery. 27 (1), 556-564 (2020).
Herprints en machtigingen
Dit artikel is gepubliceerd
Video binnenkort beschikbaar