Intramyocardtransplantatie van MSC-Loading Injecteerbare Hydrogels na myocardinfarct in een Murine-model

Samenvatting

Stamcelgebaseerde therapie is naar voren gekomen als een efficiënte strategie om gewonde hartweefsels te herstellen na een myocardinfarct. Wij bieden een optimale in vivo toepassing voor stamceltransplantatie met behulp van gelatinehydrogels die enzymatisch met elkaar verbonden kunnen zijn.

Samenvatting

Een van de belangrijkste problemen waarmee de huidige hartstamceltherapieën worden geconfronteerd om postinfarct hartfalen te voorkomen, is de lage retentie en overlevingskansen van getransplanteerde cellen in het gewonde myocardium, waardoor hun therapeutische werkzaamheid wordt beperkt. Onlangs heeft het gebruik van steigerbiomaterialen aandacht gekregen voor het verbeteren en maximaliseren van stamceltherapie. Het doel van dit protocol is om een eenvoudige en eenvoudige techniek in te voeren voor het transplanteren van mesenchymale stamcellen (MSC's) met behulp van injecteerbare hydroxyfenylpropionzuur (GH) hydrogels; de hydrogels zijn gunstig als een celafgifteplatform voor hartweefsel engineering toepassingen vanwege hun vermogen om cross-linked in situ en hoge biocompatibiliteit. We presenteren een eenvoudige methode om MSC-loading GH hydrogels (MSC/hydrogels) te fabriceren en hun overleving en proliferatie in driedimensionale (3D) in vitro cultuur te evalueren. Daarnaast demonstreren we een techniek voor intramyocardtransplantatie van MSC/hydrogels bij muizen, waarbij we een chirurgische ingreep beschrijven om myocardinfarct (MI) op te wekken via linker voorste aflopende (LAD) coronaire slagader ligatie en daaropvolgende MSC/hydrogels transplantatie.

Inleiding

Cardiale stamceltherapie is ontstaan als een mogelijke benadering voor myocardherstel en regeneratie^1,2. Ondanks de recente positieve resultaten in diermodellen en klinische studies, is de toepassing van stamcelgebaseerde therapie voor myocardherstel beperkt als gevolg van lage retentie en slechte overleving van geïnjecteerde cellen in de ingefarcteerde hartweefsels^3,4. Als gevolg hiervan is het gebruik van celgebaseerde weefseltechnologie, waaronder injecteerbare biomaterialen⁵, hartpleisters⁶en celbladen⁷, intensief bestudeerd om de celretentie en integratie binnen het gastheer myocardium te verbeteren.

Onder de verschillende mogelijke benaderingen van bio-ingenieur hartweefselherstel zijn injecteerbare hydrogels in combinatie met geschikte celtypen, zoals mesenchymale stamcellen (MSC's), embryonale stamcellen (ECC's) en geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's), een aantrekkelijke optie om cellen effectief in myocardiale regio's te leveren^8,9. Gelatine, een bekend natuurlijk polymeer, kan worden gebruikt als een injecteerbare matrix vanwege de grote biocompatibiliteit, aanzienlijke biologische afbreekbaarheid en verminderde immunogeniciteit in vergelijking met een breed scala aan biomaterialen die worden gebruikt in biomedische toepassingen. Hoewel gelatine-gebaseerde injecteerbare platforms een groot potentieel hebben, blijft hun toepasbaarheid in vivo beperkt op basis van hun lage mechanische stijfheid en gemakkelijke afbreekbaarheid in de fysiologische omgeving.

Om deze beperkingen te overwinnen, is een nieuw en eenvoudig ontwerp van hydrogels op basis van gelatine, bestaande uit hydroxyfenylpropionzuur, voorgesteld voor in vivo toepassingen. Gelatine-hydroxyfenylpropionzuur (GH) conjugaten kunnen ter plaatse worden gekruist in aanwezigheid van een enzym, mierikswortelperoxidase (HRP), en vervolgens verschillende geneesmiddelen, biomoleculen of cellen in de hydrogel inkapselen, wat wijst op een groot potentieel in weefseltechnologietoepassingen^{10,11,12,13,14}. Daarnaast hebben we onlangs de therapeutische effecten onderzocht van GH-hydrogels die ingekapselde MSC's bevatten en hebben we aangetoond dat ze worden gebruikt bij succesvol hartherstel en regeneratie na MI in een murine model¹⁵. In dit protocol beschrijven we een eenvoudige techniek voor de inkapseling en in vitro driedimensionale (3D) proliferatie van MSC's binnen GH-hydrogels. We introduceren ook een chirurgische procedure die is ontworpen om een murine MI-model te genereren via coronaire slagader ligatie en intramyocardtransplantatie van MSC-ladende GH-hydrogels in het ingefarct hart.

Protocol

Alle dieronderzoeksprocedures werden verstrekt in overeenstemming met de Wet welzijn proefdieren, de Gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren en de richtlijnen en beleidsregels voor knaagdierexperimenten die werden verstrekt door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de School of Medicine van de Katholieke Universiteit van Korea.

1. Bereiding van MSC's en injecteerbare gelatinehydrogels

1. Kweek MSC 's in een kweekschaal van 100 mm bij 37 °C en 5% CO₂. Wanneer de groei van de MSC's 80% samenvloeiing bereikt, wast u de schaal tweemaal met DPBS en voegt u 1 ml trypsinevervanger toe bij 37 °C gedurende 3 minuten.
   OPMERKING: MSC's werden geïsoleerd uit murine beenmerg na conventionele procedures¹⁶, gekweekt in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% antibioticum−antimycotische oplossing, en gebruikt tussen passage 7\u20129 voor deze studie.
2. Voeg 9 ml kweekmedium toe en centrifugeer gedurende 3 minuten op 500 x g. Gooi vervolgens het resulterende supernatant weg, resuspendeer de cellen in 1 ml PBS en behoud de celsuspensie op ijs.
3. Verdun 10 μL celsuspensie met 10 μL Trypan blauw en verkrijg de celconcentratie met behulp van een geautomatiseerde celteller.
4. Resuspend en breng MSC's over naar een buis van 1 ml met een dichtheid van 1 x 10⁷ cellen/ml.
5. Bereid een 6,25 wt% GH-conjugaatoplossing in PBS en scheid in 2 flacons. Meng vervolgens de GH-oplossingen met 6 μg/ml HRP (GH-oplossing A) of 0,07 wt% van H₂O₂ (GH-oplossing B).
   OPMERKING: Bereid gelatine-hydroxyfenylpropionzuur (GH) conjugaten volgens gepubliceerde protocollen^12,15.
   1. Houd een 9:1 volumetrische verhouding van GH-geconjugeerde oplossing voor HRP (GH-oplossing A) en GH-geconjugeerde oplossing tot respectievelijk H₂O₂ (GH-oplossing B).
6. Voordat u de MSC's mengt met GH-oplossing A, centrifugeert u de celsuspensie kort op 1.000 x g en aspireer u voorzichtig de resulterende supernatant. Meng vervolgens de pellet met MSC's met GH-oplossing A.

2. In situ MSC-laden en driedimensionale in vitro kweek

1. Laad GH-oplossing A (met MSC's) en GH-oplossing B in beide zijden van een dubbele spuit. Plaat 300 μL van de gecombineerde GH-oplossingen met MSC's bij een uiteindelijke dichtheid van 5 x 10⁶ cellen/ml op een achtputtenkamerschuif.
2. Voeg na in situ hydrogelvorming en daaropvolgende MSC-inkapseling via enzymatische cross-linking 700 μL DMEM toe dat 10% FBS en 1% antibioticum-antimycotische oplossing bevat.
3. Incubeer de dia bij 37 °C en 5% CO₂ en vervang het kweekmedium elke 2\u20123 dagen.

3. Bevestiging van in vitro proliferatie en overleving van MSC's binnen GH-hydrogels

1. Om de levensvatbaarheid van 3D-gekweekte MSC's in GH-hydrogels te bepalen, gebruikt u een levende/dode celkleuringstest na de vooraf bepaalde incubatietijd.
2. Na incubatie van de ingekapselde MSC's in GH-hydrogels gedurende 3, 5, 7 of 14 dagen, aspireer het medium en was de put tweemaal met PBS.
3. Bereid een kleuroplossing voor die 5 μL calceïne AM en 20 μL ethidiumhomodimeer-1 (EthD-1) bevat in 10 ml DPBS.
4. Voeg 200 μL van de kleuringsoplossing toe aan de put en incubeer gedurende 30 minuten in het donker bij kamertemperatuur.
5. Aspirateer de kleuroplossing en was de put twee keer met PBS.
6. Scheid de kamer voorzichtig van de glijbaan en plaats een volledige afdeklip over de GH-hydrogels. Gebruik een confocale microscopie om de mate van proliferatie en morfologische veranderingen van de ingekapselde MSC's te visualiseren.
   OPMERKING: Fluorescerende beelden werden verkregen onder een vergroting van 200x en in beeld gesteld op de excitatie/emissiegolflengten van 470/540 nm voor calceïne en 516/607 nm voor EthD-1.

4. Inductie van myocardinfarct bij muizen

1. Verdoof 7 weken oude mannelijke C57BL/6 muizen (20\u201222 g) met intraperitoneale injectie van een mengsel van Zoletil (30 mg/kg) en Rompun (10 mg/kg) in zoutoplossing.
2. Ontharingscrème en steriliseer de huid vóór de operatie met jodium.
3. Plaats de muis op een operatietafel en intubeer door een katheter in de luchtpijp te steken om extra zuurstof te leveren via mechanische ventilatie.
4. Snijd voorzichtig door de huid met een chirurgische schaar en penetreer vervolgens de intercostale spieren door een microschaar. Scheid de 2e en 3e linkerribbetjes met behulp van een 5-0 zijden hechting om een open borstholte te behouden.
5. Ligate voorzichtig de linker voorste aflopende (LAD) kransslagader met behulp van een naaldhouder met een 8-0 polypropyleen hechtdraad en snijd de hechtdraad met behulp van elektrocautery.
6. Let op een onmiddellijke kleurverandering in de linkerventrikelwand.

5. Intramyocardtransplantatie van MSC-loading GH hydrogels

1. Na het induceren van het myocardinfarct door LAD ligatie, injecteert u 10 μL MSC-ladende GH-oplossingen in twee verschillende punten in de infarctgrenszone (totaal: 2 x 10⁵ MSC's/20 μL) met behulp van een dubbele spuit uitgerust met een 26G-naald.
   1. Volgens dezelfde procedure die in stap 1 wordt beschreven, bereidt u GH-oplossingen voor en brengt u deze over in een dubbele spuit.
      OPMERKING: Om de engraftment van MSC-ladende GH-hydrogels in het infarcted gebied te beoordelen, werden MSC's en GH-conjugaten vooraf geëtiketteerd met respectievelijk PHK26 en fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC).
2. Herstel de geopende borstholte en sluit de spieren en huid met behulp van 5-0 hechtingen.
   OPMERKING: Verwijder de lucht vóór het sluiten van de borstkas met een katheterspuit.
3. Verwijder de luchtpijp en plaats de muis tijdens het herstel in een kooi onder een infraroodlamp.
4. Voor postoperatieve analgesie dient u subcutane Ketoprofen-injecties (5 mg/kg per dag) toe gedurende ten minste 72 uur. Alle muizen moeten op de juiste tijd nauwlettend worden gecontroleerd om een goed herstel na chirurgische ingrepen en een adequate pijnbehandeling te garanderen.

6. Echocardiografie

1. Vier weken na transplantatie, verdoof de muis in eerste instantie met 5% isofluraan en pas vervolgens de isofluraanconcentratie aan tot 1%.
2. Ontharingscrème en plaats de muis op een verwarmingskussen. Breng ultrasone transducergel aan op de borst.
3. Verkrijg tweedimensionale parasternale korte asweergaven en noteer M-mode tracings op het niveau van de papillaire spier.
   OPMERKING: Plaats een lineaire arraytransducer (7\u201215 MHz) in de linker parasternale lijn en bekijk de anatomische structuren.
4. Meet overeenkomstige lijnen voor LVAW, LVID en LVPW om hartwanddikte, kamerdimensie en fractionele verkorting te verkrijgen.
   OPMERKING: Vergelijk de hartfunctie inclusief de ejectiefractie (EF), fractionele verkorting (FS) en het eindstolische volume (ESV) ter hoogte van de papillaire spier om een goede beoordeling op dezelfde anatomische locatie te garanderen.

7. Histologische evaluatie

1. Op het vooraf bepaalde tijdstip na transplantatie van MSC-ladende GH-hydrogels in het ingefarct hart, euthanaseer de muis in een CO_2-kamer en verzamel het hart voor histologische analyse¹⁵.
2. Voor hematoxyline en eosine (H&E) en Masson's trichrome (MT) kleuring, fixeer de ontleede hartweefsels in 4% paraformaldehyde (PFA) en embed in paraffine. Snijd vervolgens paraffine-ingebedde hartblokken in seriële secties van 4 μm met behulp van een microtoma en bevlek de secties met MT-vlek volgens standaardprotocollen¹⁷.
3. Verkrijg afbeeldingen op een diascanner met een vergroting van 20x en bereken de infarctgrootte van de behandelingsgroepen.
   Infarctgrootte (%) = totale infarctomtrek / totale LV-omtrek x 100
4. Bereken beide omtrek door middellijnlengtemeting. Meet voor LV-middellijnomtrek de lengtes van de middellijn tussen de endocard- en epicardiale oppervlakken. Meet voor middellijns infarctomtrek de lengte van het infarct, met inbegrip van meer dan 50 % van de gehele dikte van myocardium¹⁸.
   OPMERKING: Alle beeldanalyses zijn uitgevoerd met behulp van ImageJ-software.
5. Meet de wanddikte van het litteken op papillaire spierniveaus.
6. Bereken de fractie van het collageengebied.
   Collageengebied (%) = totale oppervlakte interstitiële fibrose/myocytengebied x 100

Resultaten

Om MSC's effectief aan het infarct myocardium te leveren, werden in dit protocol MSC-loading in situ cross-linkable hydrogels gebruikt die in figuur 1 worden beschreven. Voorafgaand aan in vivo transplantatie werden de proliferatie en overleving van MSC's in GH-hydrogels bevestigd door een 3D in vitro live/dead cell staining assay (levend: groen; dood: rood). Zoals blijkt uit figuur 2,vertoonden representatieve beelden voldoende proliferatie van MSC's, met verta...

Discussie

Injecteerbare GH hydrogels hebben een groot potentieel voor in vivo toepassingen vanwege hun vermogen om verschillende therapeutische middelen homogeen in situ op te nemen. Bovendien kunnen hun fysische en biochemische eigenschappen gemakkelijk worden gemanipuleerd op basis van ziekteafhankelijke vereisten. In dit verband zijn injecteerbare hydrogels voorgesteld om de belangrijkste beperkingen in de huidige hartstamceltherapie aan te pakken die worden belemmerd door een slechte overleving en celretentie (d.w.z. < 10% bin...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
4 % paraformaldehyde (PFA)	Intron	IBS-BP031-2
5-0 zijden hechtdraad	AILEE	SK534
8-0 polypropyleen hechtdraad	ETHICON	M8732H
8-wel kamerschuifblok	Nunc LAB-TEK	154534
Angiocath Plus (22GA) katheter	BD Angiocath Plus	REF382423
Antibioticum-antimyocotisch	Gibco	15240-062
Centrifuge	GYROGEN	1582MGR
Confocale microscoop	Zeiss	LSM 510
Dekglas	MARIENFELD	101242
Deluxe High Temperature Cautery kit	Bovie	QTY1
DMEM	Gibco	11995-065
DPBS	Gibco	14040-133
Dubbele spuit
EOSINE	SIGMA-ALDRICH	HT110116
Ethanol	EMSURE	K49350783 739
FBS	Gibco	16000-044
Fechtner conjunctiva forceps titanium	WORLD PRECISISON INSTRUMENTS	WP1820
Fluoresceïne isothiocyanate isomeer I (FITC)	SIGMA-ALDRICH	F7250
Pincet	HEBU	HB0458
Haarverwijderingscrème	Ildong Pharmaceutical
Verwarmingskussen	Stoelting	50300	Homeothermic Blanket System
		50301	Vervangende verwarmingskussen voor 50300 (10 X 12,5cm)
Hematoxylline	SIGMA-ALDRICH	HHS80
Mierikswortelperoxide (HRP; 250-330 U/mg)	SIGMA-ALDRICH	P8375
Waterstofperoxide (H2O2; 30 wt % in H2O)	SIGMA-ALDRICH	216763
Jodium	Green Pharmaceutical
LIVE/DEAD celkleuringskit	Thermo Fisher	R37601
Mechanische ventilator	Harvard Apparatus
Micro centrifuge	HANIL	Micro 12
Micro naaldhouder	KASCO	37-1452
Micro schaar	HEBU	HB7381
Microscoop	OLYMPUS	SZ61
MT-kleuringskit	SIGMA-ALDRICH	HT1079-1SET	Weigert’s ijzerhematoxylline-oplossing
		HT15-1KT	Trichrome-kleuringskit (Masson)
Paraffine	LK LABKOREA	H06-660-107
PBS-buffer	Gibco	10010-023
PHK26-kleuringskit	SIGMA-ALDRICH	MINI26
Schuifscanner	Leica	SCN400
Chirurgische schaar	HEBU	HB7454
Chirurgisch plakband	3M micopore	1530-1
Weefselcassette	Scilab Korea	Cas3003
Transducergel	SUNGHEUNG	SH102
Trout-Barraquer naaldhouder gebogen	KASCO	50-3710c
Echografiesysteem	Philips	Affiniti 50
Xyleen	JUNSEI	25175-0430