Methodenartikel

Een multi-cue bioreactor om de inflammatoire en regeneratieve capaciteit van biomaterialen onder flow en stretch te evalueren

DOI:

10.3791/61824

⸱

10 december 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology, 2Institute for Complex Molecular Systems (ICMS), Eindhoven University of Technology

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het doel van dit protocol is om een dynamische co-cultuur van menselijke macrofagen en myofibroblasten in buisvormige elektrospunsteigers uit te voeren om materiaalgestuurde weefselregeneratie te onderzoeken, met behulp van een bioreactor die het ontkoppelen van schuifspanning en cyclische rek mogelijk maakt.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het gebruik van resorbeerbare biomaterialen om regeneratie direct in het lichaam te induceren is een aantrekkelijke strategie vanuit een translationeel perspectief. Dergelijke materialen induceren een ontstekingsreactie bij implantatie, die de oorzaak is van daaropvolgende resorptie van het materiaal en de regeneratie van nieuw weefsel. Deze strategie, ook bekend als in situ tissue engineering, wordt nagestreefd om cardiovasculaire vervangingen zoals weefsel-engineered vasculaire grafts te verkrijgen. Zowel de ontstekings- als de regeneratieve processen worden bepaald door de lokale biomechanische signalen op de steiger (d.w.z. rek- en schuifspanning). Hier beschrijven we in detail het gebruik van een op maat ontwikkelde bioreactor die op unieke wijze het ontkoppelen van rek- en schuifspanning op een buisvormige steiger mogelijk maakt. Dit maakt een systematische en gestandaardiseerde evaluatie mogelijk van het ontstekings- en regeneratieve vermogen van buisvormige steigers onder invloed van goed gecontroleerde mechanische belastingen, wat we aantonen op basis van een dynamisch co-cultuurexperiment met menselijke macrofagen en myofibroblasten. De belangrijkste praktische stappen in deze aanpak - de bouw en het opzetten van de bioreactor, de voorbereiding van de steigers en het zaaien van cellen, het aanbrengen en onderhouden van rek- en afschuifstroom en het oogsten van monsters voor analyse - worden in detail besproken.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cardiovasculaire weefseltechniek (TE) wordt nagestreefd als een alternatieve behandelingsoptie voor de momenteel gebruikte permanente cardiovasculaire prothesen (bijv. vasculaire grafts, hartklepvervangingen), die suboptimaal zijn voor grote cohorten van patiënten1,2,3,4. Veelgevraagde toepassingen zijn weefselgeïnjeneerde vasculaire grafts (TEVGs)5,6 en hartkleppen (TEHVs)7,8. Meestal maken cardiovasculaire TE-methodieken gebruik van resorbeerbare biomaterialen (natuurlijk of synthetisch) die dienen als een leerzame steiger voor het nieuwe weefsel dat moet worden gevormd. De vorming van nieuw weefsel kan volledig in vitro worden ontworpen, door de steiger met cellen te zaaien en te cultiveren in een bioreactor voorafgaand aan implantatie (in vitro TE)9,10,11, of direct in situ, waarbij de synthetische steiger wordt geïmplanteerd zonder voorkweek om de vorming van nieuw weefsel rechtstreeks in het lichaam te induceren (in situ TE)12,13,14. Voor zowel in vitro als in situ cardiovasculaire TE-benaderingen is succesvolle functionele regeneratie dominant afhankelijk van zowel de immuunrespons van de gastheer op de geïmplanteerde constructie als de juiste biomechanische belasting.

Het belang van biomechanische belasting voor cardiovasculaire TE wordt algemeen erkend15. In het geval van cardiovasculaire implantaten worden de cellen die de steiger bevolken blootgesteld aan cyclische rek- en schuifspanningen die ontstaan als gevolg van de hemodynamische omgeving. Talrijke studies hebben het stimulerende effect van (cyclische) rek op de vorming van matrixcomponenten, zoals collageen16, 17,18,19,glycosaminoglycanen (GAGs)20, en elastine21,22, door verschillende celtypen gerapporteerd. Huang et al. toonden bijvoorbeeld aan dat biaxiale stretch de afzetting en organisatie van collageen en elastine in in vitro TEVGs verhoogde met behulp van een vasculaire bioreactor23. Hoewel de nadruk meestal ligt op rek als dominante belasting, maken deze studies vaak gebruik van door debiet aangedreven bioreactoren waarin het monster ook wordt blootgesteld aan afschuifstroom. Hoewel er relatief weinig bekend is over de geïsoleerde invloed van afschuifspanningen op weefselvorming en ontsteking in 3D, zijn er enkele gegevens beschikbaar. Zo toonden Hinderer et al. en Eoh et al. aan dat afschuifstroom, naast een 3D steigermicrostructuur, belangrijk was voor de vorming van volwassen elastine door menselijke vasculaire gladde spiercellen in een in vitro modelsysteem24,25. Al met al illustreren deze bevindingen de relevantie van zowel cyclische rek- als afschuifspanning voor cardiovasculaire TE.

Een andere belangrijke bepalende factor voor het succes of falen van TE-implantaten is de immuunrespons van de gastheer op de geïmplanteerdeent 26. Dit is met name belangrijk voor materiaalgestuurde TE-strategieën in situ, die eigenlijk afhankelijk zijn van de acute ontstekingsreactie op de steiger om de daaropvolgende processen van cellulaire instroom en endogene weefselvorming en remodellering op gang te brengen27. De macrofaag is een kritische initiator van functionele weefselregeneratie, wat is aangetoond door meerdere studies28,29,30. Analoog aan wondgenezing wordt de regeneratie van weefsel geregeld door paracrinesignalering tussen macrofagen en weefselproducerende cellen zoals fibroblasten en myofibroblasten31,32,33. Naast het coördineren van nieuwe weefseldepositie zijn macrofagen betrokken bij de actieve resorptie van vreemd steigermateriaal34,35. Als zodanig is de in vitro macrofaagrespons op een biomateriaal geïdentificeerd als een voorspellende parameter voor het in vivo succes van implantaten36,37,38.

De macrofaagrespons op een geïmplanteerde steiger is afhankelijk van steigerontwerpkenmerken zoals materiaalsamenstelling en microstructuur35,39,40. Naast steigereigenschappen wordt ook de macrofaagrespons op een steiger en hun overspraak met myofibroblasten beïnvloed door hemodynamische belastingen. Cyclische stretch bleek bijvoorbeeld een belangrijke modulator te zijn van macrofaagfenotype41,42,43,44 en de afscheiding van cytokinen43,44,45,46 in 3D-elektrospunsteigers. Battiston et al. toonden met behulp van een co-kweeksysteem van macrofagen en vasculaire gladde spiercellen aan dat de aanwezigheid van macrofagen leidde tot verhoogde niveaus van elastine en GAG's en dat matige niveaus van cyclische stretch (1,07-1,10) de afzetting van collageen I en elastine47stimuleerden . In eerdere werken hebben we aangetoond dat schuifspanning een belangrijke determinant is voor monocytwerving in 3D-elektrospunsteigers48,49, en dat zowel schuifspanning als cyclische rek de paracrinesignalering tussen menselijke monocyten en mesenchymale stromale cellenbeïnvloeden 50. Fahy et al. toonden aan dat de afschuifstroom de afscheiding van pro-inflammatoire cytokinen door menselijke monocyten verhoogde51.

Al met al toont het bovenstaande bewijs aan dat een adequaat begrip van en controle over hemodynamische belastingen cruciaal is voor cardiovasculaire TE, en dat het belangrijk is om de ontstekingsreactie te overwegen om dit te bereiken. Talrijke bioreactoren zijn eerder beschreven voor de in vitro52,53,54,55,56,57,58 of ex vivo59,60,61 kweek van cardiovasculaire weefsels. Al deze systemen zijn echter ontworpen om de fysiologische hemodynamische belastingsomstandigheden zoveel mogelijk na te bootsen. Hoewel dit zeer waardevol is voor het creëren van cardiovasculaire weefsels in vitro of het handhaven van ex vivo-culturen, maken dergelijke systemen geen systematisch onderzoek naar de individuele effecten van individuele signalen mogelijk. Dit komt omdat de toepassing van zowel cyclische rek- als schuifspanning in deze bioreactoren wordt aangedreven door dezelfde drukstroom, die ze intrinsiek verbindt. Hoewel microsystemen die nauwkeurige multi-cue mechanische manipulatie mogelijk maken, zijn beschreven voor 2D-substraten62 of 3D-hydrogelopstellingen63,64, maken dergelijke opstellingen het niet mogelijk om elastomeer 3D-biomateriaalsteigers op te zetten.

Hier presenteren we de toepassing van een buisvormig bioreactorsysteem dat op unieke wijze de ontkoppeling van schuifspanning en cyclische rek mogelijk maakt en helpt om hun individuele en gecombineerde effecten mechanistisch te onderzoeken. Dit systeem maakt het mogelijk om een breed scala aan weefselgeënskundig vasculaire grafts te testen (bijv. synthetische of natuurlijke oorsprong, verschillende micro-architectuur, verschillende porositeiten). Om de toepassing van afschuifspanning en rek effectief los te ontkoppelen, zijn de belangrijkste concepten die de bioreactor gebruikt (1) scheiding van de controle van schuifspanning en rek met behulp van verschillende pompsystemen en (2) stimulatie van de steigers op een 'inside-out' manier met rekengestuurde afmetingen. Debiet wordt aangebracht op het buitenoppervlak van de buissteiger door het gebruik van een stromingspomp, terwijl de omtrek van de steiger wordt veroorzaakt door het uitzetten van een siliconenbuis waarop de steiger is gemonteerd door het gebruik van een aparte stampomp. De afmetingen van de siliconenbuis en de glazen buis die de constructie bevat, worden zorgvuldig gekozen en gevalideerd met behulp van computationele vloeistofdynamicasimulaties, om ervoor te zorgen dat de schuifspanning op de steiger (als gevolg van stroming) en de omtrekspanning (als gevolg van buisuitbreiding) elkaar niet significant beïnvloeden. Dit inside-out ontwerp heeft verschillende praktische redenen. Als stretch wordt toegepast door de lichtgevende vloeistofdruk (vergelijkbaar met fysiologische belasting), vereist dit inherent dat het monsterontwerp lekvrij is. Bovendien zou de druk die nodig is om het monster uit te rekken volledig worden bepaald door de stijfheid van het monster, die in de loop van de tijd tussen de monsters en binnen een monster kan variëren, waardoor het moeilijk is om de rek te controleren. Deze bioreactor monteert het weefsel ontworpen transplantaat rond een siliconenbuis en maakt het mogelijk om muurschaarspanning (WSS) aan te brengen op de buitenwand van de graft en zet de ent van binnenuit onder druk. Op deze manier kunnen gelijke belastingsomstandigheden tussen monsters en binnen monsters in de loop van de tijd worden gegarandeerd, en bovendien mogen de monsters lekken, zoals gebruikelijk is voor poreuze vasculaire steigers19. Deze inside-out bioreactor is specifiek bedoeld voor systematisch onderzoek naar de effecten van afschuiven en/of rekken, in plaats van de engineering van een native-achtig bloedvat in vitro, waarvoor traditionele vasculaire bioreactoropstellingen geschikter zijn. Zie figuur 1A–B voor de ontwerptekeningen van de bioreactor en de bijbehorende tabel 1 voor een functionele beschrijving en motivering achter de belangrijkste componenten van de bioreactor.

Het gebruik van de bioreactor wordt aangetoond op basis van een reeks recente studies van onze groep waarin we de individuele en gecombineerde invloeden van schuifspanning en cyclische rek op ontsteking en weefselvorming in resorbeerbare elektrospunsteigers voor in situ cardiovasculair weefsel19,43,44onderzochten . Daartoe gebruikten we menselijke macrofagen en myofibroblasten in mono- of in co-cultuur om de verschillende fasen van de regeneratieve cascade in situ te simuleren. We hebben aangetoond dat cytokinesecretie door menselijke macrofagen duidelijk wordt beïnvloed door zowel cyclische rek- als schuifspanning, die de matrixdepositie en organisatie door menselijke myofibroblasten in deze steigers beïnvloedt, zowel via paracrinesignalering als direct contact19,43,44. Met name deze studies toonden aan dat in het geval van gecombineerde toepassing van afschuifspanning en rek, de effecten op weefselvorming en ontsteking worden gedomineerd door een van de twee belastingen, of dat er synergetische effecten van beide belastingen zijn. Deze bevindingen illustreren de relevantie van het ontkoppelen van beide belastingen om een beter inzicht te krijgen in de bijdrage van de mechanische omgeving aan TE-processen. Dit begrip kan worden toegepast om steigerontwerpparameters systematisch te optimaliseren in relevante hemodynamische belastingsregimes. Bovendien kunnen de mechanistische gegevens uit dergelijke goed gecontroleerde omgevingen dienen als input voor numerieke modellen die worden ontwikkeld om het verloop van in situ weefselremodellering te voorspellen, zoals onlangs gerapporteerd voor TEVGs65 of TEHVs66, om de voorspellende capaciteit verder te verbeteren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In de studies die in dit protocol worden beschreven, zijn primaire menselijke macrofagen geïsoleerd uit perifere bloedpoeljassen en menselijke myofibroblasten geïsoleerd uit de sapheneuze ader na coronaire omleidingsoperaties gebruikt44. De buffy jassen werden verkregen van gezonde, geanonimiseerde vrijwilligers die schriftelijke geïnformeerde toestemming gaven, die werd goedgekeurd door de Sanquin Research Institutional Medical Ethical Committee. Het gebruik van menselijke vena saphena cellen (HVSC's) was in overeenstemming met de "Code Proper Secondary Use of Human Tissue" ontwikkeld door de Federatie van Medische Verenigingen (FMWV) in Nederland.

1. Algemene voorbereidingen en vereiste acties voor het opzetten van de bioreactor

OPMERKING: Voor meer informatie over de respectieve isolatie- en cultiveringsprotocollen verwijzen wij u naar eerder werk19,43,44. Alle berekeningen in het protocol worden gegeven als voorbeelden voor een co-kweekexperiment met monocyten en myofibroblasten, gezaaid in 8 hemodynamisch geladen steigers en 2 statische controles (n=10).

  1. Start celisolatie en celkweek. De zaaidichtheden voor de co-gekweekte monsters van monocyten en myofibroblasten (met een zaaiverhouding van 2:1) zijn respectievelijk 30 × 106 monocyten/cm3 en 15 × 106 myofibroblasten/cm3.
    OPMERKING: Het elektrospunmateriaal heeft een hoge porositeit (>90%). Om het vereiste aantal cellen per ent te schatten, wordt het volume van de steiger berekend met de formule voor het volume van een holle cilinder: π *(dikte)2*lengte ≈ 0,04 cm3. De totale hoeveelheid cellen per ent is 1,2 × 106 monocyten en 0,6 × 106 myofibroblasten. Voor 10 monsters zijn ten minste 12 × 106 monocyten en 6 × 106 myofibroblasten vereist; start met maximaal ~10-15% meer cellen om rekening te houden met mogelijke pipetteerfouten.
  2. Ontgast het celkweekmedium dat zal worden gebruikt voor experimenten met de bioreactor.
    1. Bereid het medium voor op coculturen, dat bestaat uit RPMI-1640:aDMEM (1:1), aangevuld met 10% foetale runderserum, 1% penicilline-streptomycine en 0,5% L-glutamine.
    2. Plaats het medium 's nachts (O/N) in een incubator in een celkweekkolf met filterdop om te ontgassen.
    3. Vervang de filterdop door een luchtdichte dop en bewaar deze bij 4 °C.
    4. Voeg vlak voor gebruik 0,25 mg/ml L-ascorbinezuur 2-fosfaat (vitamine C) toe aan het medium.
      OPMERKING: Voor berekeningen is de benodigde hoeveelheid medium per debietkkamer 50 ml. Ververs het medium drie keer per week; 25 ml oud medium wordt vervangen door 25 ml vers medium. Voor 10 monsters; na het zaaien is in totaal 500 ml vers medium vereist en voor elke volgende mediumverandering wordt in totaal 250 ml vers medium gebruikt. Bereid medium altijd vers, vooral vitamine C moet worden toegevoegd net voordat het medium wordt vervangen.
  3. Bereid isotrope elektrospunsteigers (3 mm luminal diameter, 200 μm wanddikte) voor zoals beschreven door Van Haaften et al.19 (Figuur 1G–I). Kortom, buisvormige polycaprolacton bisurea (PCL-BU) steigers worden geproduceerd door elektrospinning van 15% (m/w) chloroform-polymeer oplossingen. De polymeeroplossingen zijn elektrospun bij kamertemperatuur en 30% relatieve vochtigheid, bij een debiet van 40 μL/min, 16 cm afstand van het roterende cilindrische doel (Ø 3 mm, 500 tpm), en een toegepaste spanning van 16 kV op het elektrospinningmondstuk en -1 kV op het doel.
    OPMERKING: Hoewel PCL-BU-grafts voor deze experimenten werden gebruikt, kan in deze bioreactor een grote verscheidenheid aan elastomeerweefsel-engineered grafts worden gemonteerd (bijv. van verschillende synthetische of natuurlijke oorsprong, verschillende microarchitectuur, verschillende porositeiten)
    1. Verwijder de elektrospunsteigers van de doorn.
      1. Maak een klein gaatje in de dop van een buis van 15 ml om de doorn in het midden te 'houden' en te voorkomen dat deze de wand van de buis raakt.
      2. Plaats de doorn met de elektrospunsteiger in de valkbuis en vul deze met gedeioneerd water.
      3. Vries de buizen O/N in bij -20 °C.
      4. Plaats de buizen op kamertemperatuur (RT) en trek de mandrels na een paar minuten eruit, waarbij de elektrospuntransplantaten in het ijs achterblijven.
      5. Laat het ijs volledig ontdooien, haal de elektrospunbuis uit het ontdooide water en 'hang' om enkele uren verticaal te drogen. Zorg ervoor dat de steigers niet onder hun eigen gewicht 'instorten'.
    2. Droge steigers onder vacuüm O/N.
    3. Afbeelding van een klein monster van de elektrospuntransplantaten met behulp van scanning elektronenmicroscopie (SEM) om hun microstructuur te beoordelen (bijv. vezelmorfologie, vezeldiameter). De grafts in de voorbeeldstudies hebben een isotrope vezeloriëntatie en een vezeldiameter van 5 μm (figuur 1H–I).
  4. Plaats een dag voor aanvang van het experiment het hydraulische reservoir gevuld met gedeioneerd water in de incubator. Sluit alle acht aansluitingen voor flowcultuurkamers met witte Luer caps. Sluit aan op het persluchtsysteem en plaats de druksensor. Laat de trekpomp draaien (zie stap 5.6) O/N om een kleine uitzetting van de Teflon balg mogelijk te maken.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat alle benodigde materialen en apparatuur worden gereinigd en/of geautoclaveerd (zie tabel met materialen, opmerkingen/beschrijving kolom voor welke materialen mogen worden geautoclaveerd), volgens het protocol van de fabrikant of zoals beschreven in stap 7.3–7.6.
  5. Zorg voor steriele werkomstandigheden voor de rest van het protocol.
    1. Voer stap 2–5.3 (het opzetten van het systeem), stap 6.3 (medium change) en stap 7.1–7.2 (oogst van vasculaire constructies) uit in een steriele laminaire stroomkast.
    2. Plaats materialen die niet direct nodig zijn voor de volgende stappen in gesloten Petrischalen om alles zo schoon mogelijk te houden.
    3. Reinig of droog materiaaloppervlakken regelmatig door een papieren tissue te weken met 70% ethanol en veeg de oppervlakken van de bioreactorcomponenten en de laminaire stroomkast af.

2. Het opzetten van de bioreactor

OPMERKING: Voer stap 2 uit in een laminaire stromingskast.

  1. Snijd de elektrospunsteigers in buizen met een lengte van ongeveer 25 mm en documenteer ze voor gebruik (bijv. foto voor de lengte, weeg met balans voor de beginmassa).
  2. Ontsmet de elektrospun steigers.
    1. Plaats de elektrospunsteigers gekanteld in een putplaat of petrischaal, met één opening naar de ultraviolette (UV) lichtbron gericht, zodat UV-licht (253,7 nm) de binnenkant van de steigers kan verlichten.
    2. Stel de elektrospunsteigers gedurende 5 minuten bloot aan UV-licht.
    3. Draai alle steigers en herhaal de UV-verlichting voor de andere opening.
      OPMERKING: Raak na deze stap alleen de elektrospunsteiger aan wanneer dat nodig is. Gebruik altijd een schoon pincet of schone handschoenen.
    4. Neem de glazen buizen van de stromingscultuurkamers die voor 70% zijn opgeslagen, was de glazen buizen in ultrapure water, droog en plaats ze in een grote, gesloten petrischaal.
      OPMERKING: De volgende stappen, met name de stappen 2.3–2.5, worden idealiter uitgevoerd door twee experimenteerders.
  3. Monteer de elektrospun steigers op de siliconen slang.
    1. Bevestig de 5-0 proleen hechtdraad aan het ene uiteinde van de siliconenslang door de hechtdraad door de ene kant van de buis en de andere kant te halen, waardoor twee tegenover elkaar liggende strakke hechtingen over de doorsnede van de slang blijven. Maak een kleine knoop aan beide zijden van de buis terwijl u de buis op de locus van de knopen samendrukt en laat ongeveer 10 cm draad achter op beide knopen. Maak een derde knoop aan het einde van de twee overgebleven draden van 10 cm.
      1. Snijd de hechtnaald en alle vrije draden af die kunnen uitsteken en de binnenkant van de elektrospunsteiger kunnen beschadigen. Snijd de randen van de siliconenslang weg in een driehoekige vorm om te helpen bij het trekken van de siliconenslang door de elektrospunsteiger.
    2. Dompel de elektrospunsteiger in 30% ethanol (dit dient als extra ontsmettingsstap en helpt bij het schuiven van de elektrospunsteiger over de siliconenslang) en plaats de elektrospunsteiger over de vrije draad van 10 cm. Experimenteerder A rekt de siliconenslang uit door zachtjes aan zowel de siliconenslang als de knoop van de hechtdraad van 10 cm te trekken, terwijl experimenteerder B de elektrospunsteiger voorzichtig over de siliconenslang schuift met een pincet met een gladde binnentip om beschadiging van de steigers te voorkomen.
    3. Laat de stretch op de siliconenslang langzaam los, terwijl tegelijkertijd de elektrospunsteiger met een pincet wordt gladgestreken. Dompel de electrospun steiger twee keer in ultrapure water op de siliconen slang.
      OPMERKING: Het is mogelijk dat er wat rimpels van de elektrospunsteiger optreden. Dit rimpelen verdwijnt tijdens de aangebrachte pre-stretch vlak voordat de steigers aan de drukleidingen bij stap 2.5.3 worden bevestigd.
    4. Herhaal stap 2.3.2 en 2.3.3 voor de andere elektrospun steigers. Afhankelijk van de lengte van de siliconenslang kunnen meerdere elektrospun steigers op dezelfde siliconen buizen worden gemonteerd.
    5. Wanneer alle elektrospunsteigers op de siliconenslang zijn gemonteerd, snijdt u de siliconenslang rond de steigers, allemaal op dezelfde lengte (5,5 cm); aan de ene kant, dicht bij het einde van de elektrospun steiger, aan de andere kant, waardoor ~ 2-3 cm gratis siliconen buizen achterblijven.
  4. Bouw het onderste compartiment van de stromingscultuurkamer (afbeelding 1A–B).
    1. Neem het bovenste deel van het onderste compartiment met het stroomuitlaat en sluit het stroomuitlaat met een mannelijke Luer-stekker.
    2. Duw de drukleiding met gaten door het onderste compartiment en plaats een siliconen O-ring rond het onderste uiteinde van de drukleiding om lekkage te voorkomen. Schroef het onderste deel van het onderste compartiment op het bovenste deel van het onderste compartiment om de drukleiding vast te zetten. Zorg ervoor dat de onderste gegraveerde groef van de drukleiding zich ongeveer 3-5 mm boven de rand van de adapterbus van het onderste compartiment bevindt; dit zal later de strakke knoop van de hechtdraad 'vasthouden' en de elektrospunsteiger over de siliconenslang bevestigen.
      OPMERKING: Als de drukleiding gemakkelijk op en neer kan worden gemanoeuvreerd, geeft dit aan dat het onderste compartiment niet goed is vastgezet. Herhaal stap 2.4.2 om lekkage in latere stadia te voorkomen (figuur 2D).
  5. Bevestig de siliconen slang met de elektrospun steiger aan de drukleiding.
    1. Trek de siliconenbuis met de elektrospunsteiger over de drukleiding.
    2. Maak een knoop met de hechtdraad aan de onderkant van de elektrospunsteiger op de plaats van de gegraveerde groef op de drukleiding. Maak een tweede knoop aan de andere kant om de siliconen slang stevig vast te zetten met de elektrospuntransplantaat.
      LET OP: Dit is een cruciale stap. Zorg ervoor dat de knoop precies in de gegraveerde groef van de drukleiding 'valt' om lekkage van het water van het hydraulische reservoir naar de stromingscultuurkamers te voorkomen. Als u het niet zeker weet, probeer dan de hechtdraad op verschillende posities, boven of onder de verwachte locatie van de groef, aan te draaien om ervoor te zorgen dat de laatste knopen zich precies op de gegraveerde groef bevinden (figuur 2A).
    3. Plaats de schaarklem aan de bovenkant van de siliconenbuis en strek de siliconenslang naar boven (dit zal de eerste knoop direct testen, als het mogelijk is om de siliconenslang met de elektrospunsteiger over de drukleiding te bewegen, werd deze niet goed genoeg vastgedraaid). Met de trekkracht wordt de siliconen slang voorgespannen. Om ervoor te zorgen dat de siliconenslang consistent is tussen de verschillende monsters, bevestigt u een liniaal aan de schaarklem. Trek de schaarklem omhoog totdat het onderste uiteinde van de liniaal de hoogte van het onderste uiteinde van de steiger bereikt.
      OPMERKING: Het is belangrijk om de pre-stretch in elk monster ongeveer hetzelfde te houden (~ 5%) om twee redenen: (1) als siliconenbuizen vooraf worden uitgerekt, zal dit resulteren in een homogenere uitzetting over de lengte van het monster wanneer het onder druk staat; (2) de pre-stretch zal van invloed zijn op de mechanische eigenschappen van de siliconen, daarom moet deze voor alle monsters hetzelfde zijn om gelijke rekomstandigheden tussen de monsters te garanderen.
    4. Verwijder rimpels in de elektrospun steiger door voorzichtig aan de elektrospun steiger te trekken. Nogmaals, maak twee knopen aan beide zijden met een hechtdraad aan de bovenkant van de steiger op de plaats van de bovenste gegraveerde groef op de drukleiding.
    5. Laat de schaarklem los en snijd het teveel aan siliconenslangen weg met een mes, waarbij 20-30% van de schroefdraad bedekt is met siliconenslangen, om lekkage te voorkomen wanneer de neuskegel op de schroefdraad is gemonteerd.
      OPMERKING: Herhaal stap 2.4 en 2.5 voor alle dynamische monsters.
    6. Voor de statische controlemonsters bevestigt u de elektrospunsteiger die op de siliconenslang is gemonteerd op drukleidingen zonder gaten. Deze leidingen kunnen tot het zaaien (stap 4) apart in een buis van 15 ml worden bewaard en hoeven niet in de compartimenten van de stromingscultuurkamer te worden gemonteerd.
  6. Ontsmet de gedeeltelijk geconstrueerde stromingscultuurkamers met elektrospunsteiger door deze gedurende 10 minuten aan UV-licht bloot te stellen. Draai de stromingscultuurkamers met elektrospunsteigers naar de andere kant en herhaal de blootstelling aan UV-licht gedurende 10 minuten.
  7. Schroef de neuskegels op de schroefdraad van de drukleidingen met gaten voor de dynamische monsters.
    1. Zorg ervoor dat de bovenkant van de siliconenslang in de neuskegel past om lekkage in latere stadia te voorkomen. Als er te veel siliconenslangen zijn, snijdt u het teveel aan slangen weg met een mes.
    2. Plaats de deels geconstrueerde stromingscultuurkamers in een grote petrischaal en richt de neuskegel naar de UV-lichtbron. Breng UV-verlichting gedurende 5 minuten aan.
  8. Volledige constructie van de stromingscultuurkamer met de glazen buis en het bovenste compartiment van de stromingscultuurkamer (afbeelding 1A–B).
    1. Maak de elektrospunsteigers voorbespookt door de drukleiding met de siliconenslang en de elektrospunsteiger in 30% ethanol te dompelen, gevolgd door een duik in ultrapure water twee keer.
    2. Plaats de glazen buis over de drukbuis en duw voorzichtig in het onderste compartiment en zet deze voorzichtig vast.
    3. Neem het bovenste compartiment met de stroominlaat, plaats een siliconen O-ring, de stromingsser en de adapterbus in de juiste volgorde (afbeelding 1A–B), en plaats deze over het open uiteinde van de glazen buis en zet deze voorzichtig vast.
    4. Schroef een witte Luer dop op de flow inlaat van het bovenste compartiment.
    5. Verwijder de mannelijke Luer-stekker uit de stroomuitlaat van het onderste compartiment en reinig het oppervlak eromheen met een met ethanol doordrenkt papierweefsel.
    6. Plaats een spuit met 10 ml ultrapure water in de stroomuitlaat, open de witte Luer-dop op het bovenste compartiment en vul de kamer met ultrapure water. Sluit de witte Luer-dop opnieuw, verwijder de spuit, reinig opnieuw met ethanol en sluit de stroomuitlaat met een mannelijke Luer-stekker.
      OPMERKING: Herhaal stap 2.6–2.8 voor alle stromingscultuurkamers.
    7. Voeg voor de statische regelaars 10 ml ultrapure water toe aan de buizen van 15 ml die de monsters op de drukleidingen zonder gaten houden.
  9. Plaats alle flow kweekkamers in de incubator. Vervang het ultrapure water een dag voor het zaaien van cellen door kweekmedium op dezelfde manier als beschreven in stap 2.8.5 en 2.8.6 (zorg ervoor dat u het 'oude' ultrapure water opvangt met een met ethanol doordrenkt papierweefsel dat direct op de stroomuitlaat wordt geplaatst).

[Het protocol kan hier worden onderbroken]

3. Voorbereidingen voor de installatie van de debietpomp

OPMERKING: Voer stap 3 uit in een laminaire stromingskast.

  1. Verzamel alle pompopstellingsmaterialen en bereid u voor op gebruik.
    OPMERKING: Experimenteerders worden verwezen naar het protocol van de fabrikant voor een gedetailleerde beschrijving van het instellen van de pomp, de vloeistofeenheden en de medium tubing door de kleppen van de vloeistofeenheid.
    1. Stel de pomp in op 200 mbar capaciteit.
    2. Schroef de reservoirhouders voor reservoirs van 60 ml op de vloeistofunits.
    3. Reinig de herbruikbare rubberen luchtfilters met een papierdoekje gedrenkt in ethanol, zorg ervoor dat het luchtfilter droog blijft.
  2. Plaats de reservoirs van 60 ml in de reservoirhouders en plaats de standaard medium slang door de kleppen van de vloeistofeenheid. Verbind de medium slang met een grotere binnendiameter met vrouwelijke Luer slotkoppelingen in een gesloten lus.
  3. Klem de medium slang vast met een slangklem, direct onder de reservoirs.
  4. Vul de reservoirs met 25 ml kweekmedium per reservoir van 60 ml. Laat de slangklem los en laat het medium in de slang komen.
  5. Sluit de medium reservoirs met de rubberen luchtfilters en plaats de stromingspompopstelling in de incubator tot stap 4.

4. Cel zaaien met behulp van Fibrin als celdrager

OPMERKING: Voer stap 4 uit in een laminaire stromingskast.

  1. Bereid de fibrinegel voor op de celzadingstap. Zie Mol et al.67 Voor de fibrinegel moet de fibrinogeenoplossing een eindconcentratie van 10 mg/ml hebben (correct voor de zuiverheid van de eiwitvoorraad) en moet de trombineoplossing een eindconcentratie van 10 U/ml hebben.
    1. Ontdooi fibrinogeen tot RT, voordat u ~50 mg (genoeg voor 10 monsters) weegt in een plastic container met een rood deksel.
    2. Voeg celkweekmedium toe om de fibrinogeenoplossing te bereiden (bij een concentratie van 10 mg/ml, correct voor de zuiverheid van de eiwitvoorraad). Meng goed en filtreer om de fibrinogeenoplossing te steriliseren met een spuitfilter van 0,2 μm in een steriele buis van 15 ml. Houd de gefilterde fibrinogeenoplossing op ijs.
      OPMERKING: Vermijd het te lang van tevoren bereiden van de fibrinogeenoplossing, anders kan het fibrinogeen spontaan stollen.
    3. Ontdooi trombine en maak een trombineoplossing (bij een concentratie van 10 U/ml) in celkweekmedium en plaats op ijs. Bereid 20 μL trombine + cellenoplossing per monster. Voor n=10 monsters is 200 μL nodig; bereid daarom 250 μL trombineoplossing voor om mogelijke pipetfouten te verklaren.
  2. Verzamel en tel de cellen uit de kweekkolven. Meng de cellen in de gewenste verhouding en hoeveelheid (1,2 × 106 monocyten en 0,6 × 106 myofibroblasten per steiger). Zorg ervoor dat er voldoende cellen zijn voor n+1-monsters om te corrigeren voor pipetfouten. Centrifugeer op 350 × g gedurende 10 min bij RT. Verwijder het supernatant.
  3. Maak een mengsel van de gesuspendeerde cellen en trombine.
    1. Gebruik voor elk monster 20 μL van de trombineoplossing. Voeg voor n=10 monsters 200 μL trombine toe aan de celkorrel en meng. Meet het volume van de celsuspensie (cellen + trombine) en bereken hoe de cel gelijkmatig over alle 10 steigers moet worden verdeeld (bijv. als de trombine + celsuspensie een volume van 260 μL heeft, ontvangt elk elektrospunmonster 260 μL/10 monsters = 26 μL trombine + celsuspensie).
    2. Terwijl het zaaien van de steigers in twee stappen wordt uitgevoerd, bereidt u twee microfugebuizen van 1,5 ml voor die de helft van de celophanging voor elke steiger bevatten (in de voorbeeldberekening van de vorige stap: bereid twee buizen voor met 13 μL trombine + celsuspensie). Plaats op ijs.
      OPMERKING: De volgende stappen, met name stap 4.4, worden idealiter uitgevoerd door twee experimenteerders.
  4. Droog de voorge bevochtigde elektrospunsteigers met vacuüm om zich voor te bereiden op het zaaien van cellen.
    1. Sluit een glazen Pasteur-pipet aan op het vacuümsysteem van de laminaire stromingskast en plaats deze in een lege buis van 50 ml voor steriele tijdelijke opslag.
    2. Haal de stromingskweekkamers uit de incubator, verwijder de mannelijke Luer-stekker uit de stroomuitlaat en verwijder het medium na het openen van de witte Luer-dop en het plaatsen van een met ethanol doordrenkt papierweefsel voor de stroomuitlaat.
    3. Haal het bovenste compartiment en de glazen buis eraf en plaats het in een steriele petrischaal voor tijdelijke opslag.
    4. Plaats de vacuüm Pasteur pipet op de elektrospun steiger en verwijder zoveel mogelijk medium.
      LET OP: Droog de elektrospun steiger zeer voorzichtig. Plaats de vacuümpijp op meerdere plaatsen in plaats van een heen en weer lineaire beweging over de steiger. Klem de vacuümslang bovenop de pipet van de Pasteur tussen de vingers voor een betere controle.
    5. Meng de fibrinogeenoplossing in een verhouding van 1:1 met de trombine + celsuspensie (meng bijvoorbeeld 13 μL fibrinogeen met 13 μL trombine + celsuspensie). Om ervoor te zorgen dat de fibrine polymeriseert in de steiger en niet in de microfuge buis, pipet de fibrinogeen, draai het pipet wiel voor het 'extra volume' van de trombine + cel suspensie, en pipet op en neer een keer in de microfuge buis met cel suspensie te mengen.
    6. Druppel de oplossing direct homogeen over de volledige lengte van de elektrospunsteiger. Het wordt geadviseerd dat Experimenter A het fibrinemengsel druppelt, terwijl experimenteerder B het onderste compartiment vasthoudt met de elektrospunsteiger gemonteerd op de drukleiding.
    7. Nadat de fibrine met de cellen over de elektrospunsteiger is gedruppeld, beweegt Experimenter B de steiger langzaam, van links naar rechts en op en neer, om de cellen verder gelijkmatig over de steiger te verdelen.
    8. Herhaal stap 4.4.5 - 4.4.7 aan de andere kant van de elektrospun steiger.
    9. Monteer de stromingscultuurkamer opnieuw door de glazen buis zorgvuldig te plaatsen (voorkom dat fibrine blijft plakken en stollen aan de binnenkant van de glazen buis) en duw het bovenste compartiment van de stromingscultuurkamer terug. Plaats de gezaaide constructie zonder medium of fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) direct in de stromingscultuurkamer in de incubator.
    10. Herhaal stap 4.4.1–4.4.9 voor alle dynamische monsters. Voor de statische monsters die op drukleidingen zonder gaten zijn gemonteerd, moet u volgens de stappen 4.4.1-4.4.8 zaaien en daarna in een buis van 15 ml plaatsen.
    11. Laat de fibrine polymeriseren gedurende 60 minuten in de incubator.

[Het protocol kan hier 30-60 minuten worden onderbroken.]

  1. Vul na polymerisatie de stromingscultuurkamers (dynamische monsters) of de 15 ml buizen (statische monsters) met medium.

5. Koppeling van de bioreactor- en debietpompsystemen voordat met het experiment wordt begonnen

OPMERKING: Voer stap 5.1–5.3 uit in een laminaire stromingskast.

  1. Neem de lade met de stromingscultuurkamers en de vloeistofeenheden met gevulde medium reservoirs en aangesloten medium slangen in de laminaire stromingskasten.
  2. Plaats de stromingskweekkamers op de bioreactorbasis voor de experimentele groepen die zijn geladen met cyclische rek en met gecombineerde hemodynamische belastingen (figuur 1E).
    1. Kantel de stromingscultuurkamer ondersteboven en vul de drukleiding van onderaf met ultrapure water met behulp van een spuit met dunne buizen (dit kan van elk type zijn, zolang deze flexibel en dun is, in dit experiment werd een 10 cm lange draad met een binnendiameter van 0,15 mm aan de naald bevestigd).
    2. Plaats de dunne slang in de drukleiding en terwijl de drukleiding is gevuld met ultrapure water door het water geleidelijk uit de spuit te duwen, trekt u de draad tegelijkertijd uit de drukleiding om ervoor te zorgen dat er geen luchtbellen in de drukleiding zitten.
    3. Plaats de stromingscultuurkamer op een van de acht schroefdraden op de bioreactorbasis. Plaats een siliconen O-ring tussen de bioreactorbasis en de witte Luer-connector om mogelijke lekkage te voorkomen en draai de witte Luer-connector vanuit het onderste compartiment vast.
    4. Herhaal stap 5.2.2 en 5.2.3 voor alle cyclisch uitgerekt monsters.
  3. Sluit de stromingscultuurkamers voor alle experimentele groepen, met uitzondering van de statische regeling, aan op het stromingspompsysteem.
    1. Plaats een slangklem op de medium slang. Verwijder de witte Luer-dop die de stromingsinlaat van het bovenste compartiment van de stromingscultuurkamer bedekt. Verwijder de vrouwelijke Luer-koppeling van de medium slang en verbind de medium slang aan de ene kant met de stroominlaat aan de bovenkant van het compartiment en de andere kant van de medium slang met stroomuitlaat in het onderste compartiment.
    2. Herhaal stap 5.3.1 voor alle stromingscultuurkamers. Op dit punt worden de bioreactor en de stromingskweekkamers gevuld met medium en verbonden met de stroomsystemen.
    3. Plaats de monsters voor statische besturing verticaal in een celkweekkolf met filterdop met behulp van de schaarklem. Vul de celkweekkolf met medium en plaats deze in de incubator.
  4. Breng de volledige installatie over van de laminaire stromingskast naar de incubator en sluit de vloeistofeenheden aan op de luchtdrukslang en de elektrische kabel.
  5. Start de software en initialiseer de flowpompen. Start de medium flow voor de samples één voor één.
    1. Controleer of de kleppen van de vloeistofeenheid klikken.
    2. Verwijder de slangklem van de medium slang.
    3. Start de debietpomp met 100 mbar en 10 s schakeltijd.
    4. Controleer de stromingsrichting zorgvuldig op mogelijke lekkage of luchtbellen. Eventuele ingesloten luchtbellen kunnen worden verwijderd door de stromingscultuurkamer ondersteboven te draaien.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat de gemiddelde niveaus in de middelgrote reservoirs in evenwicht zijn, om te voorkomen dat er lucht in het systeem en luchtbellen in de stromingscultuurkamers wordt aangezogen en om de reservoirs niet droog te laten lopen (Figuur 2C).
    5. Herhaal stap 5.5 voor alle vloeistofeenheden één voor één.
  6. Initialiseer de stampomp.
    1. Sluit de pneumatisch bediende pomp via de luchtinlaat op de pneumatische cilinder aan op de perslucht. Sluit de onderste luchtuitlaat aan op de blauwe slang voor lucht uit (Afbeelding 1F).
    2. Open LabVIEW software, voer het LabVIEW script en persluchtdruk applicatie systeem, zoals beschreven door Van Kelle et al.68, voer verplaatsing en frequentie in (start met lage frequentie van 0,2 Hz). Pauzeer de pomp wanneer de Teflon balg op het laagste niveau is.
    3. Plaats de druksensor in de druksensorinlaat op het hydraulische reservoir.
  7. Verander de pompinstellingen in de gewenste instellingen (gebruik voor 1,5 Pa 150 mbar, 10 s schakeltijd).
  8. Start de stampomp en pas de gewenste instelling toe (bijv. 0,5 Hz, 1,05 stretch).

6. Experiment meerdere dagen uitvoeren; Bewaking van afschuiving en rek tijdens cultuur en mediumvervanging

  1. Bereken de WSS bij de steigerwand.
    1. Noteer de debietgrootte om de andere dag (zie de handleiding van de fabrikant van de debietpomp voor meer informatie). Kortom, let op de verandering in vloeistofniveaus (in ml) in de middelgrote reservoirs tussen het schakelen van het reservoir van de vloeistofeenheid gedurende 10 s. Voer ten minste vijf metingen uit, bereken de gemiddelde waarde en vermenigvuldig met 6 om het debiet Q in ml/min te krijgen.
    2. De stroom wordt beschreven door een Poiseuille-stroom door een ringvormig kanaal. Uitgaande van cultuurmedium als newtoniaanse vloeistof, bereken de WSS bij de steigerwand, r1, door vergelijking 1.
      figure-protocol-1 (1)
      waarbij de WSS τw bij de steigerwand (r1; hier r1 = 1,7 mm), als gevolg van een steady state flow, wordt bepaald door de uitgeoefende druk p en de binnenradius van de glazen buis r2 (hier r2 = 2,3 mm). De drukgradiënt in de axiale richting wordt verondersteld uniform te zijn tussen de stroominlaat en de stroomuitlaat en wordt gegeven door vergelijking 2 (figuur 1J).
      figure-protocol-2 (2)
      met μ de dynamische viscositeit (hier werd de gemiddelde viscositeit verondersteld constant, μ = 0,7 × 10-3 Pa∙s bij 37 °C) en Q het toegepaste debiet.
  2. Controleer de rek die om de dag op de steigers wordt aangebracht.
    1. Plaats een donkere achtergrond achter de stromingscultuurkamer om het contrast tussen de steiger en de achtergrond te vergroten. Plaats de LED-lichtlampen, wijzend naar de steiger, om de visualisatie van de steiger te helpen.
    2. Maak timelapsefoto's van de steiger met een frequentie van 30 Hz gedurende 6 s (d.w.z. 3 stretchcycli) met een hogesnelheidscamera.
      OPMERKING: Een lagere opnamefrequentie kan voldoende zijn als de camera het toelaat. De minimaal vereiste frequentie werd echter niet bepaald.
    3. Bepaal handmatig de minimale en maximale diameter van de steiger op de afbeeldingen.
    4. Bereken de minimale en maximale buitendiameter van de elektrospun steiger om de maximale rek te berekenen volgens vergelijking 3.
      figure-protocol-3 (3)
      wanneer de omtrek (λθ) wordt gegeven door de verhouding tussen de buitendiameter van de steiger, d1, en de begindiameter, d0.
  3. Corrigeer voor gemiddelde verdamping en ververs medium drie keer per week.
    1. Stop en ontkoppel de kabels voor de stromingssystemen en de stampomp.
    2. Plaats slangklemmen op de medium slang.
    3. Bepaal hoeveel medium verdampt op basis van de volume-indicatormarkeringen op de medium reservoirs.
    4. Breng de lade met de bioreactor en de vloeistofeenheden over in de laminaire stromingskast.
    5. Verwijder de rubberen luchtfilters van de medium reservoirs; voeg autoclaaf ultrapure water toe om het verdampte volume medium te compenseren. Sluit de medium reservoirs opnieuw en sluit opnieuw aan op de pomp om het medium te mengen met het ultrapure water.
    6. Herhaal stap 6.3.1–6.3.5. Verwijder de rubberen luchtfilters opnieuw, haal 25 ml kweekmedium eruit en draai 5 minuten naar beneden bij RT op 300 × g.
      1. Verzamel 1,5 ml supernatant en bewaar bij -30 °C voor analyse van secretoire profielen (voor analyse met enzymgekoppelde immunosorbenttest (ELISA)).
      2. Verzamel het gewenste volume supernatant voor paracrinesignaleringsstudies, door het supernatant te gebruiken als geconditioneerd medium43.
    7. Voeg 25 ml vers medium toe aan de middelgrote reservoirs.
    8. Plaats rubberen luchtfilters terug op de medium reservoirs.
    9. Plaats de volledige installatie terug in de incubator; sluit alle kabels en luchtslangen aan op de pomp en de stampomp. Laat de slangklemmen los en herhaal de stappen 5.4–5.8.
  4. Controleer of silicadroogparels in de droogflessen die op de pomp zijn aangesloten vochtig zijn (wit uiterlijk) en vervang indien nodig door droge silicaparels (oranje uiterlijk).

7. Experiment, monsterverzameling en reiniging en opslag van apparatuur beëindigen

  1. Corrigeer op de laatste dag van het experiment voor gemiddelde verdamping zoals beschreven in stap 6.3.1–6.3.5 en oogst de monsters één voor één.
    1. Om de monsters één voor één te oogsten, moeten de stromingspomp en de stampomp meerdere keren worden gepauzeerd. Plaats een slangklem op middelzware slangen. Stop tijdelijk de debietpomp en de spanningspomp. Koppel één stromingscultuurkamer los van de bioreactorbasis; vervangen door een witte Luer dop op de bioreactorbasis. Breng de stromingscultuurkamer en de vloeistofeenheid naar de laminaire stromingskast. Start de debietpomp en de stampomp opnieuw om de hemodynamische belasting op de andere monsters toe te passen tot het oogsten.
    2. Verzamel medium uit de medium reservoirs voor paracrine cytokine productie analyse via ELISA.
  2. Ontkoppel stroomeenheden en oogst buisvormige constructie. Sectie volgens het gewenste snijschema. Delen van de constructie kunnen worden bewaard bij 4 °C (na 15 minuten fixatie in 3,7% formaldehyde en 3 x 5 minuten wassen in PBS) of -30 °C (na snap-freezing in vloeibare stikstof) tot verdere analyse.
  3. Reinig de bioreactor en pompcomponenten. Bovendien wordt de geadviseerde reinigingsmethode per item vermeld in de tabel met materialen.
    1. Reinig de rubberen luchtfilters met 70% ethanol. Pas op dat u het binnenfilter niet bevochtigt!
    2. Verzamel alle afzonderlijke componenten: medium buizen, middelgrote reservoirs, glazen buizen, mannelijke Luer-pluggen en vrouwelijke Luer-sloten, witte Luer-doppen, drukleidingen, neuskegels, siliconen O-ringen, adapterbusjes, flow straighteners (exclusief pompen, vloeistofeenheden, rubberen luchtfilters, de bioreactorbasis) en spoel af in stromend leidingwater.
    3. Plaats O/N in 0,1% natriumdodecylsulfaat in gedeioneerd water.
      OPMERKING: Gebruik geen ultrapure water, omdat de onderdelen kunnen roesten.
    4. Afspoelen met kraanwater en afwaszeep.
    5. Dompel onder in gedeioneerd water, gevolgd door 70% ethanol twee keer, gevolgd door gedeioneerd water.
    6. Leg alle materialen apart op papieren zakdoekjes en laat ze drogen. Gebruik lucht onder druk om slangen te drogen.
    7. Reinig alle niet-autoclaveerbare materialen met een papierweefsel gedrenkt in 70% ethanol. Dit omvat het rubberen luchtfilter (houd er rekening mee dat het luchtfilter droog moet blijven) en de bioreactorbasis (Teflon balg en pneumatische cilinder).
    8. Autoclaaf de componenten van de vloeistofkamer (inclusief de siliconen O-ring), de medium slang, de medium reservoirs (zonder het rubberen luchtfilter), mannelijke Luer-pluggen en vrouwelijke Luer-koppelingen, witte Luer-doppen, slangklemmen en standaarduitrusting (bijv. pincet, klemschaar)
    9. Voor handig gebruik tijdens de volgende experimenten, combineert u de afzonderlijke componenten voor één complete vloeistofkamer in een autoclaveerbare doos.
  4. Verwijder water uit het hydraulische reservoir. Reinig met 70% ethanol, gevolgd door gedeioneerd water. Laat het drogen. Vul bij met gedeioneerd water en een paar druppels water-bad-conserverend ontsmettingsmiddel.
  5. Bewaar de glazen buizen voor de stromingskweekkamer in 70% ethanol.
  6. Plaats de vochtige silicadroogparels (wit uiterlijk) op 120 °C in de oven O/N om ze te laten drogen (oranje uiterlijk) en bewaar ze in een luchtdichte kolf.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze bioreactor is ontwikkeld om de individuele en gecombineerde effecten van afschuifspanning en cyclische rek op vasculaire weefselgroei en remodellering in 3D-biomateriaalsteigers te bestuderen. Het ontwerp van de bioreactor maakt het mogelijk om tot acht vasculaire constructies onder verschillende belastingsomstandigheden te cultiveren (figuur 1A). De vasculaire constructies bevinden zich in een stromingscultuurkamer (figuur 1B) waarin zowel de omtrek als WS...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De hierin beschreven bioreactor maakt een systematische evaluatie mogelijk van de bijdragen van de individuele en gecombineerde effecten van schuifspanning en cyclische rek op ontsteking en weefselregeneratie in buisvormige resorbeerbare steigers. Deze aanpak maakt het ook mogelijk om een grote verscheidenheid aan analyses uit te voeren op vasculaire constructies, zoals geïllustreerd in de sectie representatieve resultaten. Deze resultaten tonen de onderscheidende impact van de verschillende hemodynamische belastingsregi...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets bekend te maken.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie wordt financieel ondersteund door ZonMw in het kader van het LSH 2Treat programma (436001003) en de Nierstichting (14a2d507). N.A.K. erkent de steun van de Europese Onderzoeksraad (851960). Wij erkennen met dank het Gravitatieprogramma "Materials Driven Regeneration", gefinancierd door de Nederlandse Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (024.003.013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
advanced Dulbecco’s modified EagleMedium (aDMEM)Gibco12491-015celcultuur medium voor fibroblasten
Aqua StabilJulabo8940012voorkomen groei van micro-organismen in bioreactor-hydraulisch reservoir
Bovine fibrinogeenSigmaF8630om fibrinogeen gel voor te bereiden om de cellen op het geëlektrospunnen scaffold te zaaien
Bovine trombineSigmaT4648om fibrinogeen gel voor te bereiden om de cellen op het geëlektrospunnen scaffold te zaaien
CentrifugeEppendorf5804om cellen en geconditioneerd medium te centrifugeren
Klem schaar - "kelly forceps"AlmedicP-422klem de siliconen slang vast en breng voorrekking toe op het scaffold zodat het scaffold in de uitgegraven groef kan worden genaaid (stappen 1 en 7 autoclaveren)
CO2 celcultuur incubatorenSanyoMCO-170AIC-PEvoor celcultuur
Gedrukte lucht reservoirFestoCRVZS-5luchtdrukfluctuaties gladstrijken en tijdvertragingen creëren voor drukbouw
Aangepast Matlab script om de maximale rekking te berekenenMatlabR2017. The Mathworks, Natick, MAbereken de minimale en maximale buitendiameter van het geëlektrospunnen scaffold
Data-acquisitiekaartNational InstrumentsBNC-2090gegevensverwerking tussen versterkersysteem en computer
EthanolVWRVWRK4096-9005om steriele werkcondities te behouden
Fetaal bovien kalfs serum (FBS)Greiner758087celcultuur medium supplement; serum-supplement
Flow cultuur kamer compartimenten, bestaande uit een drukconduit met uitgegraven groeven en kleine gaatjes om druk op de siliconen slang uit te oefenen, een schroefdraad, neuskogel, bovenste compartiment met stromingsinlaat en onderste compartiment stromingsuitlaat, adapterhulsOp maat gemaakt, Afdeling Biomedische Technologie, Technische Universiteit Eindhovenn.a.flow cultuur kamer compartimenten (stappen 1 en 7 autoclaveren)
Glas Pasteur pipetAssistantHE40567002vacuüm toepassen op geëlektrospunnen scaffold (stap 1 autoclaveren)
Glasbuizen van de flow cultuur kamerOp maat gemaakt, Equipment & Prototype Center, Technische Universiteit Eindhovenn.a.onderdeel van de flow cultuur kamer (schoonmaken en opslaan in 70% ethanol, bij stappen 1 en 7)
GlutaMaxGibco35050061celcultuur medium aminozuur supplement, minimaliseert ammoniak opbouw
Hoge snelheidscameraMotionScopeM-5om de rekking tijdens de cultuur te bewaken; time-lapse foto's van de scaffolds worden gemaakt met een frequentie van 30 Hz gedurende 6 sec (dwz 3 rekkingscycli)
Hoge snelheidscamera lens - Micro-NIKKOR 55mm f/2.8 - lensNikonJAA616ABom de rekking tijdens de cultuur te bewaken; time-lapse foto's van de scaffolds worden gemaakt met een frequentie van 30 Hz gedurende 6 sec (dwz 3 rekkingscycli)
Slangklemibidi GmbH10821mediumstroom blokkeren (stappen 1 en 7 autoclaveren)
Hydraulisch reservoir met 8 schroefdraden voor 8 flow cultuur kamersOp maat gemaakt, Afdeling Biomedische Technologie, Technische Universiteit Eindhovenn.a.om druk uit te oefenen op de siliconen gemonteerde constructies (buitenkant schoonmaken met een papieren tissue met 70% ethanol, reservoir spoelen met 70% ethanol gevolgd door demi water, bij stappen 1 en 7)
Ibidi pomp systeem (8x) inclusief ibidi pomp, PumpControl software, vloeistofunit, perfusie set (medium slang), luchtdrukslang, drooggemaakte flessen met oranje silica korrelsibidi GmbH10902set up gebruikt om de stroom in de flow cultuur kamers te regelen. Opmerking 1: de ibidi pompen zijn door de fabrikant gewijzigd om een capaciteit van 200 mbar mogelijk te maken. Opmerking 2: kan worden vervangen door een pompsysteem van een andere fabrikant, zolang dezelfde stromingsregimes kunnen worden toegepast.
Messen (nr.10 steriele bladen, individueel verpakt) en scalpel handvat (roestvrij staal, individueel verpakt)Swann Morton0301; 0933om de siliconen slang in de juiste maat voor het scaffold te snijden en om het naaimateriaal te snijden
LabVIEW SoftwareNational Instrumentsversie 2018om de rekking op de scaffolds te regelen
Laminaire stroming bioveiligheidskast met UV-lichtLabconco302310001om steriele werkcondities te garanderen. De UV wordt gebruikt om alles te decontamineren dat niet gesteriliseerd kan worden, of dat na het steriliseren niet mag worden aangeraakt
Grote en kleine petrischalenGreiner664-160voor steriele werkcondities
L-ascorbinezuur 2-fosfaat (vitamine C)SigmaA8960celcultuur medium supplement, belangrijk voor collageenproductie
LED licht koude bron KL2500ZeissSchott AGom te helpen bij de visualisatie van de time lapse van de scaffolds tijdens het bewaken van de rekking
Luer (vrouwelijk en mannelijk) sloten en connectoren, witte luer doppenibidi GmbHdiverse, zie (https://ibidi.com/26-flow-accessories)om delen van de bioreactor en de ibidi pomp te sluiten of te verbinden (stappen 1 en 7 autoclaveren)
Meetversterker (PICAS)PEEKEL instruments B.V.n.a.om het signaal van de druksensor te versterken en terugkoppelen naar LabView
Medium reservoir (grote spuiten 60 mL) en reservoirhoudersibidi GmbH10974medium reservoir (stappen 1 en 7 autoclaveren)
Medium slang met 4,25 mm buitendiameter en 1 mm binnendiameterRubber BV1805om een hogere stroomsnelheid mogelijk te maken, wordt de ibidi medium slang met grotere diameter gebruikt. Opmerking: het deel van

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chlupác, J., Filová, E., Bacáková, L. Blood vessel replacement: 50 years of development and tissue engineering paradigms in vascular surgery. Physiological Research. 58, Suppl 2 119-139 (2009).
  2. Huygens, S. A., et al. Bioprosthetic aortic valve replacement in elderly patients: Meta-analysis and microsimulation. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 157 (6), 2189-2197 (2019).
  3. Huygens, S. A., et al. Contemporary outcomes after surgical aortic valve replacement with bioprostheses and allografts: a systematic review and meta-analysis. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 50 (4), 605-616 (2016).
  4. Loh, S. A., et al. Mid- and long-term results of the treatment of infrainguinal arterial occlusive disease with precuffed expanded polytetrafluoroethylene grafts compared with vein grafts. Annals of Vascular Surgery. 27 (2), 208-217 (2013).
  5. Tara, S., et al. Vessel bioengineering. Circulation Journal. 78 (1), 12-19 (2014).
  6. Huang, A. H., Niklason, L. E. Engineering of arteries in vitro. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (11), 2103-2118 (2014).
  7. Bouten, C. V. C., Smits, A. I. P. M., Baaijens, F. P. T. Can we grow valves inside the heart? Perspective on material-based in situ heart valve tissue engineering. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 5, 54(2018).
  8. Fioretta, E. S., et al. Next-generation tissue-engineered heart valves with repair, remodelling and regeneration capacity. Nature Reviews Cardiology. , (2020).
  9. Kirkton, R. D., et al. Bioengineered human acellular vessels recellularize and evolve into living blood vessels after human implantation. Science Translational Medicine. 11 (485), (2019).
  10. Gutowski, P., et al. Arterial reconstruction with human bioengineered acellular blood vessels in patients with peripheral arterial disease. Journal of Vascular Surgery. , (2020).
  11. Syedain, Z., et al. Tissue engineering of acellular vascular grafts capable of somatic growth in young lambs. Nature Communications. 7 (12951), 12951(2016).
  12. Sugiura, T., et al. Tissue-engineered vascular grafts in children with congenital heart disease: intermediate term follow-up. Seminars in Thoracic and Cardiovascular Surgery. 30 (2), 175-179 (2018).
  13. Kluin, J., et al. In situ heart valve tissue engineering using a bioresorbable elastomeric implant - material design to 12 months follow-up in sheep. Biomaterials. 125, 101-117 (2017).
  14. Fioretta, E. S., et al. Differential leaflet remodeling of bone marrow cell pre-seeded versus nonseeded bioresorbable transcatheter pulmonary valve replacements. JACC. Basic to Translational Science. 5 (1), 15-31 (2020).
  15. Van Haaften, E. E., Bouten, C. V. C., Kurniawan, N. A. Vascular mechanobiology: towards control of. Cells. , 1-24 (2017).
  16. De Jonge, N., et al. Matrix production and organization by endothelial colony forming cells in mechanically strained engineered tissue constructs. PLoS ONE. 8 (9), 73161(2013).
  17. Schmidt, J. B., Chen, K., Tranquillo, R. T. Effects of intermittent and incremental cyclic stretch on ERK signaling and collagen production in engineered tissue. Cellular and Molecular Bioengineering. 9 (1), 55-64 (2016).
  18. Luo, J., et al. Tissue-engineered vascular grafts with advanced mechanical strength from human iPSCs. Cell Stem Cell. 26 (2), 251-261 (2020).
  19. Van Haaften, E. E., et al. Decoupling the effect of shear stress and stretch on tissue growth and remodeling in a vascular graft. Tissue Engineering Part C: Methods. 24 (7), 418-429 (2018).
  20. Gupta, V., Tseng, H., Lawrence, B. D., Jane Grande-Allen, K. Effect of cyclic mechanical strain on glycosaminoglycan and proteoglycan synthesis by heart valve cells. Acta Biomaterialia. 5 (2), 531-540 (2009).
  21. Lin, S., Mequanint, K. Bioreactor-induced mesenchymal progenitor cell differentiation and elastic fiber assembly in engineered vascular tissues. Acta Biomaterialia. 59, 200-209 (2017).
  22. Venkataraman, L., Bashur, C. A., Ramamurthi, A. Impact of cyclic stretch on induced elastogenesis within collagenous conduits. Tissue Engineering. Part A. 20 (9-10), 1403-1415 (2014).
  23. Huang, A. H., et al. Biaxial stretch improves elastic fiber maturation, collagen arrangement, and mechanical properties in engineered arteries. Tissue Engineering Part C Methods. 22 (6), 524-533 (2016).
  24. Hinderer, S., et al. In vitro elastogenesis: instructing human vascular smooth muscle cells to generate an elastic fiber-containing extracellular matrix scaffold. Biomedical Materials. 10 (3), 034102(2015).
  25. Eoh, J. H., et al. Enhanced elastin synthesis and maturation in human vascular smooth muscle tissue derived from induced-pluripotent stem cells. Acta Biomaterialia. 52, 49-59 (2017).
  26. Smits, A. I. P. M., Bouten, C. V. C. Tissue engineering meets immunoengineering: Prospective on personalized in situ tissue engineering strategies. Current Opinion in Biomedical Engineering. 6, 17-26 (2018).
  27. Wissing, T. B., Bonito, V., Bouten, C. V. C., Smits, A. I. P. M. Biomaterial-driven in situ cardiovascular tissue engineering-a multi-disciplinary perspective. npj Regenerative Medicine. 2 (1), 18(2017).
  28. Hibino, N., et al. A critical role for macrophages in neovessel formation and the development of stenosis in tissue-engineered vascular grafts. The FASEB Journal. 25 (12), 4253-4263 (2011).
  29. Godwin, J. W., Pinto, A. R., Rosenthal, N. A. Macrophages are required for adult salamander limb regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (23), 9415-9420 (2013).
  30. Godwin, J. W., Debuque, R., Salimova, E., Rosenthal, N. A. Heart regeneration in the salamander relies on macrophage-mediated control of fibroblast activation and the extracellular landscape. npj Regenerative Medicine. 2 (1), 22(2017).
  31. McBane, J. E., Cai, K., Labow, R. S., Santerre, J. P. Co-culturing monocytes with smooth muscle cells improves cell distribution within a degradable polyurethane scaffold and reduces inflammatory cytokines. Acta Biomaterialia. 8 (2), 488-501 (2012).
  32. Battiston, K. G., Ouyang, B., Labow, R. S., Simmons, C. A., Santerre, J. P. Monocyte/macrophage cytokine activity regulates vascular smooth muscle cell function within a degradable polyurethane scaffold. Acta Biomaterialia. 10 (3), 1146-1155 (2014).
  33. Ploeger, D. T., et al. Cell plasticity in wound healing: paracrine factors of M1/ M2 polarized macrophages influence the phenotypical state of dermal fibroblasts. Cell Communication and Signaling. 11 (1), 29(2013).
  34. McBane, J. E., Santerre, J. P., Labow, R. S. The interaction between hydrolytic and oxidative pathways in macrophage-mediated polyurethane degradation. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 82 (4), 984-994 (2007).
  35. Wissing, T. B., et al. Macrophage-driven biomaterial degradation depends on scaffold microarchitecture. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 87(2019).
  36. Wolf, M. T., Vodovotz, Y., Tottey, S., Brown, B. N., Badylak, S. F. Predicting in vivo responses to biomaterials via combined in vitro and in silico analysis. Tissue Engineering Part C: Methods. 21 (2), 148-159 (2015).
  37. Grotenhuis, N., Bayon, Y., Lange, J. F., Van Osch, G. J. V. M., Bastiaansen-Jenniskens, Y. M. A culture model to analyze the acute biomaterial-dependent reaction of human primary macrophages. Biochemical and Biophysical Research Communications. 433 (1), 115-120 (2013).
  38. Jannasch, M., et al. A comparative multi-parametric in vitro model identifies the power of test conditions to predict the fibrotic tendency of a biomaterial. Scientific Reports. 7 (1), 1689(2017).
  39. Wang, Z., et al. The effect of thick fibers and large pores of electrospun poly(ε-caprolactone) vascular grafts on macrophage polarization and arterial regeneration. Biomaterials. 35 (22), 5700-5710 (2014).
  40. McWhorter, F. Y., Davis, C. T., Liu, W. F. Physical and mechanical regulation of macrophage phenotype and function. Cellular and Molecular Life Sciences. 72 (7), 1303-1316 (2014).
  41. Ballotta, V., Driessen-Mol, A., Bouten, C. V. C., Baaijens, F. P. T. Strain-dependent modulation of macrophage polarization within scaffolds. Biomaterials. 35 (18), 4919-4928 (2014).
  42. Dziki, J. L., et al. The effect of mechanical loading upon extracellular matrix bioscaffold-mediated skeletal muscle remodeling. Tissue Engineering. Part A. 24 (1-2), 34-46 (2018).
  43. Wissing, T. B., et al. Hemodynamic loads distinctively impact the secretory profile of biomaterial-activated macrophages - implications for in situ vascular tissue engineering. Biomaterials Science. 8 (1), 132-147 (2020).
  44. Van Haaften, E. E., Wissing, T. B., Kurniawan, N. A., Smits, A. I. P. M., Bouten, C. V. C. Human in vitro model mimicking material-driven vascular regeneration reveals how cyclic stretch and shear stress differentially modulate inflammation and matrix deposition. Advanced Biosystems. 4 (6), 1900249(2020).
  45. Ballotta, V., Smits, A. I. P. M., Driessen-Mol, A., Bouten, C. V. C., Baaijens, F. P. T. Synergistic protein secretion by mesenchymal stromal cells seeded in 3D scaffolds and circulating leukocytes in physiological flow. Biomaterials. 35 (33), 9100-9113 (2014).
  46. Bonito, V., de Kort, B. J., Bouten, C. V. C., Smits, A. I. P. M. Cyclic strain affects macrophage cytokine secretion and extracellular matrix turnover in electrospun scaffolds. Tissue Engineering Part A. 25 (17-18), 1310-1325 (2019).
  47. Battiston, K. G., Labow, R. S., Simmons, C. A., Santerre, J. P. Immunomodulatory polymeric scaffold enhances extracellular matrix production in cell co-cultures under dynamic mechanical stimulation. Acta Biomaterialia. 24, 74-86 (2015).
  48. Smits, A. I. P. M., Driessen-Mol, A., Bouten, C. V. C., Baaijens, F. P. T. A mesofluidics-based test platform for systematic development of scaffolds for in situ cardiovascular tissue engineering. Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (6), 475-485 (2012).
  49. Smits, A. I. P. M., Ballotta, V., Driessen-Mol, A., Bouten, C. V. C., Baaijens, F. P. T. T. Shear flow affects selective monocyte recruitment into MCP-1-loaded scaffolds. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 18 (11), 2176-2188 (2014).
  50. Ballotta, V., Smits, A. I. P. M., Driessen-Mol, A., Bouten, C. V. C., Baaijens, F. P. T. Synergistic protein secretion by mesenchymal stromal cells seeded in 3D scaffolds and circulating leukocytes in physiological flow. Biomaterials. 35 (33), 9100-9113 (2014).
  51. Fahy, N., Menzel, U., Alini, M., Stoddart, M. J. Shear and dynamic compression modulates the inflammatory phenotype of human monocytes in vitro. Frontiers in Immunology. 10, 383(2019).
  52. Pennings, I., et al. Layer-specific cell differentiation in bi-layered vascular grafts under flow perfusion. Biofabrication. 12 (1), 015009(2019).
  53. Wang, J., et al. Ex vivo blood vessel bioreactor for analysis of the biodegradation of magnesium stent models with and without vessel wall integration. Acta Biomater. 50, 546-555 (2017).
  54. Huang, A. H., et al. Design and use of a novel bioreactor for regeneration of biaxially stretched tissue-engineered vessels. Tissue Engineering. Part C, Methods. 21 (8), 841-851 (2015).
  55. Huang, A. H., Niklason, L. E. Engineering biological-based vascular grafts using a pulsatile bioreactor. Journal of Visualized Experiments. (52), e2646(2011).
  56. Bono, N., et al. A Dual-mode bioreactor system for tissue engineered vascular models. Annals of Biomedical Engineering. 45 (6), 1496-1510 (2017).
  57. Wolf, F., et al. VascuTrainer: a mobile and disposable bioreactor system for the conditioning of tissue-engineered vascular grafts. Annals of Biomedical Engineering. 46 (4), 616-626 (2018).
  58. Ramaswamy, S., et al. A novel bioreactor for mechanobiological studies of engineered heart valve tissue formation under pulmonary arterial physiological flow conditions. Journal of Biomechanical Engineering. 136 (12), 121009(2014).
  59. Piola, M., et al. A compact and automated ex vivo vessel culture system for the pulsatile pressure conditioning of human saphenous veins. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 10 (3), 204-215 (2016).
  60. Vanerio, N., Stijnen, M., de Mol, B. A. J. M., Kock, L. M. An innovative ex vivo vascular bioreactor as comprehensive tool to study the behavior of native blood vessels under physiologically relevant conditions. Journal of Engineering and Science in Medical Diagnostics and Therapy. 2 (4), (2019).
  61. Kural, M. H., Dai, G., Niklason, L. E., Gui, L. An ex vivo vessel injury model to study remodeling. Cell Transplantation. 27 (9), 1375-1389 (2018).
  62. Sinha, R., et al. A medium throughput device to study the effects of combinations of surface strains and fluid-flow shear stresses on cells. Lab on a Chip. 15 (2), 429-439 (2015).
  63. Beca, B. M., Sun, Y., Wong, E., Moraes, C., Simmons, C. A. Dynamic bioreactors with integrated microfabricated devices for mechanobiological screening. Tissue Engineering Part C: Methods. 25 (10), 581-592 (2019).
  64. Liu, H., Usprech, J., Sun, Y., Simmons, C. A. A microfabricated platform with hydrogel arrays for 3D mechanical stimulation of cells. Acta Biomaterialia. 34, 113-124 (2016).
  65. Szafron, J. M., Ramachandra, A. B., Breuer, C. K., Marsden, A. L., Humphrey, J. D. Optimization of tissue-engineered vascular graft design using computational modeling. Tissue Engineering Part C: Methods. 25 (10), 561-570 (2019).
  66. Emmert, M. Y., et al. Computational modeling guides tissue-engineered heart valve design for long-term in vivo performance in a translational sheep model. Science Translational Medicine. 10 (440), (2018).
  67. Mol, A., et al. Fibrin as a cell carrier in cardiovascular tissue engineering applications. Biomaterials. 26 (16), 3113-3121 (2005).
  68. van Kelle, M. A. J., et al. A Bioreactor to identify the driving mechanical stimuli of tissue growth and remodeling. Tissue Engineering Part C: Methods. 23 (6), (2017).
  69. van den Broek, C. N., et al. Medium with blood-analog mechanical properties for cardiovascular tissue culturing. Biorheology. 45 (6), 651-661 (2008).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Afschuifspanningcyclische rekweefseltechnologische vasculaire graftshumane macrofagenmyofibroblastenflow kweekkamerdepositie van collageen type 1cytokinesecretieprofielalfa glad spieractine

Gerelateerde artikelen