Intravitreale injectie en kwantificering van infectieparameters in een muismodel van bacteriële endoftalmitis

Summary

We beschrijven hier een methode van intravitreale injectie en daaropvolgende bacteriële kwantificering in muismodel van bacteriële endoftalmitis. Dit protocol kan worden uitgebreid voor het meten van gastheer immuunresponsen en bacteriële en gastheer genexpressie.

Abstract

Intraoculaire bacteriële infecties vormen een gevaar voor het gezichtsvermogen. Onderzoekers gebruiken diermodellen om de gastheer- en bacteriële factoren en immuunresponstrajecten in verband met infectie te onderzoeken om levensvatbare therapeutische doelen te identificeren en om geneesmiddelen te testen om blindheid te voorkomen. De intravitreale injectietechniek wordt gebruikt om organismen, drugs of andere stoffen rechtstreeks in de glasholte in het achterste segment van het oog te injecteren. Hier hebben we deze injectietechniek aangetoond om infectie in het muizenoog te starten en de techniek van het kwantificeren van intraoculaire bacteriën. Bacillus cereus werd gekweekt in de hersenen hart infusie vloeibare media voor 18 uur en opnieuw geschorst tot een concentratie 100 kolonie vormen eenheden (CFU)/0.5 μL. Een C57BL/6J muis werd verdoofd met behulp van een combinatie van ketamine en xylazine. Met behulp van een picolitermicroinjector en glazen capillaire naalden werd 0,5 μL van de Bacillus-suspensie in het middenglas van het muizenoog geïnjecteerd. De contralaterale controle oog werd ofwel geïnjecteerd met steriele media (chirurgische controle) of werd niet geïnjecteerd (absolute controle). Na 10 uur na infectie werden muizen geëuthanaseerd en werden de ogen geoogst met steriele chirurgische pincet en in een buis geplaatst met 400 μL steriele PBS en 1 mm steriele glazen kralen. Voor ELISA's of myeloperoxidasetesten werd eiwitaseremmer aan de buizen toegevoegd. Voor RNA-extractie is de juiste lysisbuffer toegevoegd. Ogen werden gehomogeniseerd in een weefsel homogenisator voor 1-2 minuten. Homogenaten werden serieel verdund 10-voudig in PBS en track verdund op agar platen. De rest van de homogenaten werd opgeslagen bij -80 °C voor extra tests. Platen werden 24 uur lang geïncubeerd en CFU per oog werd gekwantificeerd. Deze technieken resulteren in reproduceerbare infecties in de ogen van de muis en vergemakkelijken kwantificering van levensvatbare bacteriën, de gastheer immuunrespons, en omica van gastheer en bacteriële genexpressie.

Introduction

Bacteriële endoftalmitis is een verwoestende infectie die ontstekingen veroorzaakt, en, indien niet goed behandeld, kan resulteren in verlies van gezichtsvermogen of blindheid. Endophthalmitis is het gevolg van de binnenkomst van bacteriën in het binnenste van het oog^1,2,3,4,5. Eenmaal in het oog, bacteriën repliceren, produceren toxines en andere schadelijke factoren, en kan onomkeerbare schade aan delicate netvliescellen en weefsels veroorzaken. Oculaire schade kan ook worden veroorzaakt door ontsteking, ....

Protocol

Alle procedures werden uitgevoerd naar aanleiding van de aanbevelingen in de Gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren en de Association for Research in Vision and Ofhthalmology Statement for the Use of Animals in Oogheelkundig en Vision Research. De protocollen werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van de Universiteit van Oklahoma Health Sciences Center (protocolnummers 15-103, 18-043 en 18-087).

1. Steriele glazen naalden

1. Zet de naaldpipettrekker aan.
2. Pas de heater-knop aan totdat het display 12.6 toont.
3. Open de deur en voer de 5 μL cap....

Results

Het genereren van een reproduceerbaar entmateriaal en nauwkeurigheid van de intravitreale injectieprocedure zijn belangrijke stappen in het ontwikkelen van modellen van microbiële endoftalmitis. Hier hebben we aangetoond dat de intravitreal injectie procedure met behulp van Gram-positieve Bacillus cereus. We injecteerden 100 CFU/0,5 μL B. cereus in het middenglas van vijf C57BL6 muizen. Na 10 uur nainfectie zagen we intraoculaire groei van B. cereus tot ongeveer 1,8 x 10⁵ CFU/oog.

Discussion

Zelfs met de beschikbaarheid van krachtige antibiotica, ontstekingsremmende geneesmiddelen en vitrectomiechirurgie, bacteriële endophthalmitis kan een patiënt blind maken. Klinische studies zijn nuttig geweest bij het bestuderen van endophthalmitis; echter, experimentele modellen van endoftalmitis bieden snelle en reproduceerbare resultaten die kunnen worden vertaald naar vooruitgang in de standaard van de zorg, wat resulteert in een betere visuele uitkomst voor patiënten.

Het glasvochtvolume .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-20 µL pipette	RANIN	L0696003G	NA
37oC Incubator	Fisher Scientific	11-690-625D	NA
Bacto Brain Heart Infusion	BD	90003-032	NA
Cell Microinjector	MicroData Instrument, Inc.	PM2000	NA
Fine tip forceps	Thermo Fisher Scientific	12-000-122	NA
Glass beads 1.0 mm	BioSpec	11079110	NA
Incubator Shaker	New Brunswick Scientific	NB-I2400	NA
Microcapillary Pipets 5 Microliters	Kimble	71900-5	NA
Micro-Pipette Beveler	Sutter Instrument Co.	BV-10	NA
Microscope Axiostar Plus	Zeiss		NA
Microscope OPMI Lumera	Zeiss		NA
Mini-Beadbeater-16	BioSpec	Model 607	NA
Multichannel pipette 30-300 µL	Biohit	15626090	NA
Multichannel pipette 5-100 µL	Biohit	9143724	NA
Needle/Pipette Puller	Kopf	730	NA
PBS	GIBCO	1897315	Molecular grade
Protease Inhibitor Cocktail	Roche	4693159001	Molecular grade
Reverse action forceps	Katena	K5-8228	NA