Methodenartikel

Heterologe expressie en functionele analyse van Aedes aegypti-geurreceptoren voor menselijke geuren in xenopus-eicellen

DOI:

10.3791/61813

⸱

8 juni 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Entomology and Plant Pathology, Auburn University, 2Departments of Biochemistry & Biophysics, and Cellular & Molecular Pharmacology, University of California, San Francisco, 3Department of Biological Sciences, Vanderbilt University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Er wordt een protocol gepresenteerd dat OK's van muggen functioneel karakteriseert als reactie op menselijke geuren met behulp van een Xenopus-eicelexpressiesysteem in combinatie met een spanningsklem met twee elektroden, wat een krachtige nieuwe techniek biedt voor het onderzoeken van de reacties van muggen OK's op blootstelling aan menselijke geuren.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De mug Aedes aegypti (Linnaeus), een vector van vele belangrijke menselijke ziekten, waaronder gele koorts, knokkelkoorts en zikakoorts, vertoont een sterke voorkeur voor menselijke gastheren boven andere warmbloedige dieren voor bloedmaaltijden. Olfactorische signalen spelen een cruciale rol voor muggen wanneer ze hun omgeving verkennen en een menselijke gastheer zoeken om bloedmaaltijden te verkrijgen, waardoor menselijke ziekten worden overgedragen. Van geurreceptoren (OR's) die tot expressie komen in de olfactorische sensorische neuronen is bekend dat ze verantwoordelijk zijn voor de interactie van muggenvectoren met menselijke geuren. Om een dieper inzicht te krijgen in de olfactorische fysiologie van Ae. aegypti en hun interacties met mensen op moleculair niveau te onderzoeken, gebruikten we een geoptimaliseerd protocol van heterologe expressie van Xenopus Oocytes om Ae. aegypti geurreceptoren functioneel te analyseren als reactie op menselijke geuren. Er worden drie voorbeeldexperimenten gepresenteerd: 1) Klonen en synthetiseren van cRNA's van OR's en co-receptor van geurreceptoren (Orco) van vier tot zes dagen oude Ae. aegypti-antennes ; 2) Micro-injectie en expressie van OR's en Orco in Xenopus-eicellen ; en 3) Registratie van de stroom van de hele cel van Xenopus-eicellen die muggen OR's/Orco tot expressie brengen met een spanningsklem met twee elektroden. Deze geoptimaliseerde procedures bieden onderzoekers een nieuwe manier om de ontvangst van menselijke geur bij Aedes-muggen te onderzoeken en de onderliggende mechanismen te onthullen die hun gastheerzoekende activiteit op moleculair niveau regelen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De gelekoortsmug Ae. aegypti kan vele dodelijke ziekten overbrengen, waaronder gele koorts, knokkelkoorts en zikakoorts, en veroorzaakt enorm veel leed en verlies van mensenlevens. Muggen maken gebruik van meerdere signalen zoals CO2, huidgeur en lichaamswarmte om hun gastheren te lokaliseren1. Gezien het feit dat zowel mensen als andere warmbloedige dieren CO2 produceren en een vergelijkbare lichaamstemperatuur hebben, lijkt het waarschijnlijk dat vrouwelijke Ae. aegypti voornamelijk afhankelijk is van huidgeur voor gastheerdiscriminatie2. Dit creëert echter een complex beeld, met een vroege studie die meer dan 300 verbindingen isoleert uit emanaties van de menselijke huid3. Verdere gedragstesten hebben aangetoond dat een aantal van deze verbindingen gedragsreacties oproepen in Ae. aegypti 4,5,6,7, maar precies hoe deze verbindingen door de mug worden gedetecteerd, blijft grotendeels onbekend. Recent onderzoek door onze groep heeft verschillende menselijke geurstoffen geïdentificeerd die mogelijk betrokken zijn bij Ae. aegypti gastheerzoekende activiteit, hoewel hun rol nog moet worden bevestigd door verdere gedragstesten8. Hoe deze essentiële menselijke geurstoffen worden gedecodeerd in het perifere sensorische systeem van Ae. aegypti moet nog worden vastgesteld.

Insecten detecteren geurstoffen via de chemosensorische sensilla op hun olfactorische aanhangsels. In elk van de sensilla worden verschillende olfactorische receptoren, waaronder geurreceptoren (OR's), ionotrope receptoren (IR's) en smaakreceptoren (GR's), tot expressie gebracht op het membraan van olfactorische sensorische neuronen9. Deze OK's zijn verantwoordelijk voor het waarnemen van veel geurstoffen die insecten tegenkomen, vooral de geuren die verband houden met voedsel, gastheren en paringspartners 10,11,12,13. Een eerdere studie gericht op het deorfaniseren van de functie van OR's in Anopheles gambiae met behulp van het Xenopus-expressiesysteem in combinatie met een spanningsklem met twee elektroden heeft aangetoond dat Anopheles OR's specifiek zijn afgestemd op de aromaten die de belangrijkste componenten zijn in menselijke emanaties14. Een recente genoomstudie identificeerde tot 117 OR-genen in Ae. aegypti15. Bijgevolg zou een manier om de functies van deze Aedes OK's systematisch aan te pakken als reactie op biologisch of ecologisch belangrijke geurstoffen zoals menselijke geuren of ovipositiestimuli nuttige informatie opleveren voor diegenen die de chemische ecologie of neuro-ethologie van Ae. aegypti verder willen begrijpen.

De techniek van de twee-elektrode spanningsklem (TEVC) werd oorspronkelijk ontwikkeld om de functie van membraanionkanalen te onderzoeken in het midden van de jaren1990 16,17. Sindsdien is TEVC gebruikt om OR's van een aantal verschillende insectensoorten te onderzoeken 14,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34. Dit functionele onderzoek van OR's heeft substantieel bijgedragen aan het beantwoorden van belangrijke ecologische vragen bij insecten, waaronder: 1) Hoe lokaliseren insecten voedselbronnen? 2) Hoe worden ze aangetrokken door de vluchtige seksferomonen die door hun paringspartners worden afgegeven? 3) Hoe vinden ze een perfecte ovipositieplaats voor hun nakomelingen? en 4) Zijn er verbindingen, plantaardig of synthetisch, die mensen efficiënt kunnen beschermen tegen bijtende insecten? Antwoorden op deze vragen zijn cruciaal voor het beheersen van belangrijke ziektevectoren zoals muggen.

Een aantal andere benaderingen, waaronder die gebaseerd op de menselijke embryonale niercellijn 293 (HEK293), het lege neuronsysteem van Drosophila, zinkvingernuclease, transcriptieactivator-achtige effectornuclease en het CRISPR/Cas9-genbewerkingssysteem, zijn ook gebruikt in OK-functionele studies 12,20,35,36,37. Deze technieken vereisen echter allemaal de vaardigheden van een ervaren moleculair bioloog en omvatten meerdere potentieel verstorende factoren. TEVC/eicelexpressie is in staat om door geur opgewekte receptorstromen en ionengeleiding direct te meten en heeft als bijkomend voordeel de snelle insteltijd die nodig is om receptoren uit cRNA tot expressie te brengen. In deze studie hebben we daarom TEVC gebruikt om de reacties van één Ae. aegypti OR55 (AaegOR55) tegen verschillende geurstoffen met potentiële biologische relevantie te onderzoeken, waaruit blijkt dat eicellen die tot expressie worden gebracht met AaegOR55•AaegOrco een dosisafhankelijke respons vertoonden op de menselijke geurstof benzaldehyde.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het protocol voor deze procedure, de verzorging en het gebruik van proefdieren, is goedgekeurd en gecontroleerd (Auburn University's Institutional Animal Care and Use Committee: goedgekeurd protocol # 2016-2987).

OPMERKING: Aangepaste gensynthese is een levensvatbaar alternatief voor klonen voor muggen OF-genen.

1. Verzameling muggen- en olfactorische aanhangsels (antennes)

  1. Houd Ae. aegypti-muggen (verkregen van Dr. James Becnel, USDA, ARS, Mosquito and Fly Research Unit) bij 25 ± 2°C en een fotoperiode van 12: 12 (L:D) uur (lichten aan 8 uur).
  2. Verdoof ~800 vrouwelijke muggen van 4-6 dagen oud zonder bloedvoeding met behulp van CO2. Knip de muggenantennes (reukweefsels) onder een microscoop (40x) met een schaar en verzamel ze in een centrifugebuis van 1,5 ml die op droogijs wordt bewaard.
    OPMERKING: De verzamelde antennes kunnen in een vriezer bij -80 °C worden bewaard of direct worden gebruikt.

2. OF Klonen van antennes van Ae. aegypti

  1. Extraheer het totale RNA uit de antennes met behulp van een in de handel verkrijgbare totale RNA-kit volgens het protocol van de fabrikant.
  2. Verwerk het totale RNA met behulp van de in de handel verkrijgbare DNA-vrije kit om DNase en andere ionen te verwijderen volgens het protocol van de fabrikant.
  3. Synthese cDNA uit 1,5 μg DNA-vrij RNA met behulp van het Oligo d(T)20-geprimed SuperScript IV First-Strand Synthesis System13,30.
  4. Ontwerp PCR-primers voor de OK-genen volgens de sequenties die beschikbaar zijn op VectorBase (https://www.vectorbase.org/) en de speciale vereisten van de enzymkniplocatie. Voeg een Kozak-sequentie (GCCACC) toe, die de translatie in de meeste eukaryote organismen initieert, tussen de snijplaats en het startcodon in elke voorwaartse primer30.
  5. Kloon de coderende sequenties van de OR-genen door middel van PCR met behulp van genspecifieke primers die restrictie-endonucleaseplaatsen bevatten en de Kozak-sequentie volgens het protocol van de fabrikant.
  6. Detecteer PCR-producten door middel van een 1% agarosegel en zuiver met behulp van een in de handel verkrijgbare gelextractiekit volgens het protocol van de fabrikant.
  7. Voer recombinante plasmideconstructie uit door PCR-producten te klonen tot een pT7Ts-vector na vertering door restrictie-enzymen volgens het protocol van de fabrikant.
  8. Controleer de recombinante plasmiden door middel van Sanger-sequencing en bevestig met behulp van de VectorBase-database.

3. cRNA-synthese

  1. Lineariseer de geconstrueerde plasmiden met specifieke restrictie-enzymen.
    OPMERKING: Plasmide-DNA moet worden gelineariseerd met een restrictie-enzym stroomafwaarts van het gen dat moet worden getranscribeerd.
  2. Gebruik de gelineariseerde plasmiden om cRNA's te synthetiseren met een commerciële T7-kit volgens een eerdere beschrijving13,30.
  3. Meng cRNA van OR en Orco (1:1) in een centrifugebuis en verdeel het gemengde cRNA in een volume van 2 μL (250 ng/μL/elk) voor elke PCR-buis. Bewaar het gealiteerde cRNA voor gebruik bij -80 °C.

4. Xenopus eicel collectie

OPMERKING: De procedure volgt de instructies van Schneider et al.38.

  1. Verdoof Xenopus laevis gedurende 20-30 minuten in 1 l ultragezuiverd water met 1 g ethyl-m-aminobenzoaat methaansulfonaatzout (Figuur 1A). Knijp met de vingers in een van de tenen van de kikker; Als er geen reactie is, is de kikker voldoende verdoofd en klaar voor een operatie. Breng de verdoofde kikker over op het ijsbed.
  2. De operatie
    1. Wrijf het ventrale gebied van de kikker in met 10% povidon-jodiumoplossing en veeg de oplossing af met schone wattenbolletjes. Herhaal deze stap 2 keer.
    2. Maak een kleine incisie in de buik (10-15 mm, figuur 1B) met een wegwerpscalpel. Penetreer de huid, fascia-spierlaag afzonderlijk. De incisie bevindt zich in het onderste deel van de buik, lateraal van de middellijn.
      OPMERKING: Verwond de inwendige organen niet.
    3. Pak delen van de eierstokkwabben vast met een tang en trek ze voorzichtig naar buiten. Til de eierstok op en knip deze ter hoogte van de lichaamswand af met een schaar. Herhaal dit meerdere keren totdat je voldoende eierstokmateriaal hebt (~200 eieren, Figuur 1C). Breng de eierstokmaterialen over in de wasbuffer (96 mM NaCl, 2 mM KCl, 5 mM MgCl2•6H2O, 5 mM HEPES natriumzout, 10 μg/ml gentamycine, pH 7,6).
    4. Sluit de operatiewonden (zowel spieren als huid) met resorbeerbare hechtingen die doorgaans binnen 10-14 dagen op natuurlijke wijze worden afgebroken en uitvallen.
    5. Plaats de kikker na elke operatie in 1 liter hersteloplossing (met 3,4 g conserven- en beitszout en 2 g instant oceaanzeezout) totdat hij wakker wordt en breng hem dan terug naar de kikkerfaciliteit.
      OPMERKING: Er kunnen maximaal 4 operaties worden uitgevoerd op elke kikker. Het operatie-interval van elke kikker moet meer dan 2 maanden zijn.
  3. Enzymatische gedefolliculeerde spijsvertering en eicelteelt
    1. Scheid de eicellen (~200 eieren, Figuur 1C) in kleine stukjes.
    2. Breng alle eicellen over in een digestieoplossing, inclusief 10 ml wasbuffer (punt 4.2.3) en 2 mg/ml collagenase B gedurende 40-60 minuten bij kamertemperatuur om folliculaire cellagen te verwijderen. Onderzoek de monsters onder een microscoop om te bepalen of 80% van de eicellen volledig zijn gedefolliculeerd; Zo niet, controleer dan elke 10 minuten totdat de meeste eicellen klaar zijn.
    3. Spoel de eicellen af met 1x Ringer-oplossing (96 mM NaCl, 2 mM KCl, 5 mM MgCl2·6H2 O, 5 mM HEPES natriumzout, pH 7,6), wasbuffer (paragraaf 4.2.3), gemodificeerde Barth's zoutoplossing (78 mM NaCl, 1 mM KCl, 0,33 mM Ca(NO3)2·4H2O, 0,41 mM CaCl2·2H2O, 0,82 mM MgSO4,7 uur2O, 2,4 mM NaHCO3, 10 mM HEPES natriumzout, 1,8 mM natriumpyruvaat, 10 μg/ml gentamycine, 10 μg/ml streptomycine, pH 7,6) in volgorde (5 keer voor elke buffer, waarbij elke keer 10 ml wordt gebruikt). De eicellen uitgebreid spoelen met buffers om onrijpe eicellen en eicellen van slechte kwaliteit te verwijderen.
    4. Oogst eicellen in stadium V-VI volgens de classificatie van Dumont. Breng de gezondheid/goede kwaliteit van de eicellen in stadium V-VI met een duidelijke wit/donkere verdeling en zonder visueel zichtbare schade (figuur 1D) over in een petrischaaltje van 100 mm x 15 mm met gemodificeerde barth-zoutoplossing (punt 4.3.3). Gooi de eicellen van slechte kwaliteit weg (Figuur 1E). Bewaar de geverteerde eicellen in groeikamers van insecten ongeveer 24 uur bij 18 °C voordat u ze micro-injectiet.

5. cRNA-micro-injectie en expressie van geurreceptoren (OR's) en OR-co-receptoren (Orco) in xenopus-eicellen

  1. Plaats een metalen matrix in de petrischaal van 100 mm x 15 mm en voeg gemodificeerde Barth-zoutoplossing toe (paragraaf 4.3.3) totdat de matrix is ondergedompeld. Breng eicellen over op de matrix en gooi de eicellen weg die niet aan de grootte voldoen. Schik de eicellen met de plantaardige polen aan de bovenzijde (Figuur 1F).
  2. Trek aan een vers glazen capillair (1,0 mm OD x 0,5 mm ID, lengte = 100 mm) voor elk monster met behulp van een micropipe-trekker (Heat = 525, Pull = 50, Velocity = 50, Time = 250) en slijp met een micropipet-afschuiner in een hoek van 25°. Monteer de capillaire buis op de nanoliter injector.
  3. Verwijder vóór de injectie een buisje met voorgemengde cRNA's van OR en Orco (rubriek 3.3) uit de vriezer en plaats deze op ijs totdat deze volledig is opgelost. Vul de capillaire buis met het OR/Orco mengsel door op de vulknop van de nanoliter injector te drukken.
  4. Injecteer 10 ng (5ng OR + 5ng Orco; ~20 nL) van het voorgemengde cRNA voor elke eicel met een nanoliter-injector op een RNA-vrij station. (Figuur 1F).
    OPMERKING: Voor de injectie drukken we op de EMPTY-knop om een klein beetje mengsel af te voeren om ervoor te zorgen dat de capillaire buis niet verstopt raakt. Wacht ongeveer 5 seconden om de cRNA's volledig de eicel binnen te laten gaan.
  5. Bewaar de eicellen na injectie op een steriele celkweekplaat met 24 putjes en gemodificeerde Barth-zoutoplossing bij 18-7 dagen voordat u de hele cel opneemt.

6. Stroomregistratie van de hele cel met behulp van een spanningsklemsysteem met twee elektroden (Afbeelding 2)

  1. Los vóór de opname van de spanningsklem met twee elektroden de afzonderlijke geurstoffen op in dimethylsulfoxide (DMSO) om een reeks voorraadoplossingen (100 μg/μl) te verkrijgen. Verdun deze voorraadoplossingen met 1x ND96-buffer (91 mM NaCl, 2 mM KCl, 1,8 mM CaCl2·2H2 O, 2 mM MgCl2·6H2O, 5 mM HEPES natriumzout, pH 7,6) 1000-voudig om een set werkoplossingen te verkrijgen (0,1 μg/μL).
  2. Zorg ervoor dat alles op de TMC-trillingsisolatietafel, inclusief het metalen schild, de microscoop, de lichtbron en de afvalpomp, zorgvuldig is geaard om het effect van externe elektrische ruis op de opname van het signaal van de hele cel te verminderen.
  3. Bereid micro-elektroden voor door aan een glazen capillair te trekken (1.20 mm OD x 0.94 mm ID, lengte = 750 mm) met behulp van een micropipe-trekker (Heat = 525, Pull = 50, Velocity = 50, Time = 250). Vul de haarvaten met 3 M KCl. Chloridiseer de Ag/AgCl-draden gedurende 2-5 minuten in 10% chloorbleekmiddel tot ze een donkergrijze kleur krijgen (lichtgrijze Ag/AgCl-draden moeten worden gechloridiseerd).
  4. Zet de machine aan door de eicelklem en Digidata Digitizer in te schakelen (Figuur 3A). Open de software (bijv. Clampex 10.3) en klik op de knop Opnemen . Zet de schakelaar voor de 1x ND96 buffer (Paragraaf 6.1) en de pomp voor de afvalbuffer aan.
  5. Voer een pre-test uit door micro-elektroden in de stromende buffer te plaatsen en vervolgens op de Vm Elektrodetestknop en de Ve Elektrodetestknop te drukken om de weerstand van de micro-elektroden te controleren. Vm moet < 40 mV zijn en Ve moet < 40 μA zijn. Schakel na de pretest de 1x ND96 buffer (paragraaf 6.1) stroom en de afvalpomp uit.
  6. Plaats elke eicel in de perfusiekamer (Figuur 2) gevuld met 1x ND96-buffer (Sectie 6.1) en plaats de eicellen voorzichtig met de plantaardige polen naar boven gericht door de glazen rups. Breng de elektroden langzaam in de eicel (Figuur 3B). Stel de parameter Vm in op 0 en vervolgens de parameter Ve op 0. Verander de Clamp-knop van UIT naar SNEL. Stel de versterkingsknop in op ~ -80 mV.
  7. Controleer de waarde van Ve, die constant moet zijn. Zo niet, dan is er een lek in ten minste één van de twee micro-elektroden. Als dit gebeurt, vervang dan eventuele defecte onderdelen door nieuwe haarvaten.
  8. Registreer de hele celstromen van de geïnjecteerde eicellen met een eicelklem bij een houdpotentiaal van ~−80 mV (Figuur 2).
  9. Gegevensverzameling en -analyse uitvoeren.
    1. Hervat de stroom van de 1x ND96-buffer (paragraaf 6.1) en zet de afvalpomp aan.
    2. Aanbrengen van geurvloeistof via het perfusiesysteem: schakel de 1x ND96-buffer uit (paragraaf 6.1) en laat de geuroplossing gedurende 10 seconden stromen. Noteer vervolgens de piekwaarde. Om de respons van de OK op de testgeur te verkrijgen, trekt u de basislijnwaarde af van de piekwaarde.
    3. Stop de stroom van geuroplossing en schakel over op de 1x ND96-buffer (paragraaf 6.1). Was de eicel met behulp van de buffer totdat het huidige spoor zich herstelt van de vorige geurstimulatie. De eicel is dan klaar voor stimulatie door een andere geuroplossing. Over het algemeen kan één eicel worden gebruikt om 20-30 chemische stimulaties te detecteren.
      OPMERKING: Bij het testen van de concentratieafhankelijke respons moet altijd eerst de laagste concentratie worden toegepast voordat wordt overgegaan op de hogere concentraties.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Met behulp van de single sensillum recording (SSR) techniek hebben we onlangs menselijke geurstoffen geïdentificeerd waarvan wordt aangenomen dat ze belangrijk zijn voor Ae. aegypti gastheer-zoekend gedrag8. Het moleculaire mechanisme dat het proces van het waarnemen van menselijke geurstoffen in het perifere sensorische systeem van Ae. aegypti aanstuurt, blijft echter onbekend. OR's spelen een belangrijke rol bij de detectie van geurligand bij d...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TEVC is een klassieke techniek die veel wordt gebruikt om de functie van membraanreceptoren te onderzoeken. Hoewel er al een gedetailleerd protocol is gepubliceerd43 dat aanzienlijke gelijkenis vertoont met de hier gepresenteerde procedure, brengt de hier voorgestelde methode enkele belangrijke wijzigingen met zich mee. Hier bijvoorbeeld wordt het cRNA van zowel OR als Orco direct na synthese voorgemengd en verdeeld in monsters met een klein volume en bewaard bij ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit project werd ondersteund door een prijs van het Alabama Agricultural Experiment Station (AAES) Multistate/Hatch Grants ALA08-045, ALA015-1-10026 en ALA015-1-16009 aan N.L.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
24-well cell culture plateCytoOneCC7682-7524Gebruikt voor oöcytencultuur
Afrikaanse klauwkikkerNascoLM00535Gebruikt voor het verzamelen van Xenopus-oöcyten
Ag/AgCl draadelektrodeWarner Instruments64-1282Gebruikt voor micro-elektroden
Clampex 10.3AxonN.V.Gebruikt voor signaalregistratie
Clampfit 10.3Axon Instruments Inc.N.V.Gebruikt voor data-analyse
Collageenase BSigma11088815001Gebruikt voor oöcyt-vertering
Digidata DigitizerAxon CNSDigidata 1440AGebruikt voor data-acquisitie
E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini kitOmegaD6942-01Gebruikt voor plasmide-voorbereiding
Ethyl-M-aminobenzoaat methaansulfonaat zoutSigma886-86-2Gebruikt voor het verdoven van kikkers
Glas capillairFHC30-30-1Gebruikt voor micro-injectie
Glas capillairWarner Instruments64-0801Gebruikt voor het bereiden van micro-elektroden
GyroMini Nutating MixerLabnetS0500Gebruikt voor oöcyt-vertering
Insect Growth ChambersCaron Productsmodel 6025Gebruikt voor oöcyten-incubatie
Leica MicroscoopLeicaS6 DGebruikt voor het snijden van muggenantennes
LichtbronSchottA20500Biedt lichtbronnen voor observatie
Magnetische standaardNarishigeGJ-1Gebruikt om de referentie-elektrode vast te houden
MicromanipulatorLeica115378Gebruikt voor kleine bewegingen van de elektrode
Micropipe trekkerSuttermodel P-97Gebruikt om capillairen te trekken
Micropipet bevelerSuttermodel BV-10Gebruikt om capillairen te slijpen
mMESSAGE mMACHINE T7 kitInvitrogenAM1344Gebruikt voor het synthetiseren van cRNA
Nanoject II Auto-Nanoliter InjectorDrummond3-000-204Gebruikt voor micro-injectie
Oligo d(T)20-geprimed SuperScript IV First-Strand Synthesis SystemInvitrogen18091050Gebruikt voor het synthetiseren van cDNA
Olympus MicroscoopOlympusSZ61Gebruikt voor micro-injectie
One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli cellenInvitrogenC404003Gebruikt voor transformatie
Oöcytenklemmen versterkerWarner Instrumentsmodel OC-725CGebruikt voor TEVC-opname
QIAquick gel extractie kitQiagen28704Gebruikt voor gel-zuivering
TMC Vibration Isolation TableTMC63-500Gebruikt voor het isoleren van de vibratie van de apparatuur
TURBO DNA-free kitInvitrogenAM1907Gebruikt om DNase en andere ionen in RNA te verwijderen

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cardé, R. T. Multi-cue integration: how female mosquitoes locate a human host. Current Biology. 25 (18), 793-795 (2015).
  2. McBride, C. S., et al. Evolution of mosquito preference for humans linked to an odorant receptor. Nature. 515 (7526), 222-227 (2014).
  3. Bernier, U. R., Kline, D. L., Barnard, D. R., Schreck, C. E., Yost, R. A. Analysis of human skin emanations by gas chromatography/mass spectrometry. 2. Identification of volatile compounds that are candidate attractants for the yellow fever mosquito (Aedes aegypti). Analytical Chemistry. 72 (4), 747-756 (2000).
  4. Bernier, U. R., Kline, D. L., Schreck, C. E., Yost, R. A., Barnard, D. R. Chemical analysis of human skin emanations: comparison of volatiles from humans that differ in attraction of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Journal of the American Mosquito Control Association. 18 (3), 186-195 (2002).
  5. Bernier, U. R., et al. Synergistic attraction of Aedes aegypti (L.) to binary blends of L-lactic acid and acetone, dichloromethane, or dimethyl disulfide. Journal of Medical Entomology. 40 (5), 653-656 (2003).
  6. Bernier, U. R., Kline, D. L., Allan, S. A., Barnard, D. R. Laboratory studies of Aedes aegypti attraction to ketones, sulfides, and primary chloroalkanes tested alone and in combination with L-lactic acid. Journal of the American Mosquito Control Association. 31 (1), 63-70 (2015).
  7. Okumu, F. O., et al. Development and field evaluation of a synthetic mosquito lure that is more attractive than humans. PloS one. 5 (1), 8951(2010).
  8. Chen, Z., Liu, F., Liu, N. Human odour coding in the yellow fever mosquito, Aedes aegypti. Scientific Reports. 9 (1), 1-12 (2019).
  9. Hansson, B. S., Stensmyr, M. C. Evolution of insect olfaction. Neuron. 72 (5), 698-711 (2011).
  10. Nakagawa, T., Sakurai, T., Nishioka, T., Touhara, K. Insect sex-pheromone signals mediated by specific combinations of olfactory receptors. Science. 307 (5715), 1638-1642 (2005).
  11. Hallem, E. A., Carlson, J. R. Coding of odors by a receptor repertoire. Cell. 125 (1), 143-160 (2006).
  12. Carey, A. F., Wang, G., Su, C. Y., Zwiebel, L. J., Carlson, J. R. Odorant reception in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Nature. 464 (7285), 66-71 (2010).
  13. Liu, F., Xiong, C., Liu, N. Chemoreception to aggregation pheromones in the common bed bug, Cimex lectularius. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 82, 62-73 (2017).
  14. Wang, G., Carey, A. F., Carlson, J. R., Zwiebel, L. J. Molecular basis of odor coding in the malaria vector mosquito Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (9), 4418-4423 (2010).
  15. Matthews, B. J., et al. Improved reference genome of Aedes aegypti informs arbovirus vector control. Nature. 563 (7732), 501-507 (2018).
  16. Costa, A. C., Patrick, J. W., Dani, J. A. Improved technique for studying ion channels expressed in Xenopus oocytes, including fast superfusion. Biophysical Journal. 67 (1), 395-401 (1994).
  17. Schreibmayer, W., Lester, H. A., Dascal, N. Voltage clamping of Xenopus laevis oocytes utilizing agarose-cushion electrodes. Pflügers Archiv. 426 (5), 453-458 (1994).
  18. Lu, T., et al. Odor coding in the maxillary palp of the malaria vector mosquito Anopheles gambiae. Current Biology. 17 (18), 1533-1544 (2007).
  19. Ditzen, M., Pellegrino, M., Vosshall, L. B. Insect odorant receptors are molecular targets of the insect repellent DEET. Science. 319 (5871), 1838-1842 (2008).
  20. Sato, K., et al. Insect olfactory receptors are heteromeric ligand-gated ion channels. Nature. 452 (7190), 1002-1006 (2008).
  21. Xia, Y., et al. The molecular and cellular basis of olfactory-driven behavior in Anopheles gambiae larvae. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (17), 6433-6438 (2008).
  22. Bohbot, J. D., Dickens, J. C. Characterization of an enantioselective odorant receptor in the yellow fever mosquito Aedes aegypti. PLoS One. 4 (9), 7032(2009).
  23. Bohbot, J. D., Dickens, J. C. Insect repellents: modulators of mosquito odorant receptor activity. PLoS One. 5 (8), 12138(2010).
  24. Bohbot, J. D., Dickens, J. C. Odorant receptor modulation: ternary paradigm for mode of action of insect repellents. Neuropharmacology. 62 (5-6), 2086-2095 (2012).
  25. Hughes, D. T., Pelletier, J., Luetje, C. W., Leal, W. S. Odorant receptor from the southern house mosquito narrowly tuned to the oviposition attractant skatole. Journal of Chemical Ecology. 36 (8), 797-800 (2010).
  26. Pelletier, J., Hughes, D. T., Luetje, C. W., Leal, W. S. An odorant receptor from the southern house mosquito Culex pipiens quinquefasciatus sensitive to oviposition attractants. PloS one. 5 (4), 10090(2010).
  27. Bohbot, J. D., et al. Multiple activities of insect repellents on odorant receptors in mosquitoes. Medical and Veterinary Entomology. 25 (4), 436-444 (2011).
  28. Bohbot, J. D., et al. Conservation of indole responsive odorant receptors in mosquitoes reveals an ancient olfactory trait. Chemical Senses. 36 (2), 149-160 (2011).
  29. Leal, W. S., Choo, Y. M., Xu, P., da Silva, C. S., Ueira-Vieira, C. Differential expression of olfactory genes in the southern house mosquito and insights into unique odorant receptor gene isoforms. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (46), 18704-18709 (2013).
  30. Liu, F., Chen, Z., Liu, N. Molecular basis of olfactory chemoreception in the common bed bug, Cimex lectularius. Scientific Reports. 7, 45531(2017).
  31. Choo, Y. M., et al. Reverse chemical ecology approach for the identification of an oviposition attractant for Culex quinquefasciatus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (4), 714-719 (2018).
  32. Ruel, D. M., Yakir, E., Bohbot, J. D. Supersensitive odorant receptor underscores pleiotropic roles of indoles in mosquito ecology. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 533(2019).
  33. Xu, P., Choo, Y. M., De La Rosa, A., Leal, W. S. Mosquito odorant receptor for DEET and methyl jasmonate. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (46), 16592-16597 (2014).
  34. Xu, P., et al. Odorant inhibition in mosquito olfaction. iScience. 19, 25-38 (2019).
  35. Wicher, D., et al. Drosophila odorant receptors are both ligand-gated and cyclic-nucleotide-activated cation channels. Nature. 452 (7190), 1007-1011 (2008).
  36. DeGennaro, M., et al. orco mutant mosquitoes lose strong preference for humans and are not repelled by volatile DEET. Nature. 498 (7455), 487-491 (2013).
  37. Koutroumpa, F. A., et al. Heritable genome editing with CRISPR/Cas9 induces anosmia in a crop pest moth. Scientific Reports. 6, 29620(2016).
  38. Schneider, P. N., Hulstrand, A. M., Houston, D. W. Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method. Journal of Visualized Experiments. (45), e1864(2010).
  39. Missbach, C., et al. Evolution of insect olfactory receptors. ELife. 3, 02115(2014).
  40. Jones, P. L., Pask, G. M., Rinker, D. C., Zwiebel, L. J. Functional agonism of insect odorant receptor ion channels. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (21), 8821-8825 (2011).
  41. Butterwick, J. A., et al. Cryo-EM structure of the insect olfactory receptor Orco. Nature. 560 (7719), 447-452 (2018).
  42. Missbach, C., et al. Evolution of insect olfactory receptors. ELife. 3, 02115(2014).
  43. Nakagawa, T., Touhara, K. Functional assays for insect olfactory receptors in Xenopus oocytes. Pheromone signaling. , Humana Press. Totowa, NJ. 107-119 (2013).
  44. Dobritsa, A. A., Van Naters, W., Warr, C. G., Steinbrecht, R. A., Carlson, J. R. Integrating the molecular and cellular basis of odor coding in the Drosophila antenna. Neuron. 37 (5), 827-841 (2003).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Expressie in Xenopus oocytentwee elektrode voltage clampwhole cell stroommetingcRNA synthesemicroinjectietechniekOrco coreceptormenselijke geurreactiegastheerzoekend gedrag van muggen
Video binnenkort beschikbaar

Gerelateerde artikelen