Methodenartikel

Kwantificering van de effecten van antimicrobiële stoffen op in vitro biofilmarchitectuur met behulp van COMSTAT-software

3.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/61759

⸱

14 december 2020

 ,  ,  ,  , 
1Translational Medicine, Hospital for Sick Children, 2Microbiology, Department of Pediatric Laboratory Medicine, Hospital for Sick Children, 3Infectious Diseases, Department of Pediatrics, Hospital for Sick Children

In dit artikel

Samenvatting

Door antimicrobiële stoffen geïnduceerde veranderingen in de biofilmarchitectuur van Pseudomonas aeruginosa verschillen tussen klinische isolaten die zijn gekweekt van patiënten met cystische fibrose en chronische longinfectie. Na confocale microscopie kan COMSTAT-software worden gebruikt om variaties in biofilmarchitectuur (bijv. oppervlakte, dikte, biomassa) voor individuele isolaten te kwantificeren om de werkzaamheid van anti-infectiemiddelen te beoordelen.

Samenvatting

Biofilms zijn aggregaten van micro-organismen die afhankelijk zijn van een zelfgeproduceerde matrix van extracellulaire polymere stoffen voor bescherming en structurele integriteit. Van de nosocomiale ziekteverwekker, Pseudomonas aeruginosa, is bekend dat het een biofilmgroeiwijze aanneemt, waardoor chronische longinfectie ontstaat bij patiënten met cystische fibrose (CF). Het computerprogramma COMSTAT is een nuttig hulpmiddel voor het kwantificeren van door antimicrobiële stoffen geïnduceerde veranderingen in de biofilmarchitectuur van P. aeruginosa door gegevens te extraheren uit driedimensionale confocale beelden. De gestandaardiseerde werking van de software komt echter minder vaak aan bod, wat belangrijk is voor een optimale rapportage van biofilmgedrag en vergelijking tussen centra. Het doel van dit protocol is dus om een eenvoudig en reproduceerbaar kader te bieden voor het kwantificeren van in vitro biofilmstructuren onder variërende antimicrobiële omstandigheden via COMSTAT. De techniek is gemodelleerd met behulp van een CF P. aeruginosa-isolaat , gekweekt in de vorm van biofilmreplicaten en blootgesteld aan tobramycine en het anti-Psl monoklonale antilichaam, Psl0096. De stapsgewijze aanpak is erop gericht de ambiguïteit van de gebruiker te verminderen en de kans te minimaliseren dat cruciale beeldverwerkingsstappen over het hoofd worden gezien. Het protocol legt met name de nadruk op de eliminatie van subjectieve variaties die verband houden met de handmatige bediening van COMSTAT, inclusief beeldsegmentatie en de selectie van geschikte kwantitatieve analysefuncties. Hoewel deze methode vereist dat gebruikers extra tijd besteden aan het verwerken van confocale beelden voordat COMSTAT wordt uitgevoerd, helpt het om verkeerd weergegeven biofilmheterogeniciteit in geautomatiseerde uitvoer te minimaliseren.

Inleiding

Biofilms zijn aggregaten van micro-organismen die zijn georiënteerd in een matrix van zelf geproduceerde extracellulaire polymere stoffen (EPS). De EPS-matrix is zeer complex en bestaat voornamelijk uit bacteriële cellen, water, eiwitten, polysachariden, lipiden en nucleïnezuren1, die allemaal biofilms maken die duidelijk verschillen van vrijlevende planktoncellen. Biofilm EPS hechten zich aan elkaar en aan verschillende ondergronden. De EPS-matrix heeft eigenschappen die de cel-tot-cel-uitwisseling van metabolieten, genetisch materiaal en verbindingen bemiddelen die worden gebruikt voor intercellulaire signaleringen verdediging. Deze eigenschappen zorgen samen voor de structurele integriteit van biofilms en bescherming tegen externe stressoren, wat bijdraagt aan immuunontwijking en antimicrobiële resistentie3.

Pseudomonas aeruginosa is een erkende nosocomiale ziekteverwekker, waarvan bekend is dat deze een ontwijkende biofilmgroeistrategie aanneemt als reactie op antimicrobiële stoffen. Een goed voorbeeld hiervan doet zich voor bij patiënten met de recessieve genetische aandoening, cystische fibrose (CF). Biofilms spelen een cruciale rol bij de ontwikkeling van antimicrobieel resistente P. aeruginosa4 en maken het mogelijk om chronische longinfectie vast te stellen bij patiënten met CF, wat leidt tot versnelde achteruitgang van de longfunctie en vroegtijdige sterfte5. Daarom worden in vitro biofilmstudies uitgevoerd om de werkzaamheid van antibiotica en nieuwe anti-infectieuze middelen tegen P. aeruginosa-isolaten te testen die zijn verkregen van patiënten met CF 6,7. Na de vorming van biofilm worden antimicrobiële stoffen uitwendig op de structuur aangebracht en wordt confocale laserscanmicroscopie (CLSM) gebruikt om driedimensionale reconstructies met hoge resolutie van biofilmsegmenten te genereren. Het is gebruikelijk om vervolgens de computersoftware, COMSTAT, te gebruiken als een plug-in voor ImageJ, om veranderingen in de biofilmarchitectuur te kwantificeren 8,9,10,11.

Hoewel COMSTAT nuttig is voor het kwantificeren van de biofilmstructuur, wordt de reproduceerbaarheid en standaardisatie van beeldanalyse minder vaak aangepakt. De beeldverwerkingsprocedure, die wordt uitgevoerd voordat COMSTAT wordt uitgevoerd, is objectief, maar bevat een element van subjectiviteit bij het instellen van beelddrempels12,13. Op dezelfde manier stelt het COMSTAT-programma de operator in staat om te kiezen uit basis- tot geavanceerde voorwaarden en parameters voor beeldsegmentatie, evenals tien kwantitatieve analysefuncties (bijv. dikteverdeling, oppervlakte, biomassa, dimensieloze ruwheidscoëfficiënt). De veelheid aan gebruikersopties, gecombineerd met verschillende expertiseniveaus van de operator, kan leiden tot misleidende rapportage van biofilmgedrag.

Het doel van dit protocol is dus om een relatief eenvoudige methode te presenteren voor de kwantitatieve vergelijking van in vitro biofilmstructuren met behulp van COMSTAT. Hierin worden driedimensionale beelden van biofilmsegmenten van een CF P. aeruginosa-isolaat vastgelegd via CLSM met behulp van het kamermodel14 - een gevestigde techniek die wordt gebruikt om reproduceerbare in vitro biofilmexperimenten uit te voeren. Door gebruik te maken van COMSTAT als een plug-in voor ImageJ, stelt deze methode onderzoekers in staat om veranderingen in de biofilmarchitectuur in aanwezigheid van antimicrobiële stoffen onder verschillende omstandigheden kwantitatief te identificeren. Over het algemeen is deze methode bedoeld om subjectieve variaties te elimineren die verband houden met de handmatige bediening van COMSTAT, waardoor de standaardisatie van protocollen in verschillende centra wordt vergemakkelijkt.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Verzameling van bacterie-isolaten

  1. Verkrijg P. aeruginosa-isolaten van een cohort pediatrische patiënten met CF die een uitroeiingsbehandeling ondergaan met inhalatietobramycine bij SickKids (Toronto). Vriesisolaten voor gebruik minstens drie keer in bij -80 °C in glycerolcitraat en subcultuur.

2. In vitro biofilmvorming

OPMERKING: Gebruik een kamerbedekglas methode1 voor in vitro biofilmvorming met aanpassingen. De algehele workflow van dit model wordt weergegeven in figuur 1.

  1. Kweek P. aeruginosa-isolaat 's nachts bij 37 °C op bloedagar bereid met tryptische soja-agar en 5% schapenbloed (zie materiaaltabel).
  2. Inoculeer 1-2 bacteriekolonies uit de bloedagar in 4 ml lysogeniebouillon (LB). 's Nachts kweken bij 37 °C op een shaker ingesteld op 225 tpm.
  3. Bereid een 1:100 verdunning van het inoculum 's nachts voor door 40 μl van de cultuur toe te voegen aan 4 ml verse LB. Laat 3-4 uur groeien bij 37 °C op een shaker die is ingesteld op 225 tpm, om een optische dichtheid van ongeveer 0,1 te bereiken bij 600 nm (OD600) (vroege logfase).
  4. Breng 220 μl van het inoculum over in elk putje van een dekglaasje met 8 kamers. Ongestoord uitbroeden bij 37 °C gedurende 24 uur.
  5. Verwijder langzaam het medium uit elk putje om te voorkomen dat de biofilms aan de basis loskomen.
    OPMERKING: Kantel de schuif in een hoek van 45° naar voren en zuig het medium op vanuit de onderste hoeken van elke kamerput zonder de basis met de pipetpunt aan te raken.
  6. Bereid 100 μL 56 μg/ml fluorescerend gelabeld monoklonaal antilichaam (mAb) (zie Materiaaltabel) voor en voeg langzaam toe aan de zijkant van de aangewezen putjes met kamers. Incubeer bij kamertemperatuur (RT) gedurende 1 uur om de hechting van antilichamen aan het bacteriële antigeenepitoop mogelijk te maken.
    OPMERKING: Verdun voor gebruik de fluorescerend gelabelde (rode) mAb, Psl0096, in LB om een eindconcentratie van 56 μg/ml te verkrijgen. Psl0096 is een anti-Psl-mAb (derivaat met geoptimaliseerde affiniteit van Cam003), dat bindt aan het klasse I Psl-epitoop - een belangrijk EPS-matrixonderdeel van P. aeruginosa-biofilms die betrokken zijn bij de initiële celhechting en structurele integriteit15.
  7. Bereid 100 μl van een antibioticaoplossing van 1000 μg/ml (zie materiaaltabel) voor en voeg deze langzaam toe aan de zijkant van de daarvoor bestemde putjes met kamers. Ongestoord uitbroeden bij 37 °C gedurende 24 uur.
    OPMERKING: Verdun voor gebruik een voorraad tobramycine-antibioticum van 50 mg/ml in LB om een eindconcentratie van 1000 μg/ml te verkrijgen.

3. Biofilm fluorescerende kleuring

  1. Bereid een 0,01 mM-oplossing van een fluorescerende kleurstof die levende cellen kleurt. Verwijder langzaam het medium uit de putjes in de kamer en voeg 200 μL van het verfmengsel toe aan elk putje. Incubeer bij RT in het donker gedurende 45 min.
    OPMERKING: Bereid voor gebruik de levende celkleuring (groene) fluorescerende kleurstof voor door 4 μL van een voorraad van 5 mM toe te voegen aan 2 ml LB.
  2. Verwijder langzaam het medium uit elk putje en was 2x met 200 μL verse LB.
  3. Voeg 200 μL verse LB toe aan elk putje en ga verder met onderzoek via confocale microscopie.

4. Beeldacquisitie door confocale microscopie

OPMERKING: De procedure voor beeldverwerking en COMSTAT-analyse wordt weergegeven in afbeelding 2. Verkrijg afbeeldingen van putten op dezelfde dag van biofilmkleuring. Als de vertraging in de visualisatie meer dan 1 uur bedraagt, zet het dekglas met kamer dan in het donker in de koelkast tot verdere verwerking.

  1. Verkrijg beelden van putten met behulp van een confocaal microscoopsysteem (zie Tabel met materialen) met de juiste laserexcitatiegolflengten en filtersets voor acquisitie.
    OPMERKING: Prikkel hier de fluorescerend gelabelde (rode) mAb en levende cel (groene) kleuring met behulp van respectievelijk 561 en 491 nm excitatiegolflengten.
  2. Leg gelaagde z-stack-beelden vast (van het substraat tot de bovenkant van elk biofilmsegment) in stappen van 0,3 μm met een 20-25x wateronderdompelingslens. Neem minimaal 6 beeldstapels per putje.
    OPMERKING: Visualiseer hier de afbeeldingen met behulp van een camera met hoge resolutie en een 25x wateronderdompelingslens en verwerkt met behulp van beeldanalysesoftware (zie Materiaaltabel). Houd de software-instellingen en digitale beeldvormingsparameters (d.w.z. helderheid en gevoeligheid) constant voor alle acquisities in één experiment.
  3. Sla afbeeldingen op als OME-TIFF's voor COMSTAT-analyse.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat OME-TIFF's voor elk kanaal afzonderlijk worden opgeslagen (d.w.z. rood en groen). Deze stap is afhankelijk van de gebruikte beeldanalysesoftware.
  4. Herhaal stap 2.1-4.3 om beelden vast te leggen van in totaal 3 biologische replicaten (d.w.z. 3 onafhankelijke experimenten) per bacterie-isolaat.

5. Analyse van COMSTAT

OPMERKING: Analyseer afbeeldingen kwantitatief met behulp van het vrij verkrijgbare computerprogramma COMSTAT16,17, herschreven als een plugin (Comstat2) voor ImageJ. Lees de algemene instructies voor het analyseren van beeldstapels van biofilms in het gedownloade pakket. Deze bijdrage biedt een samengevat protocol, met geselecteerde ImageJ-verwerkingsstappen en COMSTAT-functies die worden aanbevolen voor het kwantificeren van de effecten van antimicrobiële stoffen op biofilmvorming.

  1. Download het Comstat2-pakket van http://www.comstat.dk/. Zoek in de geïnstalleerde map naar ImageJ en voer deze uit.
  2. Maak een bronmap op het bureaublad en voeg één OME-TIFF toe aan de map.
  3. Open OME-TIFF vanuit de bronmap en verwijder alle lege lagen die geen biomassa bevatten. Deze lagen zijn de eerste of laatste paar lagen van de z-stack.
    OPMERKING: Door de microscoop gedefinieerde z-stackgrenzen worden soms overschat door gebruikers. Door deze lege lagen te verwijderen, wordt een meer verfijnde z-stack-grens voor COMSTAT-analyse vastgesteld.
  4. Importeer OME-TIFF in ImageJ door Bestand | Importeren | Afbeelding sequentie. Zoek de bronmap, markeer deze zonder deze te openen en klik op Selecteren. Er verschijnt een venster 'Sequentie-opties'. Selecteer OK.
    OPMERKING: Om extra afbeeldingen in ImageJ te importeren, verwijdert u eerst de vorige OME-TIFF uit de bronmap, voegt u vervolgens de nieuwe OME-TIFF toe aan de map en herhaalt u stap 5.3 en 5.4.
  5. Draai de oriëntatie van de biofilm om door Afbeelding | Transformeren | Draai Z om om het substraat als de eerste (bovenste) stapel te positioneren.
    OPMERKING: COMSTAT-algoritmen lezen biofilms in de z-richting van boven (stapel 1) naar beneden. Afhankelijk van het gebruikte confocale microscoopsysteem kan de OME-TIFF-uitgang worden omgekeerd. Het is dus belangrijk om de volgorde van de segmenten om te keren door het substraat als beeldstapel 1 te positioneren om te voorkomen dat de uitvoergegevens gebrekkig worden.
  6. Definieer afbeeldingseigenschappen door Afbeelding | Eigenschappen. Er verschijnt een venster 'Bron'.
    1. Geef 'Lengte-eenheid' op als 'micron'.
    2. Bepaal 'Pixelbreedte' en 'Pixelhoogte' wiskundig met behulp van de volgende vergelijking:
      figure-protocol-1 (1)
      Hier worden 'Pixelbreedte' en 'Pixelhoogte' gedefinieerd als 0,427, waarbij de fysieke lengte van een pixel op het charge-coupled device (CCD) 16 μm is; totale vergroting is 25x; en de positie van het vergrootglas is 1,5x.
      OPMERKING: De vergelijking die wordt gebruikt om de celgrootte per pixel te berekenen, kan variëren, afhankelijk van de fabrikant van de microscoopcamera. Als alternatief kunnen 'Pixelbreedte' en 'Pixelhoogte' worden gedefinieerd door ruimtelijke kalibratie (zie https://imagej.net/Spatial_Calibration).
    3. Definieer 'Voxel-diepte' als 0,3 (d.w.z. incrementele ruimte tussen elke z-stack-laag). Selecteer OK in het venster 'Bron'.
  7. Pas de afbeeldingsdrempel aan door Afbeelding | Aanpassen | Drempelwaarde. Er verschijnt een venster 'Drempel'.
    OPMERKING: Objecten in de afbeelding worden rood weergegeven met een achtergrond in grijstinten. Als alternatief kan de drempel in zwart-wit worden aangepast door het vervolgkeuzemenu in het venster 'Drempel' te gebruiken om 'Rood' te wijzigen in 'Zwart-wit'.
    1. Pas in het afbeeldingsvenster de schuifregelaar helemaal naar rechts aan (d.w.z. de bovenste laag van de biofilm). Om achtergrondruis te verwijderen, gebruikt u het venster 'Drempel', waarin een histogram van de afbeelding wordt weergegeven, om de maximum- en minimumdrempelwaarden handmatig in te stellen. Stel eerst de maximale drempelwaarde in door de onderste schuifregelaar zo ver mogelijk naar rechts te verstellen. Ten tweede, gebruik de bovenste schuifregelaar om de minimale drempelwaarde aan te passen, die de afbeelding in twee afzonderlijke fasen segmenteert: rode biomassa en grijswaardenachtergrond (Figuur 3).
      OPMERKING: De in vitro biofilmvorming en fluorescentiemicroscopieprocedure die hierin worden beschreven, genereert in het ideale geval OME-TIFF's, waardoor beelden in twee verschillende fasen kunnen worden gesegmenteerd door middel van een eenvoudige histogramdrempelmethode. In sommige gevallen is het histogramonderscheid tussen de verschillende fasen echter niet zo duidelijk. Dit kan te wijten zijn aan de aanwezigheid van veel achtergrondgeluid, variërende achtergrondintensiteiten of een contrast met een lage intensiteit tussen biomassa en achtergrond. In dergelijke gevallen moeten gebruikers een verbeterde segmentatieprocedure toepassen18,19.
      1. U kunt ook de drempels algoritmisch aanpassen voor afzonderlijke afbeeldingen met behulp van het linker vervolgkeuzemenu dat is ingesteld op 'Standaard' in het venster 'Drempel'. Deze functie biedt 17 verschillende algoritmische drempelopties om uit te kiezen (zie https://imagej.net/Auto_Threshold). Selecteer de meest toepasselijke optie en vervolgens 'Auto' om de drempel in te stellen.
    2. Wanneer de drempelwaarden zijn aangepast, gebruikt u de schuifregelaar in het afbeeldingsvenster om door elke laag te bladeren om ervoor te zorgen dat achtergrondruis voldoende wordt verwijderd.
    3. Selecteer Instellen in het venster 'Drempel' om eerst de onderste drempelwaarde vast te stellen. Er verschijnt een venster 'Drempelniveaus instellen'. Selecteer OK. Selecteer Opnieuw instellen en herhaal deze stap om de maximale drempelwaarde vast te stellen.
      OPMERKING: Elke keer dat 'Set' is geselecteerd, kan de onderste schuifregelaar automatisch worden aangepast. In dergelijke gevallen past u de schuifregelaar handmatig opnieuw aan (of selecteert u 'Automatisch' als u een van de algoritmische drempels gebruikt) en herhaalt u de stappen 5.6.2–5.6.3. Het belangrijkste idee is dat wanneer de schuifregelaars automatisch opnieuw worden afgesteld, 'Set' daarna nog twee keer moet worden geselecteerd om ervoor te zorgen dat zowel de bovenste als de onderste drempels vast zitten.
    4. Selecteer Toepassen en er verschijnt een venster 'Stack converteren naar binair'. Selecteer OK en verlaat het venster 'Drempel'.
    5. Sla de nieuw aangepaste OME-TIFF op door Plugins | Bio-Formaten | Exporteur van bio-formaten|. Voer een nieuwe bestandsnaam in en sla deze op als OME-TIFF in de bronmap. Er verschijnt een venster 'Bio-Formats Exporter – Multiple Files'. Selecteer OK. Er verschijnt een venster 'Bio-Formats Exporter Options'. Selecteer OK.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat alleen de nieuw aangepaste, zwart-wit OME-TIFF(s) in de bronmap zijn opgeslagen voordat u doorgaat met COMSTAT-analyse. Verwijder alle originele OME-TIFF's uit de map.
  8. Voer COMSTAT uit door Plugins | Comstat2 |. Er verschijnt een venster 'Over'. Selecteer OK. Er verschijnen drie vensters.
    1. Selecteer in het venster 'Waargenomen mappen' (rechtsboven) de optie Toevoegen. Zoek de bronmap, markeer deze zonder deze te openen en selecteer Kiezen. Er verschijnt een venster 'Afbeeldingen in mappen' (linksboven) met een lijst van de OME-TIFF's die via COMSTAT moeten worden geanalyseerd.
    2. Schakel in het venster 'Comstat 2.1' (rechtsonder) de optie 'Automatische drempelwaarde (methode van Otsu)' uit om ervoor te zorgen dat de software drempelwaarden gebruikt die eerder zijn ingesteld voor individuele OME-TIFF's. Schakel ook Connected Volume Filtering (CVF) uit om ervoor te zorgen dat zeer dunne delen van de biofilm, evenals vrij zwevende cellen of biomassa die in holtes van de biofilmstructuur worden aangetroffen, in de analyse worden opgenomen.
      OPMERKING: Schakel hier CVF uit, omdat COMSTAT-analyse wordt uitgevoerd op zeer vroege biofilms (24 uur initiële groei) en resterende planktoncellen/kolonies na antimicrobiële behandeling. Selecteer voor rijpe biofilms CVF om ervoor te zorgen dat alleen biomassa die verbonden is met de biofilmstructuur wordt gekwantificeerd.
    3. Selecteer in het venster 'Comstat 2.1' (rechtsonder) de gewenste functies voor kwantitatieve analyse. Selecteer hier Biomassa, Dikteverdeling en Oppervlakte. Selecteer Ga om het programma uit te voeren. In het venster 'Log' (linksonder) worden de uitvoergegevens weergegeven terwijl ze worden verwerkt totdat 'Klaar met geselecteerde functies/afbeeldingen!' verschijnt. Noteer de COMSTAT-metingen. Deze metingen worden ook automatisch opgeslagen als TXT-bestanden in de bronmap.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Een P. aeruginosa-isolaat gekweekt uit een geïnfecteerde patiënt met CF wordt gebruikt om de sterke punten van deze benadering aan te tonen bij het nauwkeurig kwantificeren van door antimicrobieel geïnduceerde veranderingen in in vitro biofilmarchitectuur. De algehele workflow van dit model is weergegeven in figuur 1. De procedure voor beeldverwerking en COMSTAT-analyse in ImageJ is weergegeven in figuur 2. Een eenvoudige histogramdrempelbenade...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Er is geen voorgeschreven methode voor het kwantitatief vergelijken van driedimensionale beelden van in vitro biofilmstructuren, en procedures die in deze context worden beschreven, zijn vaak moeilijk te standaardiseren vanwege de variabiliteit tussen de operators20. Dit protocol biedt dus een eenvoudig en reproduceerbaar raamwerk voor COMSTAT-toepassingen die veranderingen in de in vitro biofilmarchitectuur onder verschillende antimicrobiële omstandigheden willen kwantificeren. ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Dankbetuigingen

De auteurs willen de Cystic Fibrosis Foundation bedanken voor het financieren van dit onderzoek.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Anti-Psl mAb, Psl0096Medimmune
Blood Agar (TSA met 5 % schapenbloed) MediumFisher ScientificR01200
Eight-well Chambered Coverglass met niet-verwijderbare putjesThermo Fisher Scientific155411
Invitrogen SYTO 9 Groene Fluorescerende Nucleïnezuur VlekThermo Fisher ScientificS34854
LB BROTH (LENNOX), Vloeibaar Autocلافve GesteriliseerdBioShop CanadaLBL666
Tobramycin, 900 µg/mgAlfa Aesar door Thermo Fisher ScientificJ66040Het wordt aanbevolen om voor elke gemaakte batch een minimale remmende concentratie (MIC) test uit te voeren om de kwaliteitscontrole van antimicrobiële potentie te garanderen
Quorum Volocity 6.3Quorum TechnologiesBeeldanalysesoftware

Referenties

  1. Flemming, H. C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nature Reviews Microbiology. 8, 623-633 (2010).
  2. Flemming, H. C., et al. Biofilms: an emergent form of bacterial life. Nature Reviews Microbiology. 14, 563-575 (2016).
  3. Rybtke, M., Hultqvist, L. D., Givskov, M., Tolker-Nielsen, T. Pseudomonas aeruginosa biofilm infections: community structure, antimicrobial tolerance and immune response. Journal of Molecular Biology. 427, 3628-3645 (2015).
  4. Wendel, A. F., Ressina, S., Kolbe-Busch, S., Pfeffer, K., MacKenzie, C. R. Species diversity of environmental GIM-1-producing bacteria collected during a long-term outbreak. Applied and Environmental Microbiology. 82, 3605-3610 (2016).
  5. Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
  6. Powell, L. C., et al. Targeted disruption of the extracellular polymeric network of Pseudomonas aeruginosa biofilms by alginate oligosaccharides. NPJ Biofilms and Microbiomes. 4, 1-10 (2018).
  7. Ciofu, O., Tolker-Nielsen, T., Jensen, P. Ø, Wang, H., Høiby, N. Antimicrobial resistance, respiratory tract infections and role of biofilms in lung infections in cystic fibrosis patients. Advanced Drug Delivery Reviews. 85, 7-23 (2015).
  8. Landry, R. M., An, D., Hupp, J. T., Singh, P. K., Parsek, M. R. Mucin-Pseudomonas aeruginosa interactions promote biofilm formation and antibiotic resistance. Molecular Microbiology. 59, 142-151 (2006).
  9. Beaudoin, T., et al. Staphylococcus aureus interaction with Pseudomonas aeruginosa biofilm enhances tobramycin resistance. NPJ Biofilms and Microbiomes. 3, 1-9 (2017).
  10. Rojo-Molinero, E., et al. Sequential treatment of biofilms with aztreonam and tobramycin is a novel strategy for combating Pseudomonas aeruginosa chronic respiratory infections. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60, 2912-2922 (2016).
  11. Hentzer, M., et al. Alginate overproduction affects Pseudomonas aeruginosa biofilm structure and function. Journal of Bacteriology. 183, 5395-5401 (2001).
  12. Tolker-Nielsen, T., Sternberg, C. Growing and analyzing biofilms in flow chambers. Current Protocols in Microbiology. 21, 1-17 (2011).
  13. Luo, T. L., et al. A Sensitive thresholding method for confocal laser scanning microscope image stacks of microbial biofilms. Scientific Reports. 8, 1-14 (2018).
  14. Beaudoin, T., Kennedy, S., Yau, Y., Waters, V. Visualizing the effects of sputum on biofilm development using a chambered coverglass model. Journal of Visualized Experiments. (118), e54819(2016).
  15. DiGiandomenico, A., et al. Identification of broadly protective human antibodies to Pseudomonas aeruginosa exopolysaccharide Psl by phenotypic screening. Journal of Experimental Medicine. 209, 1273-1287 (2012).
  16. Heydorn, A., et al. Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT. Microbiology. 146, 2395-2407 (2000).
  17. Vorregaard, M. Comstat2 - a modern 3D image analysis environment for biofilms, in Informatics and Mathematical Modelling. Technical University of Denmark. , Kongens Lyngby. Denmark. (2008).
  18. Hashemi, M. A., Khaddour, G., François, B., Massart, T. J., Salager, S. A tomographic imagery segmentation methodology for three-phase geomaterials based on simultaneous region growing. Acta Geotechnica. 9, 831-846 (2014).
  19. Rogowska, J. Overview and fundamentals of medical image segmentation. Handbook of Medical Image Processing and Analysis. , 73-90 (2009).
  20. Webb, D., et al. Assessing technician effects when extracting quantities from microscope images. Journal of Microbiological Methods. 53, 97-106 (2003).
  21. Azeredo, J., et al. Critical review on biofilm methods. Critical Reviews in Microbiology. 43, 313-351 (2017).
  22. Xavier, J. B., et al. Objective threshold selection procedure (OTS) for segmentation of scanning laser confocal microscope images. Journal of Microbiological Methods. 47, 169-180 (2001).
  23. Arena, E. T., et al. Quantitating the cell: turning images into numbers with ImageJ. Wiley Interdisciplinary Reviews: Developmental Biology. 6, 260(2017).
  24. Daims, H., Wagner, M. Quantification of uncultured microorganisms by fluorescence microscopy and digital image analysis. Applied Microbiology and Biotechnology. 75, 237-248 (2007).
  25. Yerly, J., Hu, Y., Jones, S. M., Martinuzzi, R. J. A two-step procedure for automatic and accurate segmentation of volumetric CLSM biofilm images. Journal of Microbiological Methods. 70, 424-433 (2007).
  26. Lee, B., et al. Heterogeneity of biofilms formed by nonmucoid Pseudomonas aeruginosa isolates from patients with cystic fibrosis. Journal of Clinical Microbiology. 43, 5247-5255 (2005).
  27. Stapper, A. P., et al. Alginate production affects Pseudomonas aeruginosa biofilm development and architecture, but is not essential for biofilm formation. Journal of Medical Microbiology. 53, 679-690 (2004).
  28. Reichhardt, C., Parsek, M. Confocal laser scanning microscopy for analysis of Pseudomonas aeruginosa biofilm architecture and matrix localization. Frontiers in Microbiology. 10, 677(2019).
  29. Yang, X., Beyenal, H., Harkin, G., Lewandowski, Z. Quantifying biofilm structure using image analysis. Journal of Microbiological Methods. 39, 109-119 (2000).
  30. Yang, X., Beyenal, H., Harkin, G., Lewandowski, Z. Evaluation of biofilm image thresholding methods. Water Research. 35, 1149-1158 (2001).
  31. Ross, S. S., et al. Quantification of confocal images of biofilms grown on irregular surfaces. Journal of Microbiological Methods. 100, 111-120 (2014).
  32. Ma, L., et al. Assembly and development of the Pseudomonas aeruginosa biofilm matrix. PLoS Pathogens. 5, (2009).
  33. Mah, T. F., et al. A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance. Nature. 426, 306-310 (2003).
  34. Srinandan, C. S., Jadav, V., Cecilia, D., Nerurkar, A. S. Nutrients determine the spatial architecture of Paracoccus sp. biofilm. Biofouling. 26, 449-459 (2010).
  35. Ramos, I., Dietrich, L. E., Price-Whelan, A., Newman, D. K. Phenazines affect biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa in similar ways at various scales. Research in Microbiology. 161, 187-191 (2010).
  36. Ma, L., Jackson, K. D., Landry, R. M., Parsek, M. R., Wozniak, D. J. Analysis of Pseudomonas aeruginosa conditional psl variants reveals roles for the psl polysaccharide in adhesion and maintaining biofilm structure postattachment. Journal of Bacteriology. 188, 8213-8221 (2006).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Antimicrobi le effectenPseudomonas aeruginosaconfocale microscopiebeeldbewerkingdrempelwaardeaanpassingbiomassa metingdikteverdelingoppervlakteanalyse

Gerelateerde artikelen