Verschillende diermodellen van congenitale diafragmatische hernia en foetale tracheale occlusie bieden voor- en nadelen met betrekking tot ethische kwesties, kosten, chirurgische moeilijkheidsgraad, grootte, overlevingspercentages en beschikbaarheid van genetische hulpmiddelen. Dit model biedt een nieuw hulpmiddel om de impact van zowel tracheale occlusie als verhoogde luminale druk op de longontwikkeling te bestuderen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Transuterine foetale tracheale occlusie model in muizen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Foetale tracheale occlusie (TO), een gevestigde behandelingsmodaliteit, bevordert foetale longgroei en overleving bij ernstige aangeboren diafragmatische hernia (CDH). Na TO verhoogt het vasthouden van de afgescheiden epitheelvloeistof de lichtdruk en induceert het longgroei. Verschillende diermodellen zijn gedefinieerd om de pathofysiologie van CDH en TO te begrijpen. Ze hebben allemaal hun eigen voor- en nadelen, zoals de moeilijkheidsgraad van de techniek, de grootte van het dier, de kosten, hoge sterftecijfers en de beschikbaarheid van genetische hulpmiddelen. Hierin wordt een nieuw trans-uterien model van muriene foetale TO beschreven. Zwangere muizen werden verdoofd en de baarmoeder werd blootgesteld via een laparotomie in de middellijn. De luchtpijp van geselecteerde foetussen werd geligeerd met een enkele trans-uteriene hechting achter de luchtpijp, een halsslagader en een halsslagader. De dam werd gesloten en mocht herstellen. Foetussen werden vlak voor de bevalling verzameld. Long-lichaamsgewichtverhouding bij TO-foetussen was hoger dan die bij controlefoees. Dit model biedt onderzoekers een nieuw hulpmiddel om de impact van zowel TO als verhoogde luminale druk op de longontwikkeling te bestuderen.
Inleiding
Congenitale diafragmatische hernia (CDH) komt voor bij 1:2500 zwangerschappen en resulteert in pulmonale hypoplasie en neonatale pulmonale hypertensie1,2,3,4,5,6. Foetale tracheale occlusie (TO) is een gevestigde prenatale therapie bij ernstige CDH-patiënten waarbij fetoscopie nodig is in de 26-30e zwangerschapsweek waarin een ballon net boven de carina wordt geplaatst en vervolgens in de 32e zwangerschapsweek wordt verwijderd. Deze tijdelijke TO induceert foetale longgroei en verbetert de overleving. Congenitaal High Airway Obstruction Syndrome is een dodelijke aandoening geassocieerd met longhyperplasie, die chirurgen inspireerde om kunstmatige occlusie van de luchtpijp uit te voeren om het vasthouden van het uitgescheiden epitheelvocht te bevorderen. Deze occlusie verhoogde de lichtgevende druk en veroorzaakte longgroei7. De occlusie moet echter worden omgekeerd om epitheliale celrijping mogelijk te maken.
Verschillende diermodellen van CDH en TO - schapen, konijnen, ratten en muizen - zijn ontwikkeld om de pathofysiologie van CDH en TO te begrijpen. Ze hebben allemaal hun eigen voor- en nadelen, zoals de moeilijkheidsgraad van de techniek, de grootte van het dier, de kosten, hoge sterftecijfers en de beschikbaarheid van genetische hulpmiddelen. Hoewel de chirurgische techniek die wordt gebruikt voor het schapenmodel erg lijkt op die bij mensen en kan worden omgekeerd, zijn de belangrijkste nadelen van dit model de kosten van het dier, de lange zwangerschapsperiode en het beperkte aantal operaties mogelijk. Het konijnenmodel heeft een kortere draagtijd en is goedkoper dan het schapenmodel. Het konijnenmodel is echter onomkeerbaar8,9. Het muriene model heeft de laagste kosten, het hoogste aantal foetussen per zwangerschap, het best gekarakteriseerde genoom en algemeen beschikbare hulpmiddelen voor cellulaire en moleculaire analyses. Een belangrijk nadeel is echter het gebrek aan reversibiliteit van de TO, waardoor volledig begrip van de impact van TO wordt voorkomen. Hierin wordt een methode gepresenteerd die alle voordelen van de eerder genoemde modellen combineert en een eenvoudig, potentieel omkeerbaar en minimaal invasief knaagdier TO-model creëert.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle experimenten zijn in overeenstemming met de National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (NIH Publications No. 80023, herzien 1978). De procedure werd goedgekeurd met IACUC protocol #2016-0068 door de Cincinnati Children's Research Foundation Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Voorbereiding
- Om leeftijdsgematchte wild-type (WT) C57BL/6 muizen te paren, plaatst u ze om 18:00 uur in dezelfde kooi.m. en scheidt u ze de volgende dag om 9:00 uur.m.
- Om embryonale dag 0 (E0) te bepalen, kijk naar de vaginale plug, die een homogene buitenste zone heeft die aan de vaginale wand is bevestigd en een binnenzone die vezelig is en enkele spermatozoa bevat die verstrengelde massa's vormen gemengd met de vezels van het plugmateriaal.
- Noteer het gewicht van de muizen op het moment van de paring.
- Weeg de muizen opnieuw op E10 om een voortdurende zwangerschap te garanderen.
- Voer de operatie uit op E16.5 (vroege canaliculaire fase).
- Steriliseer de instrumenten die tijdens de operatie zullen worden gebruikt: schaar, naaldhouder, tang, klemmen en chirurgische messen en handgrepen.
- Verwarm het operatieplatform voor op 24 °C en bereid warme zoutoplossing (24 °C) voor voorafgaand aan de operatie.
- Creëer een warme omgeving voor herstel en laat nat voedsel achter in de kooi voor de vroege voeding.
- Blijf bij de geopereerde dieren totdat ze zichzelf kunnen voeden.
- Houd de geopereerde muizen na de operatie alleen in hun individuele kooien.
2. Anesthesie
- Breng 1 uur voor de ingreep subcutaan 0,1 mg/kg buprenorfine aan op de zwangere moeder.
- Gebruik 5 ml/h isofluraan voor inductie en 2 ml/h continu tijdens de anesthesieprocedure.
- Controleer de bewegingen van de kinnen van de zwangere muizen.
3. Laparotomie
- Reinig het buikoppervlak met alcohol en povidon-jodium. Houd steriele omstandigheden gedurende de hele operatie.
- Voer een verticale incisie uit voor de laparotomie van zwangere moeders. Snijd alle lagen afzonderlijk.
- Identificeer baarmoederhoorns aan elke kant.
- Bepaal de kandidaat foetussen voor de operatie.
OPMERKING: Werk niet op de foetussen die het dichtst bij de vagina liggen. - Opereer op twee foetussen in elke baarmoederhoorn als er een even aantal foetussen aan elke kant zijn (4 meestal), en op 1 foetus in elke baarmoederhoorn als er een oneven aantal van de baarmoeder is (3 meestal).
4. Tracheale occlusie
- Gebruik 2,5x vergrotingsbril voor visualisatie.
- Plaats de baarmoederhoorn op een dwarse manier.
- Neem de pups, naar boven gericht, tussen twee vingers met behulp van de ogen van de pups en de staart als een gids om de foetus te positioneren.
- Oefen zachte druk uit op het hoofd van de pup om verlenging van het hoofd en dus visualisatie van de nek mogelijk te maken.
- Gebruik een 6.0 polypropyleen hechtdraad met een atraumatische naald om TO uit te voeren (Figuur 1). Houd de placenta aan de zijkant en ver van de in- en uitgangen van de naald.
- Steek de naald dwars door de zijkant van de baarmoeder, weg van de placenta door het 1/3rd voorste deel van de nek.
- Beweeg de naald voorzichtig tot de middellijn van de nek en richt deze naar het voorste deel en verlaat vervolgens de nek tussen de luchtpijp en tegenover de halsslagader en baarmoeder.
- Knoop de hechtdraad, zorg ervoor dat de integriteit van de membranen en de baarmoederwand behouden blijft en houd de navelstreng veilig tijdens het knopen.
Figuur 1: Tracheale occlusie. (A) De trans-uteriene hechting die door de nek gaat. (B) Schematische weergave van de structuren nadat de hechting door en voor de knoop gaat. Afkortingen: C = Halsslagader; J = Halsader; T =Luchtpijp; E = Slokdarm; V = Wervel. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
5. Buikwandsluiting
- Vervang de baarmoederhoorn in de buik.
- Injecteer 2 ml warme steriele zoutoplossing in de buikholte voor sluiting.
- Plaats een lopende 5/0 polyglactine hechtdraad om de buikwand te sluiten en sluit de huid met een niet-lopende zijden hechtdraad.
- Breng intraperitoneaal 0,1 mg/kg buprenorfine aan voor analgesie en laat het herstel van de dam in een warme incubator toe.
6. Oogst
- Breng anesthesie aan op de zwangere moeder en oogst alle foetussen op E18,5 door middel van een keizersnede.
- Controleer de levensvatbaarheid van de foetussen door de bewegingen van de foetussen te bekijken.
- Gebruik ten minste twee verschillende technieken voor de euthanasie: koolstofdioxide-insufflatie en cervicale dislocatie.
- Verwijder de lichamen volgens de voorschriften van het veterinair laboratorium.
- Weeg alle foetussen.
- Voer een verticale incisie uit op de thorax voor thoracotomie om de longen te verwijderen.
- Ontleed de longen van embryo's en weeg ze om de totale verhouding tussen longen en lichaamsgewicht te berekenen (LBWR = (linkerlonggewicht + rechterlonggewicht)/lichaamsgewicht x100).
7. Histologie
- Bevries de weefsels in vloeibare stikstof, optimale snijtemperatuursamenstelling en droogijs.
- Snijd de monsters in secties van 10 μm met behulp van een cryostaat en monteer ze op met polylysine bedekte dia's.
- Bak de dia's 's nachts op 60 °C en bevlek de gebakken dia's met hematoxyline en eosine voordat u ze monteert voor beeldverwerving bij 10-20x vergroting met behulp van een breedveldmicroscoop.
8. Weefselverwerking voor eiwit- en DNA-analyses
- Bevries de ontlede foetale longen en homogeniseer ze in 300 μL radio-immuunrecipitatietestbuffer. Centrifugeer bij 4 °C gedurende 5 min bij 18.000 × g.
- Eiwit, DNA en RNA10,12extraheren en kwantificeren.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Deze studie onderzocht 37 foetussen: 20 (54,1%) vs. 17 (45,9%) als controle. Omdat de luchtpijp niet kon worden afgesloten bij 4 foetussen in de TO-groep, werden ze uitgesloten van het onderzoek. Er was geen significant verschil in mortaliteit in beide groepen: 4 foetussen (25%) in de TO-groep en 2 foetussen (12%) in de controlegroep (p=0,334, odds ratio (OR) 2,5, 95% betrouwbaarheidsinterval (CI) 0,39-16,05). Het gemiddelde lichaamsgewicht, het longgewicht en de verhouding tussen longen ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Deze methode beschrijft een chirurgische procedure van foetale tracheale occlusie bij muizen en de impact ervan op de longontwikkeling. Er zijn enkele kritieke stappen in het protocol die zorgvuldig moeten worden uitgevoerd voor een succesvolle TO. De warmte van het platform waarop de operatie plaatsvindt en de zoutoplossing die in de buikholte wordt geïntroduceerd, is cruciaal voor de progressie van de zwangerschap. Bovendien moet een lichte druk worden uitgeoefend op het hoofd van de pups om blootstelling van de nek te...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets bekend te maken.
Dankbetuigingen
Dit onderzoek heeft geen specifieke subsidie ontvangen van financieringsinstellingen in de publieke, commerciële of non-profitsector. Alle auteurs hebben een substantiële bijdrage geleverd aan de conceptie en het ontwerp van de studie, verwerving, analyse en interpretatie van gegevens, het opstellen van het artikel en het herzien ervan voor belangrijke intellectuele inhoud en definitieve goedkeuring van de in te dienen versie. De auteurs danken Can Sabuncuoğlu voor zijn vriendelijke inspanningen voor de productie van het kunstwerk van de chirurgische techniek.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Buprenorfine | Par Pharmaceutical | NDC 42023-179-05 | Voor regionale anesthesie |
| Isofluraan | Halocarbon Life Sciences | NDC 66794-017-25 | Voor algemene anesthesie |
| Vergrootglas | USA Medical-Surgical | SLR-250LBLK | Minimaal 2,5x |
| Nikon 90i microscoop | Nikon | 3417 | Gemotoriseerde fluorescentie |
| Nucleospin weefselkit | Macherey-Nagel, Düren, Duitsland | 740952.5 | DNA-isolatie |
| Pierce BCA-eiwitbepalingskit | Thermo Fisher, IL, USA | 23225 | Eiwitkwantificering |
| Polyglactin-naad | Ethicon | VCP451H | 4-0, 24 mm, snijdend |
| Polylysine-dia's | VWR | 48382-117 | Microscoop-adhesiedia's |
| Polypropyleen-naad | Ethicon | Y432H | 6-0, 13 mm 1/2c Taperpoint |
| RIPA-buffer | Sigma-Aldrich, Missouri, USA | R0278-50ml | Eiwitisolatie |
| Zijdena naad | Ethicon | VCP682G | 4-0, 24 mm, snijdend |
| Trizol | Invitrogen | 15596026 | RNA-isolatie |
Referenties
- Wright, N. J. Global PaedSurg Research Collaboration. Management and outcomes of gastrointestinal congenital anomalies in low, middle and high income countries: protocol for a multicentre, international, prospective cohort study. BMJ Open. 9, 030452(2019).
- Aydin, E. Current approach for prenatally diagnosed congenital anomalies that requires surgery. Turkish Clinics Journal of Gynecology and Obstetrics. 27, 193-199 (2016).
- Nolan, H., et al. Hemorrhage after on-ECMO repair of CDH is equivalent for muscle flap and prosthetic patch. Journal of Pediatric Surgery. 54 (10), 2044-2047 (2019).
- Aydin, E., et al. Congenital diaphragmatic hernia: the good, the bad, and the tough. Pediatric Surgery International. 35 (3), 303-313 (2019).
- Aydın, E., Özler, O., Burns, P., Lim, F. Y., Peiró, J. L. Left congenital diaphragmatic hernia-associated musculoskeletal deformities. Pediatric Surgery International. 35 (11), 1265-1270 (2019).
- Aydın, E., et al. When primary repair is not enough: a comparison of synthetic patch and muscle flap closure in congenital diaphragmatic hernia. Pediatric Surgery International. 36 (4), 485-491 (2020).
- Wilson, M., Difiore, J. W., Peters, C. A. Experimental fetal tracheal ligation prevents the pulmonary hypoplasia associated with fetal nephrectomy: Possible application for congenital diaphragmatic hernia. Journal of Pediatric Surgery. 28 (11), 1433-1440 (1993).
- Mudri, M., et al. The effects of tracheal occlusion on Wnt signaling in a rabbit model of congenital diaphragmatic hernia. Journal of Pediatric Surgery. 54 (5), 937-944 (2019).
- Khan, P. A., Cloutier, M., Piedboeuf, B. Tracheal occlusion: a review of obstructing fetal lungs to make them grow and mature. American Journal of Medical Genetics. Part C, Seminars in Medical Genetics. 145 (2), 125-138 (2007).
- Chomczynski, P. A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from cell and tissue samples. Biotechniques. 15 (3), 532-537 (1993).
- Beurskens, N., Klaassens, M., Rottier, R., De Klein, A., Tibboel, D. Linking animal models to human congenital diaphragmatic hernia. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 79 (8), 565-572 (2007).
- Varisco, B. M., et al. Excessive reversal of epidermal growth factor receptor and ephrin signaling following tracheal occlusion in rabbit model of congenital diaphragmatic hernia. Molecular Medicine. 22, 398-411 (2016).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
