Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Directe bioprinting van 3D-meercellige borstsferoïden op endotheelnetwerken

4.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/61791

⸱

2 november 2020

 , 
1Department of Biology, Drexel University, 2Fischell Department of Bioengineering, University of Maryland

In dit artikel

Samenvatting

Het doel van dit protocol is om borsteptheelcellen rechtstreeks bioprinten als meercellige sferoïden op voorgevormde endotheelnetwerken om snel 3D-borst-endotheel co-cultuurmodellen te creëren die kunnen worden gebruikt voor geneesmiddelenscreeningsstudies.

Samenvatting

Bioprinting ontpopt zich als een veelbelovend hulpmiddel om 3D-menselijke kankermodellen te fabriceren die kritieke kenmerken van in vivo weefselarchitectuur beter samenvatten. In de huidige laag-voor-laag extrusie bioprinting worden individuele cellen geëxtrudeerd in een bioink samen met complexe ruimtelijke en temporele signalen om hiërarchische weefsel zelfassemblage te bevorderen. Deze biofabricatietechniek is echter gebaseerd op complexe interacties tussen cellen, bioinks en biochemische en biofysische signalen. Zelfassemblage kan dus dagen of zelfs weken duren, kan specifieke bioinks vereisen en kan niet altijd optreden wanneer er meer dan één celtype bij betrokken is. Daarom ontwikkelden we een techniek om voorgevormde 3D borsteperiële sferoïden direct te bioprinten in een verscheidenheid aan bioinks. Bioprinted voorgevormde 3D borst epitheel sferoïden hielden hun levensvatbaarheid en gepolariseerde architectuur na het afdrukken. We hebben bovendien de 3D-sferoïden geprint op vasculaire endotheelcelnetwerken om een co-cultuurmodel te creëren. Zo creëert de nieuwe bioprintingtechniek snel een meer fysiologisch relevant 3D-menselijk borstmodel tegen lagere kosten en met een hogere flexibiliteit dan traditionele bioprintingtechnieken. Deze veelzijdige bioprinttechniek kan worden geëxtrapoleerd om 3D-modellen van andere weefsels in extra bioinks te maken.

Inleiding

3D in vitro vasculaire tumormodellen zijn essentiële hulpmiddelen voor mechanistische studie van kankergroei en uitzaaiingen. Met name voor borstkanker organiseren borsteptheelcellen die in Matrigel worden gekweekt zich in gepolariseerde sferoïden die meer lijken op de in vivo mammary acinus-architectuur1,2,3,4,5,6,7,8. 3D borst epitheelcelcultuur beïnvloedt ook celfunctie, met 3D culturen die verschillen in epidermale groeifactor (EGF) receptormodulatietonen 8,9; oncogene functie, met inbegrip van ErbB210; groei en apoptose die11,12signaleren ; en chemotherapieresistentie13,14. Vasculaire endotheelcellen reageren op dezelfde manier anders op omgevingsprikkels in 3D versus traditionele 2D-cultuur15,16,17,18. Veel van het begrip van vasculaire endotheel- en borsteperiële interacties komt echter voort uit de 2D-cultuur met behulp van geconditioneerde medium- of Transwell-inserts, of 3D-modellen waarin de twee celtypen fysiek gescheiden zijn19,20,21,22,23. Deze co-cultuurmodellen bieden beperkt fysiologisch inzicht, omdat zowel 3D-cultuur als celcelcontact van cruciaal belang zijn voor vasculaire endotheel - borsteperiële celinteracties24,25,26.

3D kankermodellen zijn vervaardigd met behulp van een verscheidenheid aan technieken, waaronder hangende druppel sferoïde vorming, bioprinting, magnetische assemblage en cultuur binnen hydrogels of op ontworpen steigers5,27,28,29. Meer recent werden 3D-tumormodellen gemaakt met meerdere celtypen gerangschikt in hun respectieve 3D-structuren. In een voorbeeld van een tumor-op-een-chip platform, kanker, endotheel, entromale cellen werden gemengd in een matrix en vervolgens geïnjecteerd in de drie centrale weefselkamers in een polydimethylsiloxaan (PDMS) apparaat. De weefselkamers werden begrensd door twee buitenste kanalen die een slagader en venule vertegenwoordigden. Na 5-7 dagen cultuur vormden endotheelcellen een microvasculaire netwerk en verspreidden kankercellen zich om kleine tumoren in de buurt van de vasculatuur te vormen. Dit platform werd vervolgens gebruikt om drugs en drugscombinaties te screenen30. Er zijn extra tumor-op-een-chipplatforms gecreëerd om uitzaaiingen en kankertypen te bestuderen met specifieke mechanische stimuli (bijv. mechanische belasting in de longen)31,32. Deze platforms omvatten echter over het algemeen niet zowel vasculatuur als kanker in hun respectieve 3D-structuren.

Biofabrication toont grote belofte in het bevorderen van 3D in vitro vascularized tumormodellen, aangezien het strakke ruimtelijke controle over cellocatie mogelijk maakt. Ondanks de groei van bioprinting in het afgelopen decennium, richten weinig studies zich specifiek optumoren 33,34. In een voorbeeld werd 3D-printen van HeLa-cellen in een gelatine/alginaat/fibrinogeenhydrogel gebruikt om een in vitro baarmoederhalskankermodel te maken. Tumorcellen werden bioprinted als individuele cellen en vervolgens toegestaan om sferoïden te vormen, die een hogere proliferatiesnelheid, verhoogde matrix metalloproteinase expressie en een hogere chemoresistance vertoonden dan cellen in 2D-cultuur35. In deze studies werden, net als in vele andere36,37, gescheiden celsuspensies bioprinted, en vervolgens werden de celculturen voorzien van de vereiste mechanische en biochemische signalen om de cellen in staat te stellen een 3D-structuur te vormen. Cellulaire zelfassemblage kan echter dagen of weken duren, kan complexe ruimtelijke en temporele omgevingssignalen vereisen of kan niet optreden wanneer twee celtypen naast elkaar worden gekweekt. Bijvoorbeeld, borst epitheelcellen geïnduceerde celdood in endotheelcellen in 2D co-cultuur, en dissociated borst epitheelcellen vormden geen 3D sferoïden toen bioprinted in alginaat/gelatine hydrogels38. Dissociated borst epitheel of kankercellen vormden sferoïden in bioinks op basis van alginaat alleen wanneer ze in cirkelvormige PDMS-mallen waren ingesloten. In andere gevallen werden sferoïden gevormd met behulp van hangende druppels in cirkelvormige putplaten met ultralage bevestiging en vervolgens gemengd in bioinks op basis van alginaat39,40.

We beschrijven nu een alternatieve 3D weefsel biomanufacturing methode in dit protocol. In plaats van gedissocieerde cellen te zaaien en te wachten tot deze cellen de 3D-structuren vormen, beschrijven we hoe we 3D-tumorsferoïden op een vasculair buisnetwerk kunnen maken en bioprinten om een tumorcocultuurmodel te creëren dat bijna onmiddellijk kan worden gebruikt. Tumorsferoïden kunnen in vitro worden gekweekt of afkomstig zijn van menselijke weefsels (organoïden). Op dezelfde manier kunnen vasculaire buizen worden gekweekt of kunnen worden afgeleid van adiposeweefsel microvasculaire fragmenten. Bioinks kan variëren van biologisch inactief alginaat tot het zeer biologisch actieve Matrigel41. Aangezien dit 3D tumor co-cultuurmodel met een verscheidenheid van celstructuren en bioinks kan worden gecre ërd, kan het veelvoudige celtypes, extracellulaire matrices, en chemokine gradiënten15,42omvatten. Hoewel in de huidige formulering de endotheelnetwerken niet kunnen worden doordrongend, kunnen toekomstige iteraties deze methode integreren met microfluïden of -on-chip-systemen. Bioprinting 3D borst epitheel sferoïden op endotheelnetwerken maakt snelle biofabrication van menselijke borstmodellen voor drug testen en gepersonaliseerde precisie geneeskunde27.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Borst epitheelcelgroei en testmedia

  1. MCF10A borst epitheelcellen
    OPMERKING: De niet-tumorigeen vereeuwigde borstep epitheelcellijn is afgeleid van een patiënt met fibrocystische ziekte43. Cellen drukken geen oestrogeenreceptor uit.
    1. Om 20 μg/ml epidermale groeifactor (EGF) voor te bereiden, lost u 100 μg gelyophiliseerde EFG op in 500 μL steriele dH2O om 200 μg/ml EFG te maken. Voeg 500 μL van 200 μg/ml EFG toe aan 4,5 ml steriele 0,1% BSA in dH2O om een EGF-voorraadoplossing van 20 μg/ml te maken. Bewaren bereid 20 μg/ml EFG aliquots bij -20 °C gedurende maximaal 12 maanden.
    2. Om 500 μg/ml hydrocortison te bereiden, verdun 1 mg hydrocortison in 1 ml absolute ethanol (200 proof). Voeg 1 ml steriele DMEM F:12 toe aan dit mengsel om een 500 μg/ml hydrocortisonvoorraadoplossing te maken. Bewaar hydrocortison voorraad aliquots bij -80 °C gedurende maximaal 12 maanden.
    3. Om 10 μg/ml cholera-toxine te bereiden, lost u 1 mg choleratoxinelyophilized poeder op in 1 ml steriele dH2O om een 1 mg/ml cholera-toxinevoorraadoplossing te maken. Bewaar cholera toxine bouillon aliquots bij -80 °C gedurende maximaal 12 maanden.
    4. Voeg voor de bereiding van groeimedium 500 μL EFG (20 μg/ml), 500 μL hydrocortison (500 μg/ml), 5 μL choleratoxine (1 mg/ml), 500 μL runderecieline (10 mg/ml), 10 ml penicilline en streptomycine toe, en 25 ml paardenserum tot 500 ml DMEM F:12 voor een uiteindelijke concentratie van 20 ng/ml EFG, 500 ng/ml hydrocortison, 10 ng/ml choleratoxine, 10 ng/ml rundere insuline, 2% v/v penicilline en streptomycine en 5% v/v paardenserum. De concentratie antibiotica werd verhoogd tot 2% om rekening te houden met een verminderde steriliteit in het bioprintingproces; de antibioticaconcentratie kan echter worden verlaagd tot 1%.
    5. Om Assay Medium voor te bereiden, voegt u 500 μL hydrocortison (500 μg/ml), 5 μL choleratoxine (1 mg/ml), 500 μL rundere insulin (10 mg/ml), 10 ml penicilline en streptomycine toe, en 25 ml paardenserum tot 500 ml DMEM F:12 voor een uiteindelijke concentratie van 500 ng/ml hydrocortison, 10 ng/ml choleratoxine, 10 ng/ml boviene insuline, 2% v/v penicilline en streptomycine, en 5% v/v paardenserum.
  2. MDA-MB-231
    OPMERKING: De triple-negatieve (zonder oestrogeenreceptor, progesteronreceptor en epidermale groeifactorreceptor 2) epitheelcellijn voor borstkanker wordt gemaakt van pleurale effusie van een vrouwelijke patiënt met gemetastaseerd mamma-adenocarcinoom44. Cellen vertegenwoordigen een agressieve, invasieve en slecht gedifferentieerde borstkanker.
    1. Om Groei- en Testmedium voor te bereiden, voegt u 50 ml foetaal runderserum, 10 ml penicilline en streptomycine en 25 ml paardenserum toe aan 500 ml DMEM voor een uiteindelijke concentratie 10% v/v foetaal runderserum, 2% v/v penicilline en streptomycine en 5% v/v paardenserum.

2. Borst epitheelcelcultuur

  1. Zaad 500.000 MCF10A of MDA-MB-231 cellen in een 10 cm (P100) weefselkweekschaal met 10 ml MCF10A of MDA-MB-231 groeimedia. MCF10A- en MDA-MB-231-cellen bereiken >90% samenvloeiing in 48 uur.
  2. Om borsteperiële cellen te passeren, eerst cellen wassen met 10 ml warme PBS.
  3. Maak borsteperiële cellen los door 2 ml van 0,05% Trypsine-EDTA aan de schaal toe te voegen. Plaats de schaal gedurende20-25 minuten in een incubator van 37 °C, 5% CO 2.
  4. Voeg 5 ml MCF10A of MDA-MB-231 Groeimedium toe aan de ge trypsiniseerde cellen om de trypsine te neutraliseren. Pipetteer het celmediamengsel op en neer om cellen te resuspenderen en celclusters op te breken.
  5. Voeg de celsuspensie toe aan een conische buis van 15 ml en centrifugeer gedurende 3 minuten op 1.200 x g. Adem de supernatant voorzichtig aan en resuspendeer de celkorrel in 5 ml MCF10A of MDA-MB-231 Groeimedium.
  6. Plaat 1 ml celsuspensie in 5 nieuwe 10 cm weefselkweekschalen samen met MCF10A of MDA-MB-231 Growth Medium. Plaats de gerechten in een incubator van 37 °C, 5% CO2. Cellen zijn klaar om binnen 2-3 dagen weer te worden doorgegang. MCF10A-cellen kunnen worden gehandhaafd tot passagenummer 35, waarna ze morfologische veranderingen vertonen. MDA-MB-231 cellen kunnen worden onderhouden tot passage nummer 24, waarna ze morfologische veranderingen vertonen.

3. Borst epitheel sferoïde vorming

  1. Vries 200 μL pipetpunten gedurende 30 minuten voordat u met de test begint. Houd de groeifactor reduced matrix oplossing (bijv. Matrigel) (10 mg/ml) gedurende het hele proces in het ijs.
  2. Pipetteer langzaam 30 μL ijskoude matrixoplossing met ijskoude pipetpunten van 200 μL in elke put van een 8-put kamerschuif. Begin vanaf de zijkanten en sleep de pipetpunt langs de hoeken en voeg een laatste druppel toe aan het midden van de put om een gelijkmatige coating van elke put te garanderen. Vermijd luchtbellen tijdens deze stap om een uniforme matrixoplossingslaag te garanderen. Gebruik nieuwe pipet tips voor elke put.
  3. Incubate kamer schuift in een 37 °C, 5% CO2 incubator gedurende 15-20 minuten om de matrixoplossing te polymeriseren.
  4. Resuspend trypsinized MCF10A cellen in MCF10A Assay Medium bij 200.000 cellen/ml of resuspend trypsinized MDA-MB-231 cellen in MDA-MB-231 Growth Medium bij 200.000 cellen/ml.
  5. Als u MCF10A-cellen gebruikt, bereidt u verse MCF10A Spheroid Growth Medium voor door 5 μL EFG (20 μg/ml) en 100 μL matrixoplossing toe te voegen aan 5 ml Assay Medium voor een uiteindelijke concentratie van 2% matrixoplossing.
  6. Verwijder de kamerschuif voorgecoat met matrixoplossing uit de incubator. Voeg 50 μL MCF10A of MDA-MB-231 celsuspensie (10.000 cellen) toe aan elke put. Voeg bij gebruik van MCF10A-cellen 450 μL MCF10A Spheroid Growth Medium toe. Voeg bij gebruik van MDA-MB-231 cellen 450 μL MDA-MB-231 Groeimedium voorgemengd toe met 2% matrixoplossing (9 μL). Plaats de kamerschuif onmiddellijk in een incubator van 37 °C, 5% CO2.
  7. Vervang het medium om de 44 dagen. Pipetteer voorzichtig 200 μL oude media uit één hoek van elke put met behulp van een pipettip van 200 μL. Kantel tijdens dit proces de kamerschuif op 45° om ervoor te zorgen dat de sferoïden niet worden verstoord. Voeg 200 μL vers bereide MCF10A Spheroid Growth Medium of MDA-MB-231 Growth Medium eerder gemengd met 2% matrixoplossing toe aan elke put in de hoek in druppels om ervoor te zorgen dat sferoïden aan de matrixlaag blijven hechten. Slechts ~ 50% van de media wordt vervangen, zodat alle cytokines geproduceerd door de sferoïden niet volledig uitgeput zijn.
    OPMERKING: MCF10A borst epitheel sferoïden duren tot 8 dagen om te polariseren en holle centra te vormen. MDA-MB-231 borst epitheel sferoïden duren tot 5 dagen om zich te vormen en hebben geen holle centra.

4. Endotheelcelnetwerkvorming

  1. Menselijke Navelstreng Ader Endotheelcel (HUVEC) Cultuur
    1. Voeg de inhoud van een enkele Endotheelgroei Medium-2 kit met insuline groeifactor, fibroblast groeifactor, vasculaire endotheel groeifactor, ascorbinezuur, epidermale groeifactor, heparine en gentamicine-amfotericine B, samen met 50 ml foetaal runderserum, 5 ml penicilline-streptomycine en 5 ml glutamine van 200 ml tot 500 ml endotheel basaal medium-2 (EBM-2) om volledig endotheelgroeimedium (EGM-2) te creëren.
    2. Zaai 500.000 endotheelcellen in een weefselkweekschaal van 10 cm in 10 ml EGM-2. Plaats cellen in een 37 °C, 5% CO2 incubator totdat ze >80% confluency (ongeveer 48 uur) bereiken.
    3. Om cellen te passeren, wast u endotheelcellen met 10 ml warme PBS. Maak HUVEC los door 2 ml van 0,05% Trypsin-EDTA toe te voegen aan de weefselkweekschotel van 10 cm. Houd de cellen nauwlettend in de gaten door middel van fasecontrastmicroscopie. Cellen zijn klaar wanneer ze worden dichtgebald, maar blijven aan de schotel bevestigd.
    4. Haal de trypsine voorzichtig uit het gerecht. Voeg 8 ml EGM-2 toe aan de schaal. Was cellen van de schaal door de EGM-2 op en neer over het hele schoteloppervlak te spuiten.
    5. U kunt ook 5 ml EGM-2 toevoegen aan de ge trypsiniseerde cellen om de trypsine te neutraliseren. Pipetteer het celmediamengsel op en neer om cellen te resuspenderen en celclusters op te breken. Voeg de celsuspensie toe aan een conische buis van 15 ml en centrifugeer gedurende 3 minuten op 1.200 x g. Adem de supernatant voorzichtig aan en resuspendeer de celkorrel in 10 ml EGM-2.
    6. Voeg 1 ml celsuspensie toe aan 9 ml EGM-2 in een weefselkweekschaal van 10 cm. Plaats de gerechten in een incubator van 37 °C, 5% CO2. Ruil 2/3 van het medium met verse EGM-2 om de 2 dagen. Cellen zijn binnen 3-5 dagen klaar om door te gaan. HUVEC kan worden onderhouden tot passage 8, waarna ze geen netwerken vormen.
  2. Endothelial Cell (HUVEC) Netwerkvorming
  3. Vries 200 μL pipetpunten gedurende 30 minuten voordat u met de test begint. Houd de groeifactor reduced matrix oplossing (10 mg/ml) gedurende het hele proces in het ijs.
  4. Pipetteer langzaam 30 μL ijskoude matrixoplossing met ijskoude pipetpunten van 200 μL in elke put van een 8-put kamerschuif. Begin vanaf de zijkanten en sleep de pipetpunt langs de hoeken en voeg een laatste druppel toe aan het midden van de put om een gelijkmatige coating van elke put te garanderen. Vermijd luchtbellen tijdens deze stap om een uniforme matrixoplossingslaag te garanderen. Gebruik nieuwe pipet tips voor elke put.
  5. Incubate kamer schuift in een 37 °C, 5% CO2 incubator gedurende 15-20 minuten om Matrigel te polymeriseren.
    1. Bevlek een schaal van 10 cm HUVEC met 10 μL rode cel tracker (1:1000) gedurende 30 minuten in 37 °C, 5% CO2 incubator.
    2. Was endotheelcellen met 10 ml warme PBS. Maak HUVEC los door 2 ml van 0,05% Trypsin-EDTA toe te voegen aan de weefselkweekschotel van 10 cm. Plaats de schaal in een 37 °C, 5% CO2 incubator gedurende 5 minuten om de cellen volledig los te maken.
    3. Voeg 5 ml EGM-2 toe aan het gerecht om de trypsine te neutraliseren. Breng de celsuspensie over in een conische buis van 25 ml. Centrifugeer HUVEC gedurende 5 minuten op 1.200 x g. Aspirateer het supernatant en resuspendeer de celkorrel in 5 ml serumvrije EBM-2.
    4. Tel cellen met Trypan blauw om levensvatbare cellen te bepalen. Maak een 1 x 106 cel/ml oplossing.
    5. Voeg 100.000 HUVEC toe aan elke put met 200 μL serumvrije EBM-2. Als er meer cellen worden toegevoegd, creëren ze een oppervlaktemonolaag in plaats van een buizennetwerk.
    6. Incubeer HUVEC in een 37 °C, 5% CO2 incubator. Na 6 uur, beeld HUVEC netwerken door fase contrast microscopie. Netwerken zijn nu klaar voor cocultuur met borstsferoïden.

5. Bioprinting Borst epitheel sferoïden op voorgevormde HUVEC Netwerken

OPMERKING: Voor het biofabricatieproces moet een biodepositiesysteem met twee sproeiers worden gebruikt. In dit geval had het systeem drie bewegingsarmen om ruimtelijke controle op micronschaal van materiaaldepositie mogelijk te maken, evenals twee schroefaangedreven motoren om bioink te deponeren van 10 ml spuiten. Het systeem moet worden gefunctionaliseerd met een hoog rendement deeltjesluchtfiltratiesysteem en UV-sterilisatiemogelijkheden om een steriele omgeving te behouden tijdens bioprinting. De bioprinter wordt een uur voor het drukproces UV gesteriliseerd.

  1. Maak borst epitheel sferoïden en HUVEC netwerken zoals eerder beschreven. Schat het aantal borsteptoneelsferoïden in elke put door sferoïden te tellen in representatieve fasecontrastmicroscopiebeelden.
  2. Snijd 0,5 cm van het uiteinde van een pipettip van 1000 μL. Gebruik de gesneden pipettip om alle sferoïden voorzichtig uit de 8-put kamerschuif en in een buis van 50 ml te spuiten. Resuspend sferoïden in het geselecteerde bioink bij 100 sferoïden/100 μL.
    OPMERKING: Hogere sferoïdconcentraties kunnen leiden tot clustering van sferoïden en kunnen visualisatie van interacties tussen de sferoïden en de endotheelnetwerken voorkomen.
  3. Geef het sferoïdmengsel door een celzeef van 70 μm om grote of geclusterde sferoïden te verwijderen.
  4. Laad de samengevoegde sferoïden in een steriele spuit van 10 ml en sluit deze af met een steriele naald van 25 meter. Bevestig de spuit aan het biodepositiesysteem.
  5. Aspirateer het medium van de HUVEC-netwerken in de 8-put kamerschuif.
  6. Extrudeer 100 μL borsteperiële sferoïden op 6 putten van HUVEC-netwerken met een debiet van 1 ml/min. Onderhoud 2 putten van HUVEC-netwerken als besturing.
  7. Voeg 400 μL MCF10A Spheroid Growth Medium toe als u MCF10A-sferoïden gebruikt die op HUVEC-netwerken zijn afgedrukt of voeg 400 μL MDA-MB-231 Growth Medium toe dat eerder werd gemengd met 2% matrixoplossing bij gebruik van MDA-MB-231-sferoïden die op HUVEC-netwerken zijn afgedrukt. Het respectieve sferoïde groeimedium moet worden gebruikt in HUVEC-controleputten.
  8. Incubeer coculturen in een incubator van 37 °C, 5% CO2 gedurende 24 – 96 uur zonder mediaverandering. Coculturen blijven maximaal vier dagen levensvatbaar in het oorspronkelijke medium.

6. Confocale Microscopie

  1. Immunofluorescentie en PBS-Glycine Wasbufferpreparaat
    1. Bereid immunofluorescentie (IF) buffer 10x voorraadoplossing door toevoeging van 2,5 g natrium azide, 5 g runderserumalbumine, 10 ml Triton X-100 en 2,05 ml Tween-20 in 500 ml 10x PBS. Pas de pH aan op 7,4. Bewaar de voorraadoplossing tot een jaar bij 4 °C om sedimentatie te voorkomen.
    2. Creëer een werkende IF-buffer door 50 ml 10x IF-buffer te verdunnen in 450 ml steriel gedeïoniseerd water. Bewaar de werkoplossing maximaal een week op kamertemperatuur.
    3. Bereid 10x PBS-Glycine buffervoorraadoplossing door 37,5 g glycine toe te voegen aan 500 ml 10x PBS. Pas de pH aan op 7,4. Bewaar de voorraadoplossing tot 6 maanden bij 4 °C om sedimentatie te voorkomen.
    4. Creëer een werkende PBS-Glycine oplossing door 50 ml 10x PBS-Glycine buffer te verdunnen in 450 ml steriel gedeïoniseerd water. Bewaar de werkoplossing tot een week op 4 °C.
  2. Label Bioprinted Samples and Image door Confocal Microscopy
    1. Aspirate medium uit bioprinted 3D coculturen en spoel 3 keer met warme PBS. Fixeer bioprinted 3D coculturen met 4% paraformaldehyde gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Spoel monsters 3 keer gedurende 20 minuten met 1x PBS-Glycine.
    2. Blokmonsters met IF-buffer gemengd met 10% geitenserum gedurende 90 minuten (primair blok), gevolgd door 40 minuten met IF-buffer plus 10% geitenserum en Affinipure Fab-fragment (1:100, secundair blok).
    3. Als u MCF10A-sferoïden gebruikt, etiketteert u monsters met een primair antilichaam voor integrin α6 (1:100) in secundaire blokkeringsbuffer 's nachts bij 4 °C, gevolgd door een Alexa Fluor 488 secundair antilichaam (1:200) en Hoescht 33342 (1:1000) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur beschermd tegen licht. MCF10A-cellijnen drukken hoge niveaus van integrin α6 uit, wat essentieel is voor het tonen van sferoïde polarisatie en morfologie.
    4. Als u MDA-MB-231-sferoïden gebruikt, die lage niveaus van integrin α6 uitdrukken, label dan monsters met Alexa Fluor 488 falloidine (1:100) en Hoescht 33342 (1:1000) in secundaire blokkeringsbuffer gedurende 4 uur bij kamertemperatuur beschermd tegen licht. Phalloidine maakt actine filamentvisualisatie mogelijk, zodat sferoïde amorfe en invasieve morfologie kan worden beoordeeld.
    5. Was monsters met 1X PBS-glycine 3 keer gedurende 20 minuten.
    6. Bereid monsters voor op montage door de kamerschuif te verwijderen met behulp van het gereedschap van de fabrikant. Voeg een kleine druppel antifade-oplossing toe aan elke put. Plaats op elke kamerschuif een afdeklip van 22 mm x 60 mm en sluit de randen voorzichtig af met een heldere nagellak.
    7. Beeldmonsters met behulp van een confocale microscoop als Z-stapels van ~ 10 plakjes in stappen van 5 μm. Comprimeer indien gewenst Z-vlakken in één vlak met behulp van de opdracht Extended Focus in celbeeldsoftware.
    8. Kwantificeer sferoïde hechting aan endotheelnetwerken met afbeelding J. Het aantal aangehachtigde sferoïden kan worden gekwantificeerd met behulp van de analyseplugin met de juiste deeltjesgrootte en circulariteit. Normaliseer het aantal gekoppelde sferoïden aan het afbeeldingsgebied.
    9. Om reproduceerbaarheid te garanderen, kwantificeert u het aantal aangehuwde sferoïden in 4 x 4 betegelde afbeeldingen van coculturen. Als het sferoïde getal statistisch significant lager is dan andere experimenten, moet het experiment worden herhaald.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Borsteperiële cellen moeten zichzelf organiseren in 3D-sferoïden na 5-8 dagen cultuur op matrixoplossing en in kweekmedium met 2% matrixoplossing. Niet-tumorigeen mcf10a borst epitheel sferoïden moeten rond lijken en hebben een hol centrum, met integrin α6 gepolariseerd aan de buitenste rand van de sferoïde(figuur 1, inzet toont holle centra). Zeer invasieve MDA-MB-231 epitheelcellen van borstkanker vormen onregelmatige sferoïden. Sferoïden moeten worden gebruikt wanneer ze een diameter van ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit protocol is het eerste in zijn soort dat sferoïden bioprint in hun 3D-architectuur voor co-cultuur met endotheelcellen ook in hun 3D-architectuur. Kritieke protocolstappen omvatten de eerste vorming van borsteperiële sferoïden en HUVEC-netwerken. Extreme voorzichtigheid moet worden betracht bij het voeden van epitheelsferoïden, omdat ze gemakkelijk worden verstoord door de matrixoplossing. Evenzo moeten borsteperiële sferoïden met zorg worden behandeld wanneer ze van de matrixoplossing worden gepijpt en in de netwerk...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit onderzoek werd gefinancierd door NIH 1R01HL140239-01 aan AMC. We willen het Cell Imaging Center van de Drexel University bedanken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
37°C incubator, 5% CO2 en 95% vochtigheidSanyoMCO-20AICCel incubatie
3D Bio printerop maat gemaaktGeenGebaat voor bioprinting
8-well kamer slidesVWR, Radnor, PA53106-306voor het zaaien van sferoïden
25-gauge naaldSigma, St. Louis, MOZ192406-100EAbioprinting spuitnaald
Absolute ethanol (200 proof)Sigma, St. Louis, MOE7023-500MLherstelling van media componenten
Affinipure F(ab′)2 fragment geiten anti-muis IgGJackson ImmunoResearch, West Grove, PA115006020secundaire blok - Immunofluorescence
Alexa Fluor 488 (1:200)Thermo Fisher, Waltham, MAA-11006Secundaire antilichaam - Immunofluorescence
Runder insulineSigma, St. Louis, MOI-035-0.5MLMCF10A Media additief
Bovine serum albumine (BSA)Sigma, St. Louis, MOA2153-500GBlokkeerd agent - Immunofluorescence
Falcon 70 µm Cell StrainerCorning, Corning, NY352350Verwijder grote of geclusterde sferoïden
CellTracker™ Red CMTPX DyeThermo Fisher, Waltham, MAC34552Pre-stain voor HUVEC buizen
Compact CentrifugeHermle- Labnet, Edison, NJZ206AVoor cel centrifugaties
Cholera ToxinSigma, St. Louis, MOC8052-.5MGMCF10A Media additief
Conische buizen 15 mLVWR, Radnor, PA62406-200Verzamelen en hersuspensie van cellen
Countess II-FL CeltellerThermo Fisher, Waltham, MAAMQAF1000cellen tellen
Glazen pipetten (10 mL)VWR, Radnor, PA76184-746cel resuspensie
DMEM F:12Thermo Fisher, Waltham, MA11320033MCF10A basale media
DMEM 1XVWR, Radnor, PA10-014-CVMDA-MB-231 basale media
Endotheel basaal medium-2 (EBM-2)Lonza, Durham, NCCC-3156HUVEC basale media
Endotheel groei medium-2 (EGM-2)Lonza, Durham, NCCC-3162Begaat met een Bulletkit (bevattende groeifactoren)
Alexa Fluor™ 488 PhalloidinThermo Fisher, Waltham, MALabeling MDA-MB-231 sferoïden
Foetaal bovien serumCytiva, Logan, UTSH30071.03HUVEC/MDA-MB-231 media additief
Geiten serumThermo Fisher, Waltham, MA16210064Immunofluorescence labeling component
GlycineSigma, St. Louis, MOG8898-500Gimmunofluorescence buffer component
Hoescht 33342Thermo Fisher, Waltham, MA62249Kernvlek immunofluorescence
Paarden serumThermo Fisher, Waltham, MA16050130MCF10A Media additief
HydrocortisonSigma, St. Louis, MOH0888-5GMCF10A Media additief
Menselijke umbilicale vene endotheliale cellen (HUVECs)Cel toepassingen, San Diego, CA200-05fEndotheel cel lijnen
Integrine α6Millipore, Billerica, MAMAB1378Immunofluorescence sferoïde labeling component
Live Dead assayThermo Fisher, Waltham, MAL3224Live en dode cel stain assay voor cel levensvatbaarheid
LSM 700 Confocale microscoopZeiss, Thornwood, NYGebaat om cellen te visualiseren
Matrigel - growth factor gereduceerd 10 mg/mlVWR, Radnor, PA354230Sferoïde vorming
MCF10A cellenATCCCRL-10317Borstcel lijn
MDA-MB-231 cellenATCCHTB-26Borstcel lijn
ParaformaldehydeSigma, St. Louis, MO158127-500Gcel fixatief
Penicilline en streptomycineThermo Fisher, Waltham, MA15140122MCF10A / MDA-MB-231/HUVEC Media additief
Fosfaat gebufferde saline 1X (PBS)Thermo Fisher, Waltham, MA7001106Was buffer voor cellen voor trypsinisatie
Fosfaat buffer saline 10XThermo Fisher, Waltham, MAAM9625immunofluorescence buffer component
Prolong gold antifadeThermo Fisher, Waltham, MAP36934immunofluorescence bevestigingsmiddel
Recombinant Human Epidermal Growth Factor, EGFPeprotech, Rocky Hill, NJAF-100-15MCF10A/ assay media component
Natrium AzideSigma, St. Louis, MOS2002-25Gimmunofluorescence buffer component
Steriele spuit (10 mL)VWR, Radnor, PA75846-757bioprinting proces
Weefsel kweek schaal (10cm)VWR, Radnor, PA25382-166monolayer cel kweek
Triton X-100Sigma, St. Louis, MOT8787-250MLimmunofluorescence buffer component
Trypan blauw 0.4%Thermo Fisher, Waltham, MA15250061celteller additief
Trypsin-EDTA 0.05%Thermo Fisher, Waltham, MA25300054cel losmaking
Tween -20Thermo Fisher, Waltham, MA85113immunofluorescence buffer component
Vasculair Endotheel Groei Factor (VEGF165)Peprotech, Rocky Hill, NJ100-20HUVEC buis additief
Volocity 6.3 cel beeldvormingssoftwarePerkinElmer, Hopkinton, MAZ stack compressor

Referenties

  1. Barcellos-Hoff, M. H., Aggeler, J., Ram, T. G., Bissell, M. J. Functional differentiation and alveolar morphogenesis of primary mammary cultures on reconstituted basement membrane. Development. 105 (2), 223-235 (1989).
  2. Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
  3. Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (19), 9064-9068 (1992).
  4. Weaver, V. M., et al. Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies. Journal of Cell Biology. 137 (1), 231-245 (1997).
  5. Sokol, E. S., et al. Growth of human breast tissues from patient cells in 3D hydrogel scaffolds. Breast Cancer Research. 18 (1), 19(2016).
  6. Howlett, A. R., Bailey, N., Damsky, C., Petersen, O. W., Bissell, M. J. Cellular growth and survival are mediated by beta 1 integrins in normal human breast epithelium but not in breast carcinoma. Journal of Cell Science. 108, Pt 5 1945-1957 (1995).
  7. Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (19), 9064-9068 (1992).
  8. Weaver, V. M., et al. Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies. Journal of Cell Biology. 137 (1), 231-245 (1997).
  9. Wang, F., et al. Reciprocal interactions between beta1-integrin and epidermal growth factor receptor in three-dimensional basement membrane breast cultures: a different perspective in epithelial biology. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (25), 14821-14826 (1998).
  10. Muthuswamy, S. K., Li, D., Lelievre, S., Bissell, M. J., Brugge, J. S. ErbB2, but not ErbB1, reinitiates proliferation and induces luminal repopulation in epithelial acini. Nature Cell Biology. 3 (9), 785-792 (2001).
  11. Kirshner, J., Chen, C. J., Liu, P., Huang, J., Shively, J. E. CEACAM1-4S, a cell-cell adhesion molecule, mediates apoptosis and reverts mammary carcinoma cells to a normal morphogenic phenotype in a 3D culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (2), 521-526 (2003).
  12. Debnath, J., et al. The role of apoptosis in creating and maintaining luminal space within normal and oncogene-expressing mammary acini. Cell. 111 (1), 29-40 (2002).
  13. Weaver, V. M., et al. beta4 integrin-dependent formation of polarized three-dimensional architecture confers resistance to apoptosis in normal and malignant mammary epithelium. Cancer Cell. 2 (3), 205-216 (2002).
  14. Yamada, K. M., Clark, K. Cell biology: survival in three dimensions. Nature. 419 (6909), 790-791 (2002).
  15. Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions. Journal of Cell Science. 116, Pt 12 2377-2388 (2003).
  16. Weigelt, B., Ghajar, C. M., Bissell, M. J. The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer. Advanced Drug Delivery Reviews. 69-70, 42-51 (2014).
  17. Koh, W., Stratman, A. N., Sacharidou, A., Davis, G. E. In vitro three dimensional collagen matrix models of endothelial lumen formation during vasculogenesis and angiogenesis. Methods in Enzymology. 443, 83-101 (2008).
  18. Sacharidou, A., et al. Endothelial lumen signaling complexes control 3D matrix-specific tubulogenesis through interdependent Cdc42- and MT1-MMP-mediated events. Blood. 115 (25), 5259-5269 (2010).
  19. Buchanan, C. F., et al. Cross-talk between endothelial and breast cancer cells regulates reciprocal expression of angiogenic factors in vitro. Journal of Cellular Biochemistry. 113 (4), 1142-1151 (2012).
  20. Szot, C. S., Buchanan, C. F., Freeman, J. W., Rylander, M. N. In vitro angiogenesis induced by tumor-endothelial cell co-culture in bilayered, collagen I hydrogel bioengineered tumors. Tissue Engineering Part C: Methods. 19 (11), 864-874 (2013).
  21. Franses, J. W., Baker, A. B., Chitalia, V. C., Edelman, E. R. Stromal endothelial cells directly influence cancer progression. Science Translational Medicine. 3 (66), 66(2011).
  22. Franses, J. W., Drosu, N. C., Gibson, W. J., Chitalia, V. C., Edelman, E. R. Dysfunctional endothelial cells directly stimulate cancer inflammation and metastasis. International Journal of Cancer. 133 (6), 1334-1344 (2013).
  23. Phamduy, T. B., et al. Printing cancer cells into intact microvascular networks: a model for investigating cancer cell dynamics during angiogenesis. Integrative Biology. 7 (9), Cambridge. 1068-1078 (2015).
  24. Connor, Y., et al. Physical nanoscale conduit-mediated communication between tumour cells and the endothelium modulates endothelial phenotype. Nature Communications. 6, 8671(2015).
  25. Ghajar, C. M., et al. The perivascular niche regulates breast tumour dormancy. Nature Cell Biology. 15 (7), 807-817 (2013).
  26. Strilic, B., et al. Tumour-cell-induced endothelial cell necroptosis via death receptor 6 promotes metastasis. Nature. 536 (7615), 215-218 (2016).
  27. Asghar, W., et al. Engineering cancer microenvironments for in vitro 3-D tumor models. Materials Today. 18 (10), Kidlington. 539-553 (2015).
  28. Belgodere, J. A., et al. Engineering Breast Cancer Microenvironments and 3D Bioprinting. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 66(2018).
  29. Jang, J., Yi, H. G., Cho, D. W. 3D Printed Tissue Models: Present and Future. ACS Biomaterials Science & Engineering. 2 (10), 1722-1731 (2016).
  30. Sobrino, A., et al. 3D microtumors in vitro supported by perfused vascular networks. Scientific Reports. 6, 31589(2016).
  31. Chen, M. B., Whisler, J. A., Jeon, J. S., Kamm, R. D. Mechanisms of tumor cell extravasation in an in vitro microvascular network platform. Integrative Biology. 5 (10), Cambridge. 1262-1271 (2013).
  32. Hassell, B. A., et al. Human Organ Chip Models Recapitulate Orthotopic Lung Cancer Growth, Therapeutic Responses, and Tumor Dormancy In vitro. Cell Reports. 21 (2), 508-516 (2017).
  33. Knowlton, S., Onal, S., Yu, C. H., Zhao, J. J., Tasoglu, S. Bioprinting for cancer research. Trends in Biotechnology. 33 (9), 504-513 (2015).
  34. Asghar, W., et al. Engineering cancer microenvironments for in vitro 3-D tumor models. Materials Today. 18 (10), 539-553 (2015).
  35. Zhao, Y., et al. Three-dimensional printing of Hela cells for cervical tumor model in vitro. Biofabrication. 6 (3), 035001(2014).
  36. Zhang, Y. S., et al. Bioprinting the Cancer Microenvironment. ACS Biomaterials Science & Engineering. 2 (10), 1710-1721 (2016).
  37. Ouyang, L., et al. Three-dimensional bioprinting of embryonic stem cells directs highly uniform embryoid body formation. Biofabrication. 7 (4), 044101(2015).
  38. Swaminathan, S., Ngo, O., Basehore, S., Clyne, A. M. Vascular Endothelial-Breast Epithelial Cell Coculture Model Created from 3D Cell Structures. ACS Biomaterials Science & Engineering. 3 (11), 2999-3006 (2017).
  39. Vorwald, C. E., Ho, S. S., Whitehead, J., Leach, J. K. High-Throughput Formation of Mesenchymal Stem Cell Spheroids and Entrapment in Alginate Hydrogels. Methods in Molecular Biology. 1758, 139-149 (2018).
  40. Chaji, S., Al-Saleh, J., Gomillion, C. T. Bioprinted Three-Dimensional Cell-Laden Hydrogels to Evaluate Adipocyte-Breast Cancer Cell Interactions. Gels. 6 (1), (2020).
  41. Swaminathan, S., Hamid, Q., Sun, W., Clyne, A. M. Bioprinting of 3D breast epithelial spheroids for human cancer models. Biofabrication. 11 (2), 025003(2019).
  42. Radisky, D., Muschler, J., Bissell, M. J. Order and disorder: the role of extracellular matrix in epithelial cancer. Cancer Investigation. 20 (1), 139-153 (2002).
  43. Qu, Y., et al. Evaluation of MCF10A as a Reliable Model for Normal Human Mammary Epithelial Cells. PLoS One. 10 (7), 0131285(2015).
  44. Chavez, K. J., Garimella, S. V., Lipkowitz, S. Triple negative breast cancer cell lines: one tool in the search for better treatment of triple negative breast cancer. Breast Disease. 32 (1-2), 35-48 (2010).
  45. Swaminathan, S., Cranston, A. N., Clyne, A. M. A Three-Dimensional In vitro Coculture Model to Quantify Breast Epithelial Cell Adhesion to Endothelial Cells. Tissue Engineering Part C: Methods. 25 (10), 609-618 (2019).
  46. Lee, J. M., et al. Generation of uniform-sized multicellular tumor spheroids using hydrogel microwells for advanced drug screening. Scientific Reports. 8 (1), 17145(2018).
  47. Frueh, F. S., Spater, T., Scheuer, C., Menger, M. D., Laschke, M. W. Isolation of Murine Adipose Tissue-derived Microvascular Fragments as Vascularization Units for Tissue Engineering. Journal of Visualized Experiments. (122), e55721(2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

3D bioprintenvasculair netwerkbioprinttechniekfasecontrastmicroscopieconfocale microscopiesfero devormingHUVEC netwerkbioinkconcentratie
Directe bioprinting van 3D-meercellige borstsferoïden op endotheelnetwerken
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.