Obesitas is een groeiend wereldwijd probleem voor de volksgezondheid. Het is eerder in verband gebracht met lymfedisfunctie, wat wijst op een vitale overspraak tussen het vetweefsel en het lymfestelsel. Hier stellen we een toegankelijke methodologie voor die het mogelijk maakt om bloed en lymfatische vasculaturen in het onderhuidse vetweefsel verschillend te labelen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Lymfe- en bloednetwerkanalyse tijdens obesitas
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Lymfeverzamelende vaten en lymfeklieren zijn onvermijdelijk ingebed in vetweefsel. De fysiologische betekenis van deze waarneming is nog steeds niet opgehelderd. Obesitas wordt echter gekenmerkt door een verminderde lymfefunctie en verhoogde doorlaatbaarheid van de bloedvaten. Omgekeerd veroorzaakt lymfedisfunctie obesitas bij muizen, wat wijst op een significante wisselwerking tussen lymfevaten en het vetweefsel. Daarom kan het begrijpen van factoren die leiden tot lymfatische disfunctie nieuwe therapeutische vensters openen om obesitas en bijbehorende comorbiditeiten te voorkomen. De eerste stap in dit proces vereist een nauwkeurige en gedetailleerde visualisatie van het lymfenetwerk in gezond en ontstoken vetweefsel. Hier beschrijven we een snelle, goedkope en efficiënte methode die het mogelijk maakt om lymfevaten en bloedvaten te labelen en te analyseren. Deze benadering maakt gebruik van de huiddrainerende lokalisatie van de armlymfeklieren in het onderhuidse vetweefsel. De lymfatische arborisatie van dit weefsel kan worden onthuld door fluorchroom-geconjugeerde lectines subcutaan te injecteren. Bovendien biedt de in vivo labelingbenadering een manier om de dichtheid en functies van lymfevaten te evalueren. Gekoppeld aan kleuring van bloedvaten, vetcellen en immuuncellen, maakt het protocol het mogelijk om het onderhuidse vetweefsel met hoge resolutie in kaart te brengen door middel van 3D-beeldvorming.
Inleiding
De lymfebloedsomloop speelt een cruciale rol bij het behoud van de weefselhomeostase en de inductie van efficiënte immuunresponsen. Lymfevaten lopen parallel aan bloedvaten en transporteren interstitiële vloeistof, metabolieten en immuuncellen naar de lokale drainerende lymfeklier (LN) en uiteindelijk naar de veneuze circulatie1. Disfunctionele lymfedrainage is waargenomen tijdens infectie, ontsteking en stofwisselingsziekten 2,3,4,5. Het lymfatische vaatstelsel bestaat uit kleine vaten die lymfatische haarvaten worden genoemd. Lymfatische capillairen worden gevormd door een enkele laag dunne lymfatische endotheelcellen (LEC's) die worden gekenmerkt door open juncties ("knopachtige" juncties) die interstitiële vloeistof, metabolieten en immuuncellen, voornamelijk dendritische cellen (DC's) en T-cellen, toegang geven tot het lymfatische capillaire lumen5. Lymfatische capillairen gaan over in grotere vaten die lymfatische verzamelvaten worden genoemd. Lymfevatische collectoren worden gekenmerkt door een laag LEC's omgeven door een spierlaag die zorgt voor autonome contractiele tonus en het behoud van de vloeistofstroom5. Bovendien beschikken verzamelvaten over kleppen die zorgen voor een unidirectionele lymfestroom.
De LEC's van collectoren en haarvaten brengen een specifieke reeks markers tot expressie die hen onderscheiden van bloedendotheelcellen (BEC's). Van die factoren is Prox1 een transcriptiefactor die de generatie van LEC's begeleidt en wordt het sterk tot expressie gebracht in LEC's terwijl het afwezig is in BEC's. De cruciale betrokkenheid van Prox1 in de biologie van LEC's werd geïllustreerd door het genereren en analyseren van Prox1-deficiënte muizen6. Prox1 heterozygote muizen hebben een defecte ontwikkeling van het lymfatisch vaatstelsel dat wordt gekenmerkt door een verminderde dichtheid van de lymfevaten en een verhoogde vasculaire permeabiliteit6. LEC's brengen VEGFR3, Podoplanin en CCL21 5 sterk totexpressie. Die markers zijn niet te vinden op BEC's en maken het mogelijk om het netwerk van lymfevaten en bloedvaten afzonderlijk te analyseren. Lyve1 wordt selectief tot expressie gebracht door lymfatische capillairen terwijl het afwezig is opverzamelvaten 5.
Er zijn drie soorten vetweefsel beschreven op basis van hun mitochondriale inhoud en de daaropvolgende kleur. Mitochondriënrijk thermogeen bruin vetweefsel speelt een sleutelrol tijdens blootstelling aan kou en bevindt zich bij muizen in het interscapulaire gebied 7,8. Witte en beige vetcellen hebben een lagere mitochondriale dichtheid en zijn voornamelijk betrokken bij energieopslag in de vorm van lipidedruppels. Witte en beige vetcellen bevinden zich in viscerale en onderhuidse depots9.
Klinische observaties legden een verband tussen obesitas en lymfedisfunctie10. Obesitas veroorzaakt morfologische veranderingen van het lymfatisch vaatstelsel van vetweefsel en leidt tot een verminderd lymfetransport11. Gegevens verkregen in preklinische modellen toonden aan dat een vetrijk dieet (HFD) een lymfatische remodellering induceert en dat zwaarlijvige muizen kleinere lymfeklieren hebben en minder lymfevaten12. Desalniettemin moeten de precieze moleculaire mechanismen die dit fenotype beheersen nog worden opgehelderd. De betrokkenheid van LEC's tijdens obesitas wordt verder ondersteund door observaties in genetische modellen met een verminderde ontwikkeling van lymfevaten. Zoals eerder besproken, vertonen Prox1 heterozygote muizen (Prox1+/-) een slecht functionerend lymfestelsel en ontwikkelen ze toevallig overmatige ophoping van visceraal vetweefsel in vergelijking met Prox1 voldoende dieren6. Interessant is dat dit fenotype van vetweefsel wordt gered door herstel van de lymfefunctie13. Samen hebben deze resultaten sterke onderlinge verbindingen tussen lymfevaten en het vetweefsel aan het licht gebracht, die verder moeten worden onderzocht.
In de context van ontsteking, een kenmerk van obesitas, brengt de veranderde expressie van LEC- en BEC-markers de analyse van deze cellen via klassieke antilichaamkleuringin gevaar 14,15. Er zijn genetische modellen ontwikkeld om specifiek LEC's en BEC's te labelen en die het mogelijk maken dit probleem op te lossen 16,17,18,19. Het gebruik van genetische reporterlijnen vereist echter meerdere veredelingsstappen en verhoogt de duur en kosten van een project aanzienlijk. Daarom stellen we voor om fluorchroom-geconjugeerde lectine-injecties te gebruiken om de bloed- en lymfecirculatiesystemen in het onderhuidse vetweefsel te onderzoeken, een eenvoudige en relatief goedkope benadering. Lectine geconjugeerd aan verschillende fluorochromen is in de handel verkrijgbaar en kan intraveneus worden geïnjecteerd om bloedvaten te labelen, of subcutaan om de huiddrainerende lymfevaten te labelen die zijn ingebed in het onderhuidse vetweefsel. Deze benadering is gebaseerd op het gebruik van afzonderlijke fluorchroom-lectineconjugaten voor elke injectie en maakt de verschillende etikettering van elk vaatstelsel mogelijk. Deze methode is ook compatibel met het gebruik van genetische modellen om het lymfe- of bloedvaatstelsel te labelen. Belangrijk is dat het meerdere uitlezingen biedt om de algehele gezondheidstoestand van het onderhuidse vetweefsel en de bloed- en lymfevatenvasculaturen die het doordringen te analyseren. Deze procedure kan gemakkelijk worden toegepast om de lymfe- en bloedvaatstelselnetwerken te analyseren tijdens acute en chronische huidziekten, waaronder psoriasis en infecties.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met lokale ethische commissies.
OPMERKING: Prox1-cre-ERT2 (Prox1tm3(cre/ERT2)Gco/J, Jax #022075) en Rosa26-LSL-tdTomato (B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm9(CAG-tdTomato)Hze/J, Ai9, Jax #007914) werden verkregen van The Jackson Laboratory en gekruist om de induceerbare lymfatische reporter-muislijn Prox1-cre-ERT2::tdTomato te verkrijgen. Muizen werden gedurende 10 generaties teruggekruist naar de C57BL/6-achtergrond. Zes weken oude Prox1-cre-ERT2::tdTomaat mannelijke muizen kregen gedurende 3 weken tamoxifendieet. Tamoxifen dieet van Envigo Teklad (dieet nr. TD.130857; 500 mg/kg) werd gebruikt. Experimenten werden uitgevoerd bij muizen van 12-14 weken oud. Dit protocol is van toepassing op muizen van elke leeftijd, geslacht of stam.
1. Materiële voorbereiding
- Steriliseer scharen, tangen en ontleedpennen met 70% ethanol.
- Bereid twee spuiten van 1 ml voor met naalden van 25 tot 27 gauge. Voor subcutane injectie raden we aan om een microspuit te gebruiken om 10 μL in de bovenste voetzool te injecteren.
- Bereid in een plastic tube van 1,5 ml 200 μL DyLight 488-geconjugeerde lectine verdund in steriel PBS in een eindconcentratie van 100 μg/ml.
- Bereid in een ander plastic tube van 1,5 ml 100 μL DyLight 649-geconjugeerd lectine, verdund in steriel PBS in een eindconcentratie van 100 μg/ml.
- Maak een bord met 6 putjes met PBS klaar en bewaar het op ijs.
- Bereid een oplossing van 4% paraformaldehyde en 30% sucrose.
2. Etikettering van onderhuids vetweefsel, bloed en lymfevaten.
- Verdoof de muis door inademing van 5% isofluraan. Beoordeel de anesthesiediepte door stevig in de poot van het dier te knijpen om ervoor te zorgen dat het dier tijdens de procedure geen letsel oploopt. De anesthesie moet worden gehandhaafd tot het einde van de lectine-injectiestappen of tot euthanasie.
- Injecteer 100 μL DyLight 488-geconjugeerde lectine intraveneus in de staartader om het bloedvaatstelsel te labelen. Wacht 15 minuten voordat u doorgaat met het verzamelen van weefsel.
- Injecteer met een andere spuit 10 μL DyLight 649-geconjugeerd lectine subcutaan op de bovenste voetzool van het dier om de drainerende lymfevaten te labelen. Wacht 15 minuten voordat u doorgaat met het verzamelen van weefsel.
- Euthanaseer de muis door cervicale dislocatie of blootstelling aan CO2 15 minuten na injectie.
3. Oogsten van onderhuids vetweefsel
- Leg de muis op zijn rug op een dissectiebord.
- Steriliseer de vacht van de muis met 70% ethanol.
- Til de huid van de flank op met een tang en maak een transversale incisie om het brachiale vetkussentje bloot te leggen.
- Trek voorzichtig aan de huid om deze te dissociëren van het depot van brachiaal vetweefsel, waardoor het volledige onderhuidse brachiale vetweefsel met de lymfeklier en het lymfecollectorvat zichtbaar wordt.
- Verwijder met een tang en een schaar voorzichtig onderhuidse vetdepots en breng ze over naar een schaal met koude PBS. Voor het beste resultaat raden we aan om de vetdepots als één stuk te verwijderen.
- Bescherm het weefsel vanaf nu tegen licht.
4. Weefsel fixatie
- Dompel het geoogste weefsel onder in een oplossing die 4% paraformaldehyde en 30% sucrose bevat.
- Incubeer het weefsel ten minste een nacht in deze oplossing voordat u het voorbereidt voor beeldvorming.
5. Kleuring en beeldvorming
- Voer voor optimale resultaten weefselopruiming en 3D-confocale acquisitie uit zoals beschreven door Gilleron en collega's20. We raden aan om een lichtbladmicroscoop te gebruiken voor analyse van grote weefsels. Extra kleuring kan worden uitgevoerd tijdens het opruimingsproces.
- Om de beste weefselmapping te bereiken, worden de volgende antilichamen gebruikt:
Voor adipocyten: perilipine
Voor macrofagen: CD68 en CD11b kleuring.
Voor dendritische cellen: MHC II en CD11b.
Voor B-cellen: B220 (CD45R) kleuring.
Voor T-cellen: CD3-kleuring.
OPMERKING: Deze methode is compatibel met het gebruik van genetische modellen om immuuncellen te labelen. - Voor de analyse van het lymfecollectorvat door middel van intravitale 2-fotonmicroscopie, injecteert u het lectine subcutaan in de onderste voetzool en visualiseert u het popliteale lymfeverzamelende vat.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Om topologische analyse van brachiaal vetweefsel, bloed en lymfevatennetwerken uit te voeren, injecteerden we Alexa Fluor 649-geconjugeerde lectine subcutaan en injecteerden we intraveneus Alexa Fluor 488-geconjugeerd lectine. Het brachiale vetweefsel werd zorgvuldig weggesneden, gefixeerd, onderworpen aan het opruimingsprotocol en geanalyseerd door middel van kleuring in de hele houder. Een schematische weergave van de procedure is opgenomen in figuur 1A. B...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Deze aanpak zorgt voor een efficiënte en robuuste labeling van de bloed- en lymfevasculaturen van het onderhuidse vetweefsel. De afzonderlijke analyse van bloed- en lymfatische endotheelnetwerken kan pathologische mechanismen ontrafelen die een of beide bloedsomlopen beïnvloeden tijdens obesitas of andere pathologische aandoeningen. Dit protocol heeft tot doel de architectuur van de vasculaire systemen, hun interactie met stromale en immuuncellen en hun functionaliteit tijdens gezondheid...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen openbaarmaking en belangenconflict te verklaren.
Dankbetuigingen
SI wordt ondersteund door het Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale (INSERM) en Agence Nationale de la Recherche (ANR-17-CE14-0017-01 en ANR-19-ECVD-0005-01). AG wordt gesteund door de Franse overheid, via de UCAJedi Investments in the Future-projecten die worden beheerd door het National Research Agency (ANR) met het referentienummer ANR-15-IDEX-01. RSC wordt ondersteund door FA-2020-01-IBD-1 van het Lawrence C. Pakula, MD IBD Education & Innovation Fund".
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Lectin DyLight 649 | Vector Labs | DL-1178-1 | Beschreven in protocol |
| Lectin DyLight 488 | Vector Labs | DL-1174 | Beschreven in protocol |
| Paraformaldehyde | VWR Chemicals | 9713.1000 | |
| Sucrose | Euromedex | CAS Number 57-50-1 | |
| Anti-Podoplanin | AngioBio | 11-033 | Verdunning : 1/50 |
| Lectin DyLight 594 | Vector Labs | DL-1177 | Beschreven in protocol |
| Anti-MHCII (Clone M5/114.15.2) | Biolegend | 107618 | Verdunning : 1/100 |
| Anti-CD11b (Clone M1/70) | Biolegend | 101218 | Verdunning : 1/100 |
| Anti-CD68 (Clone FA.11) | Biolegend | 137004 | Verdunning : 1/100 |
| Anti-B220 (Clone RA3-6B2) | Biolegend | 103225 | Verdunning : 1/100 |
| Anti-Perilipin (Clone PERI 112.17) | Progen | 651156 | Verdunning : 1/50 |
| Anti-CD3 (Clone 17A2) | Biolegend | 100210 | Verdunning : 1/100 |
Referenties
- Baluk, P., et al. Functionally specialized junctions between endothelial cells of lymphatic vessels. Journal of Experimental Medicine. 204 (10), 2349-2362 (2007).
- Fonseca, D. M., et al. Microbiota-Dependent Sequelae of Acute Infection Compromise Tissue-Specific Immunity. Cell. 163 (2), 354-366 (2015).
- Thomas, S. N., et al. Impaired humoral immunity and tolerance in K14-VEGFR-3-Ig mice that lack dermal lymphatic drainage. The Journal of Immunology. 189 (5), 2181-2190 (2012).
- Kuan, E. L., et al. Collecting lymphatic vessel permeability facilitates adipose tissue inflammation and distribution of antigen to lymph node-homing adipose tissue dendritic cells. The Journal of Immunology. 194 (11), 5200-5210 (2015).
- Randolph, G. J., Ivanov, S., Zinselmeyer, B. H., Scallan, J. P. The Lymphatic System: Integral Roles in Immunity. Annual Review of Immunology. 35, 31-52 (2017).
- Harvey, N. L., et al. Lymphatic vascular defects promoted by Prox1 haploinsufficiency cause adult-onset obesity. Nature Genetics. 37 (10), 1072-1081 (2005).
- Kajimura, S., Spiegelman, B. M., Seale, P. Brown and Beige Fat: Physiological Roles beyond Heat Generation. Cell Metabolism. 22 (4), 546-559 (2015).
- Wu, J., Cohen, P., Spiegelman, B. M. Adaptive thermogenesis in adipocytes: is beige the new brown. Genes and Development. 27 (3), 234-250 (2013).
- Cinti, S. The adipose organ. Prostaglandins, Leukotrienes & Essential Fatty Acids. 73 (1), 9-15 (2005).
- Kataru, R. P., et al. Regulation of Lymphatic Function in Obesity. Frontiers in Physiology. 11, 459(2020).
- Escobedo, N., Oliver, G. The Lymphatic Vasculature: Its Role in Adipose Metabolism and Obesity. Cell Metabolism. 26 (4), 598-609 (2017).
- Weitman, E. S., et al. Obesity impairs lymphatic fluid transport and dendritic cell migration to lymph nodes. PLoS One. 8 (8), 70703(2013).
- Escobedo, N., et al. Restoration of lymphatic function rescues obesity in Prox1-haploinsufficient mice. JCI Insight. 1 (2), (2016).
- Commerford, C. D., et al. Mechanisms of Tumor-Induced Lymphovascular Niche Formation in Draining Lymph Nodes. Cell Reports. 25 (13), 3554-3563 (2018).
- Gregory, J. L., et al. Infection Programs Sustained Lymphoid Stromal Cell Responses and Shapes Lymph Node Remodeling upon Secondary Challenge. Cell Reports. 18 (2), 406-418 (2017).
- Ivanov, S., et al. CCR7 and IRF4-dependent dendritic cells regulate lymphatic collecting vessel permeability. Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1581-1591 (2016).
- Zhong, W., et al. Prox1-GFP/Flt1-DsRed transgenic mice: an animal model for simultaneous live imaging of angiogenesis and lymphangiogenesis. Angiogenesis. 20 (4), 581-598 (2017).
- Choi, I., et al. Visualization of lymphatic vessels by Prox1-promoter directed GFP reporter in a bacterial artificial chromosome-based transgenic mouse. Blood. 117 (1), 362-365 (2011).
- Pham, T. H., et al. Lymphatic endothelial cell sphingosine kinase activity is required for lymphocyte egress and lymphatic patterning. Journal of Experimental Medicine. 207 (1), 17-27 (2010).
- Gilleron, J., et al. Exploring Adipose Tissue Structure by Methylsalicylate Clearing and 3D Imaging. Journal of Visualized Experiments. (162), e61640(2020).
- Ivanov, S., Merlin, J., Lee, M. K. S., Murphy, A. J., Guinamard, R. R. Biology and function of adipose tissue macrophages, dendritic cells and B cells. Atherosclerosis. 271, 102-110 (2018).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
