Method Article

Een verbeterd tijd- en arbeidsefficiënt protocol voor primaire hepatocytenisolatie bij muizen

DOI:

10.3791/61812

⸱

October 25th, 2021

 ,  , 
1Department of Pediatrics, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Physiology, Temple University School of Medicine, 3Department of Pediatrics, Seattle Children’s Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Primaire hepatocyten zijn een waardevol hulpmiddel om leverrespons en metabolisme in vitro te bestuderen. Met behulp van in de handel verkrijgbare reagentia werd een verbeterd tijd- en arbeidsefficiënt protocol voor primaire hepatocytenisolatie bij muizen ontwikkeld.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Primaire hepatocyten worden op grote schaal gebruikt in lever in vitro onderzoek, vooral in glucosemetabolisme studies. Een basistechniek is aangepast op basis van verschillende behoeften, zoals tijd, arbeid, kosten en primair hepatocytengebruik, wat resulteert in verschillende primaire hepatocytenisolatieprotocollen. De vele stappen en tijdrovende reagenspreparaten in primaire hepatocytenisolatie zijn echter grote nadelen voor de efficiëntie. Na het vergelijken van verschillende protocollen voor hun voor- en nadelen, werden de voordelen van elk gecombineerd en werd een snel en efficiënt primair hepatocytenisolatieprotocol geformuleerd. Binnen slechts ~ 35 minuten zou dit protocol evenveel, zo niet meer, gezonde primaire hepatocyten kunnen opleveren als andere protocollen. Verder valideerden glucosemetabolisme-experimenten uitgevoerd met behulp van de geïsoleerde primaire hepatocyten het nut van dit protocol in in vitro levermetabolismestudies. We hebben ook uitgebreid de betekenis en het doel van elke stap in deze studie beoordeeld en geanalyseerd, zodat toekomstige onderzoekers dit protocol verder kunnen optimaliseren op basis van behoeften.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De lever dient als een van de belangrijkste organen in het gewervelde lichaam vanwege de vitale rol die het speelt in tal van levensondersteunende functies zoals voedselvertering, bloedcirculatie en ontgifting. Het gebruik van primaire hepatocyten in vitro kweek van muizen wordt steeds populairder in studies naar koolhydraatmetabolisme en levercarcinoom. Daarom is het belangrijk om een handige methode te ontwikkelen voor primaire hepatocytenisolatie bij muizen met behoud van de aangeboren fysiologische functie. Vanwege zijn functie als een hub van glucosemetabolisme, staat de lever ook centraal in de glucoseproductie en -opslag1. Experimenten met primaire hepatocyten in vitro zijn een must voor de meeste glucosemetabolismestudies. Daarom hebben verschillende onderzoeksgroepen jarenlang protocollen ontwikkeld voor primaire hepatocytenisolatie van muizen.

De algemene procedure van muishepatocytenisolatie is om eerst bloed in de lever weg te spoelen met een isosmotische vloeistof zoals fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) of Hanks 'Balanced Salt Solution (HBSS) en vervolgens collagenase-bevattende oplossing te gebruiken om hepatocyten te dissociëren. Deze protocollen delen een algemene procedure, maar verschillen in reagentia en stappen op basis van verschillende behoeften. Het voorbereiden van vereiste reagentia en het uitvoeren van isolatiestappen kost echter tijd. Bij de ontwikkeling van het huidige protocol is efficiëntie voorop gesteld, waarbij alle reagentia gebruiksklaar en uit de markt leverbaar zijn, en zo min mogelijk stappen. Het algemene doel van dit protocol is om een snelle en arbeidsefficiënte methode te bieden om primaire hepatocyten van muizen te isoleren, zonder de geïsoleerde primaire hepatocytenzuiverheid en levensvatbaarheid in gevaar te brengen.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle procedures werden goedgekeurd door de Johns Hopkins Animal Care and Use Committee. C57BL/6 vrouwelijke muizen (8 weken oud) werden gebruikt in deze studie.

1. Voorbereiding:

  1. Meng William's E Medium (GlutaMAX Supplement) met 10% FBS en 1% antibiotisch-antimycotische oplossing om het kweekmedium te maken.
  2. Filter 25 ml collagenase-dispase medium (bijv. Liver Digest Medium) door een spuitfilter van 0,45 μm om deeltjesresten te verwijderen.
  3. Verwarm 50 ml dubbel gedestilleerd H2O (ddH2O), 35 ml perfusiemedium (bijv. leverperfusiemedium) (of 50 ml bij de eerste keer met behulp van dit protocol) en 25 ml gefilterd collagenase-dispase medium in een waterbad van 45 °C gedurende 30 minuten.
  4. Meng in een steriele weefselkweekkap 2 ml 10x HBSS en 18 ml Percoll in een buis van 50 ml om 20 ml 1x percoll-HBSS te maken en houd op ijs of 4 °C.
    LET OP: 1x Percoll-HBSS kan minstens 6 maanden bij 4 °C worden bewaard.
  5. Giet in een steriele weefselkweekkap 30 ml wasmedium (bijv. Hepatocyte Wash Medium) in een schone petrischaal en bewaar op ijs.
  6. Dompel de pompbuis onder in het water van een waterbad van 45 °C. De resultaten zijn het meest betrouwbaar als de kamertemperatuur 25 °C is.
  7. Bereid 2 ml 1x anesthetica door 225 μL Ketamine HCL, 93,75 μL Xylazine en 1681 μL 1x PBS te mengen.
  8. Verdoven één muis met behulp van een goedgekeurde methode. Hier werd de muis intraperitoneaal geïnjecteerd met 150 μL 1x anesthetica. Voer de tests uit voor verlies van reflexen zoals reactie op teen knijpen om volledige anesthesie te garanderen.
  9. Bevestig de muis op zijn rug op het dissectiepad met vier ledematen, door vast te pinnen of waterbestendige tape of andere methoden te gebruiken die zijn goedgekeurd door de Animal Care and Use Committee (of equivalenten) van de instelling.
  10. Bereid gesteriliseerde tang en schaar voor op dissectie. Om mogelijke besmetting te voorkomen, voert u alle stappen uit in een steriele kap.

2. Werkwijze:

  1. Gebruik een peristaltische pomp en begin opgewarmd ddH2O te pompen met een snelheid van 4 ml / min gedurende 5 minuten. Verander de pompbuis van water in een opgewarmd perfusiemedium.
  2. Desinfecteer de buik van de verdoofde muis met 70% EtOH en knip open met een schaar om de lever, poortader en inferieure vena cava (IVC) bloot te leggen.
  3. Stop de peristaltische pomp. Plaats een katheter van 24 G (bijv. gesloten IV-katheter, 24 G, 0,75 INCH) in IVC. Begin met pompen en snijd de poortader open.
  4. Blijf pompen totdat de uitgespoelde vloeistof helder is (ongeveer 3-5 min). Druk elke minuut op de poortader om vloeistof elke hoek van de lever te laten bereiken. Pas op dat u geen luchtbellen in het IVC laat komen.
    OPMERKING: Deze stap is om zoveel mogelijk bloed uit de lever te spoelen.
  5. Verander de pompbuis van het perfusiemedium naar het collagenase-dispase medium. Blijf pompen totdat alle 25 ml van het collagenase-dispase medium is uitgeput tijdens het uitvoeren van stap 2.6.
  6. Druk elke minuut op de poortader om vloeistof elke hoek van de lever te laten bereiken.
    OPMERKING: In dit stadium is het volledige bloedverlies fataal voor de muis. De dood van de muis kan worden bevestigd door een gebrek aan hartslag na het experiment. Gooi het karkas weg volgens het facilitaire beleid.
  7. Isoleer de hele lever zonder galblaas tot het wasmedium van 30 ml in de petrischaal op ijs.
  8. Scheur het in stukken met een tang om primaire hepatocyten in oplossing vrij te geven. Deze stap zou het wasmedium veranderen in een troebele oplossing vol vrijgegeven primaire hepatocyten en kleine leverstukjes.
  9. Filtreer de troebele oplossing in stap 2.8 door een celzeef van 70 μm in de 20 ml 1x Percoll-HBSS in een buis van 50 ml op ijs. Meng door de buis 20 keer om te keren.
  10. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
  11. In de weefselkweekkap, zuig het supernatant op. Was de pellet met koud 30 ml wasmedium.
  12. Centrifugeer bij 50 x g gedurende 5 min bij 4 °C.
  13. Verwijder het supernatant en resuspend de pellet in 25 ml van het kweekmedium (of geschikte andere volumes) in de weefselkweekkap.
  14. Tel het celnummer en plaats de cellen op gewenste kweekplaten volgens het experimentele ontwerp.
    OPMERKING: Primaire hepatocyten die goed geïsoleerd zijn van één 8 weken oude muis zijn meestal voldoende om te worden verguld op vier 6-well platen of vier 12-well platen.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om de efficiëntie te testen, werd het huidige primaire hepatocytenisolatieprotocol uitgevoerd op 8 weken oude vrouwelijke C57BL / 6-muizen. De hechting en zuiverheid van geïsoleerde primaire hepatocyten werden getest. Primaire hepatocytenisolatie wordt gebruikt voor een breed scala aan experimenten op leverfysiologie, zoals levergeneesmiddeleffecten en glucosemetabolisme, farmaceutische biomarkeractiviteit2, insulinegevoeligheid en glucoseproductie. Daarom werden de activiteiten van de primaire he...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Er zijn verschillende primaire hepatocytenisolatieprotocollen ontwikkeld. Ze zijn ook geoptimaliseerd en aangepast op basis van verschillende behoeften (tabel 1). Isolatieprotocollen bestaan over het algemeen uit twee delen: perfusie (inclusief enzymvertering) en zuivering.

De perfusie kan worden uitgevoerd met de gehele lever in vivo 2,20,21,22,23 of met ontlede leverkwabben

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (Grant 5R01HD095512-02 aan S.W.).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1x PBSGibco10010023
10x HBSSGibco14065-056
12-well PlateFALCON353043Coating niet vereist
6-well PlateFALCON353046Coating niet vereist
anti-AKTCell Signaling2920S
Antibiotic Antimycotic Solution (100x), StabilizedSigma-AldrichA5955
anti-FOXO1Cell Signaling97635S
anti-GAPDHCell Signaling2118S
anti-p-AKT (S473)Cell Signaling9271L
anti-PEPCKSanta CruzSC-166778
anti-p-FOXO1 (S256)Cell Signaling84192S
Cell Strainer, 70 µmCELLTREAT229483
Closed IV Catheter, 24 Gauge 0.75 INBecton Dickinson383511
DMEM, no glucose, no glutamine, no phenol redThermoFisher ScientificA1443001
EnzyChrom Glucose Assay KitBioAssay SystemsEBGL-100
Fetal Bovine Serum (FBS)HycloneSH30071.03
ForskolinMilliporeSigmaF3917-10MG
GlucagonSigma-AldrichG2044
Goat Anti-mouse IgG Secondary AntibodyLI-COR926-68070
Goat Anti-rabbit IgG Secondary AntibodyLI-COR926-32211
GraphPad Prism 8GraphPad SoftwareNA
Hepatocyte Wash MediumGibco17704-024
IBMXCell Signaling13630S
InsulinLillyNDC 0002-8215-01
Ketamine HCL (100 mg/mL)Hospira IncNDC 0409-2051-05
L-GlutamineGibco25030081
Liver Digest MediumGibco17703-034Alikoteer in weefselkweekkap tot 25 mL elk in 50 mL buis, en bewaar in -20 °C vriezer
Liver Perfusion MediumGibco17701-038
Pen StrepGibco15140122
PercollGE Healthcare17-0891-01
Peristaltic PumpGilsonMinipuls 2In staat om te pompen op 4 mL/min
Petri DishFisherbrand08-757-12
Refrigerated CentrifugeSorvallLegend RTIn staat om 50 mL buis te centrifugeren bij 4 °C
Sodium L-LactateSigma-AldrichL7022
Sodium PyruvateGibco11360070
Syringe Filter, PVDF 0.45 µm 30mm diameterCELLTREAT229745
Syringe, 0.5 mLBecton Dickinson329461
Syringe, 60 mLBecton Dickinson309653
Trypan Blue Solution, 0.4%Gibco15250061
Tube, 15 mLCorning430052
Tube, 50 mLCorning430290
Water Bath TankCorningCLS6783Of een waterbadtank die in staat is om op te warmen tot 45 °C
William’s E Medium (GlutaMAX Supplement)Gibco32551020
Xylozine (100 mg/mL)Vetone Anased LANDC13985-704-10

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Han, H. S., Kang, G., Kim, J. S., Choi, B. H., Koo, S. H. Regulation of glucose metabolism from a liver-centric perspective. Experimental and Molecular Medicine. 48, 218(2016).
  2. Severgnini, M., et al. A rapid two-step method for isolation of functional primary mouse hepatocytes: cell characterization and asialoglycoprotein receptor based assay development. Cytotechnology. 64 (2), 187-195 (2012).
  3. Guidotti, J. E., et al. Liver cell polyploidization: a pivotal role for binuclear hepatocytes. Journal of Biological Chemistry. 278 (21), 19095-19101 (2003).
  4. Morales-Navarrete, H., et al. A versatile pipeline for the multi-scale digital reconstruction and quantitative analysis of 3D tissue architecture. Elife. 4, 11214(2015).
  5. Bruening, J., et al. Hepatitis C virus enters liver cells using the CD81 receptor complex proteins calpain-5 and CBLB. PLoS Pathogens. 14 (7), 1007111(2018).
  6. Silvie, O., et al. Hepatocyte CD81 is required for Plasmodium falciparum and Plasmodium yoelii sporozoite infectivity. Nature Medicine. 9 (1), 93-96 (2003).
  7. Crispe, I. N. Hepatocytes as immunological agents. Journal of Immunology. 196 (1), 17-21 (2016).
  8. Liu, N. C., et al. Loss of TR4 orphan nuclear receptor reduces phosphoenolpyruvate carboxykinase-mediated gluconeogenesis. Diabetes. 56 (12), 2901-2909 (2007).
  9. Wang, Z., et al. Gonadotrope androgen receptor mediates pituitary responsiveness to hormones and androgen-induced subfertility. JCI Insight. 5 (17), 127817(2019).
  10. Santos, S. D., et al. CSF transthyretin neuroprotection in a mouse model of brain ischemia. Journal of Neurochemistry. 115 (6), 1434-1444 (2010).
  11. Pinhu, L., et al. Overexpression of Fas and FasL is associated with infectious complications and severity of experimental severe acute pancreatitis by promoting apoptosis of lymphocytes. Inflammation. 37 (4), 1202-1212 (2014).
  12. Mi, Y., Lin, A., Fiete, D., Steirer, L., Baenziger, J. U. Modulation of mannose and asialoglycoprotein receptor expression determines glycoprotein hormone half-life at critical points in the reproductive cycle. Journal of Biological Chemistry. 289 (17), 12157-12167 (2014).
  13. Tanowitz, M., et al. Asialoglycoprotein receptor 1 mediates productive uptake of N-acetylgalactosamine-conjugated and unconjugated phosphorothioate antisense oligonucleotides into liver hepatocytes. Nucleic Acids Research. 45 (21), 12388-12400 (2017).
  14. Manczak, M., et al. Neutralization of granulocyte macrophage colony-stimulating factor decreases amyloid beta 1-42 and suppresses microglial activity in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease. Human Molecular Genetics. 18 (20), 3876-3893 (2009).
  15. Zhang, Y., et al. JAK1-dependent transphosphorylation of JAK2 limits the antifibrotic effects of selective JAK2 inhibitors on long-term treatment. Annals of the Rheumatic Diseases. 76 (8), 1467-1475 (2017).
  16. Shih, S. C., et al. Molecular profiling of angiogenesis markers. American Journal of Pathology. 161 (1), 35-41 (2002).
  17. Liu, G., et al. miR-147, a microRNA that is induced upon Toll-like receptor stimulation, regulates murine macrophage inflammatory responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (37), 15819-15824 (2009).
  18. Ding, Q., et al. Mice expressing minimally humanized CD81 and occludin genes support Hepatitis C virus uptake in vivo. Journal of Virology. 91 (4), 01799(2017).
  19. Renshaw, M., et al. Cutting edge: impaired Toll-like receptor expression and function in aging. Journal of Immunology. 169 (9), 4697-4701 (2002).
  20. Li, W. C., Ralphs, K. L., Tosh, D. Isolation and culture of adult mouse hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 633, 185-196 (2010).
  21. Salem, E. S. B., et al. Isolation of primary mouse hepatocytes for nascent protein synthesis analysis by non-radioactive l-azidohomoalanine labeling method. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (140), e58323(2018).
  22. Cabral, F., et al. Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993(2018).
  23. Korelova, K., Jirouskova, M., Sarnova, L., Gregor, M. Isolation and 3D collagen sandwich culture of primary mouse hepatocytes to study the role of cytoskeleton in bile canalicular formation in vitro. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60507(2019).
  24. Goncalves, L. A., Vigario, A. M., Penha-Goncalves, C. Improved isolation of murine hepatocytes for in vitro malaria liver stage studies. Malar Journal. 6, 169(2007).
  25. Yin, Z., Ellis, E. C., Nowak, G. Isolation of mouse hepatocytes for transplantation: a comparison between antegrade and retrograde liver perfusion. Cell Transplant. 16 (8), 859-865 (2007).
  26. Hepatocyte media, Thermofisher. , Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/Hepatocyte_Media_UG.pdf (2021).
  27. Sia, D., Villanueva, A., Friedman, S. L., Llovet, J. M. Liver cancer cell of origin, molecular class, and effects on patient prognosis. Gastroenterology. 152 (4), 745-761 (2017).
  28. Freitas-Lopes, M. A., Mafra, K., David, B. A., Carvalho-Gontijo, R., Menezes, G. B. Differential location and distribution of hepatic immune cells. Cells. 6 (4), 48(2017).
  29. Schachtrup, C., Le Moan, N., Passino, M. A., Akassoglou, K. Hepatic stellate cells and astrocytes: Stars of scar formation and tissue repair. Cell Cycle. 10 (11), 1764-1771 (2011).
  30. Geerts, A. History, heterogeneity, developmental biology, and functions of quiescent hepatic stellate cells. Seminars in Liver Disease. 21 (3), 311-335 (2001).
  31. Poisson, J., et al. Liver sinusoidal endothelial cells: Physiology and role in liver diseases. Journal of Hepatology. 66 (1), 212-227 (2017).
  32. Peter, M. E., et al. The CD95 receptor: apoptosis revisited. Cell. 129 (3), 447-450 (2007).
  33. Peters, D. T., et al. Asialoglycoprotein receptor 1 is a specific cell-surface marker for isolating hepatocytes derived from human pluripotent stem cells. Development. 143 (9), 1475-1481 (2016).
  34. Willoughby, J. L. S., et al. Evaluation of GalNAc-siRNA conjugate activity in pre-clinical animal models with reduced asialoglycoprotein receptor expression. Molecular Therapy. 26 (1), 105-114 (2018).
  35. Hutchins, N. A., Chung, C. S., Borgerding, J. N., Ayala, C. A., Ayala, A. Kupffer cells protect liver sinusoidal endothelial cells from Fas-dependent apoptosis in sepsis by down-regulating gp130. American Journal of Pathology. 182 (3), 742-754 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mouse Primary Hepatocyte IsolationPeristaltic Pump PerfusionCollagenase Dispase DigestionCell Strainer FiltrationCentrifugation WashingHepatocyte Marker AnalysisGlucose Metabolism AssaysInsulin Sensitivity TestingTime Efficient ProtocolLabor Friendly Method

Related Articles