Een hydrofobe weefselopruimingsmethode voor rattenhersenweefsel

Samenvatting

Hier presenteren we een hydrofobe weefselontruimingsmethode die het mogelijk maakt om doelmoleculen te bekijken als onderdeel van intacte hersenstructuren. Deze techniek is nu gevalideerd voor F344/N-bestrijding en HIV-1 transgene ratten van beide geslachten.

Samenvatting

Hydrofobe weefselontruimingsmethoden zijn eenvoudig instelbare, snelle en goedkope procedures die het mogelijk maken om een molecuul te bestuderen dat van belang is in ongewijzigde weefselmonsters. Traditionele immunolabelingprocedures vereisen het snijden van het monster in dunne secties, wat het vermogen om intacte structuren te labelen en te onderzoeken beperkt. Als hersenweefsel echter intact kan blijven tijdens de verwerking, kunnen structuren en circuits intact blijven voor de analyse. Eerder vastgestelde clearingmethoden nemen veel tijd in om het weefsel volledig te zuiveren en de agressieve chemicaliën kunnen vaak gevoelige antilichamen beschadigen. De iDISCO-methode zuivert snel en volledig weefsel, is compatibel met veel antilichamen en vereist geen speciale laboratoriumapparatuur. Deze techniek werd aanvankelijk gevalideerd voor het gebruik in muizenweefsel, maar het huidige protocol past deze methode aan beeldhelften van controle en transgene rattenhersenen aan. Daarnaast maakt het huidige protocol ook verschillende aanpassingen aan het reeds bestaande protocol om duidelijkere beelden te bieden met minder achtergrondkleuring. Antilichamen voor Iba-1 en tyrosinehydroxylase werden gevalideerd bij de HIV-1 transgene rat en bij F344/N-controleratten met behulp van de huidige hydrofobe weefselopruimingsmethode. De hersenen zijn een verweven netwerk, waar structuren vaker samenwerken dan afzonderlijk van elkaar. Het analyseren van de hersenen als een heel systeem in tegenstelling tot een combinatie van individuele stukken is het grootste voordeel van deze hele hersenontruimingsmethode.

Inleiding

Verschillende weefselophelderingstechnieken zijn gevalideerd voor gebruik in de hersenen: hydrogel, hydrofiele en hydrofobe. Deze technieken zijn erop gericht om een weefsel transparant te maken door delipidatie, ontkleuring en ontkalking via de toediening van oplosmiddelen. Zodra de brekingsindex van het weefselmonster overeenkomt met de brekingsindex van het gekozen beeldvormingsmedium, kan een duidelijk beeld van het monster worden verkregen. Hydrogel gebaseerde technieken, zoals CLARITY, beveiligen biomoleculen in het weefsel door ze te koppelen aan hydrogels op acrylbasis, die structurele schade en verlies van eiwitten voorkomen¹. Hydrogel....

Protocol

Alle dierprotocollen werden beoordeeld en goedgekeurd door de Animal Care and Use Committee van de Universiteit van South Carolina.

1. Bereiding van voorraadoplossing

1. Oplossing 1 (1 L): Voeg aan 900 ml gedeïdentiseerde H₂O 100 ml 10x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en 2 ml Triton X-100 toe.
2. Oplossing 2 (1 L): Voeg aan 900 ml gedeïoniseerde H₂O 100 ml 10x PBS, 2 ml Tween-20 en 1 ml heparinevoorraadoplossing van 10 mg/ml toe.
3. Oplossing 3 (500 ml): Voeg aan 400 ml oplossing 1 11,5 g g glycine en 100 ml dimethylsulfoxide (DMSO) toe.
4. Oplossing 4 (50 ml): Voeg aan 42 ml oplossing....

Resultaten

Volledige clearing van grote delen van zowel F344/N als HIV-1 rat hersenweefsel werd bereikt met behulp van dit gemodificeerde hydrofobe weefsel clearing protocol. Figuur 1 toont een typische confocale afbeelding voor TH in het substantia nigra-gebied. Figuur 1A staat voor dichte, positieve kleuring. Dichte gebieden zoals deze kunnen worden uitgeleed door zich door het "Z"-vlak te concentreren om positieve kleuring en de juiste celmorfologie te bevestigen.

Discussie

Weefselontruiming biedt een oplossing voor de beperkingen van het traditionele IHC-protocol. Een monster dat transparant is, minimaliseert de verstrooiing en absorptie van licht, wat optische toegang op cellulair niveau biedt tot intacte weefsels^18,19. Weefselontruimingstechnieken maken een weefsel transparant door delipidatie, ontkleuring en ontkalking met de toediening van oplosmiddelen. Zodra de brekingsindex van het weefselmonster overeenkomt met de brekingsi.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Cholera Toxin Subunit B (Recombinant), Alexa Fluor 488	Invitrogen	C34775
DBE	Sigma-Aldrich	108014-1KG
DCM	Sigma-Aldrich	270997-100mL
DMSO	Sigma-Aldrich	472301-1L
Glycine	Fisher Chemical	G46-500
Goat anti-rabbit Alexa Fluor Plus 647	Invitrogen	A32733
Goat serum	Sigma Life Science	G9023-10mL
Heparin	Acros Organics	41121-0010
Iba1 primary antibody	FUJIFILM Wako	019-19741
Kwik-sil epoxy	VWR	70730-062
Methanol	Sigma-Aldrich	34860-1l-R
PBS	Fisher Bioreagents	BP2944-100
Perfusion machine	VWR	70730-062	mini pump variable flow
PFA	Sigma-Aldrich	158127-3KG
TH primary antibody	Millipore Sigma	AB152
TritonX-100	Fisher Bioreagents	BP151-500
Tween-20	Fisher Bioreagents	BP337-500