Dit protocol beschrijft tubulinezuivering uit kleine/middelgrote bronnen zoals gekweekte cellen of enkele muizenhersenen, met behulp van polymerisatie- en depolymerisatiecycli. De gezuiverde tubuline is verrijkt in specifieke isotypes of heeft specifieke posttranslationele modificaties en kan worden gebruikt in in vitro reconstitutietesten om microtubulidynamiek en interacties te bestuderen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Zuivering van tubuline met gecontroleerde posttranslationele modificaties en isotypes uit beperkte bronnen door polymerisatie-depolymerisatiecycli
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Een belangrijk aspect van studies van het microtubulicytoskelet is het onderzoek naar microtubuligedrag in in vitro reconstitutie-experimenten. Ze maken de analyse mogelijk van de intrinsieke eigenschappen van microtubuli, zoals dynamiek, en hun interacties met microtubuli-geassocieerde eiwitten (MAPs). De "tubulinecode" is een opkomend concept dat wijst op verschillende tubuline-isotypes en verschillende posttranslationele modificaties (PTM's) als regulatoren van microtubuli-eigenschappen en -functies. Om de moleculaire mechanismen van de tubulinecode te onderzoeken, is het cruciaal om in vitro reconstitutie-experimenten uit te voeren met gezuiverde tubuline met specifieke isotypes en PTM's.
Tot op heden was dit technisch uitdagend omdat hersentubulin, dat veel wordt gebruikt in in vitro experimenten, veel PTM's herbergt en een gedefinieerde isotypesamenstelling heeft. Daarom ontwikkelden we dit protocol om tubuline te zuiveren uit verschillende bronnen en met verschillende isotypesamenstellingen en gecontroleerde PTM's, met behulp van de klassieke benadering van polymerisatie- en depolymerisatiecycli. In vergelijking met bestaande methoden op basis van affiniteitszuivering levert deze aanpak zuivere, polymerisatie-competente tubuline op, omdat tubuline die bestand is tegen polymerisatie of depolymerisatie tijdens de opeenvolgende zuiveringsstappen wordt weggegooid.
We beschrijven de zuivering van tubuline uit cellijnen, gekweekt in suspensie of als aanhangculturen, en uit enkele muizenhersenen. De methode beschrijft eerst de generatie van celmassa in zowel suspensie- als aanhanginstellingen, de lysisstap, gevolgd door de opeenvolgende stadia van tubulinezuivering door polymerisatie-depolymerisatiecycli. Onze methode levert tubuline op dat kan worden gebruikt in experimenten die de impact van de tubulinecode op de intrinsieke eigenschappen van microtubuli en microtubuliinteracties met bijbehorende eiwitten aanpakken.
Inleiding
Microtubuli spelen een cruciale rol in veel cellulaire processen. Ze geven cellen hun vorm, bouwen meiotische en mitotische spindels voor chromosoomsegregatie en dienen als sporen voor intracellulair transport. Om deze diverse functies uit te voeren, organiseren microtubuli zich op verschillende manieren. Een van de intrigerende vragen in het veld is om de moleculaire mechanismen te begrijpen die de structureel en evolutionair geconserveerde microtubuli in staat stellen zich aan te passen aan deze overvloed aan organisaties en functies. Een potentieel mechanisme is de diversificatie van microtubuli , die wordt gedefinieerd door het concept dat bekend staat als de "tub....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De verzorging en het gebruik van dieren voor dit onderzoek zijn uitgevoerd in overeenstemming met de aanbevelingen van de Europese Gemeenschap (2010/63/UE). Experimentele procedures werden specifiek goedgekeurd door de ethische commissie van het Institut Curie CEEA-IC #118 (autorisatienr. 04395.03 gegeven door de Nationale Autoriteit) in overeenstemming met de internationale richtlijnen.
1. Bereiding van reagentia voor tubulinezuivering
OPMERKING: Alle buffers die worden gebruikt voor tubulinezuivering moeten kaliumzouten bevatten en GEEN natriumzouten30.
- Bereid 1 L volledig medi....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Het belangrijkste doel van deze methode is om hoogwaardige, assemblage-competente tubuline te produceren in hoeveelheden die voldoende zijn om herhaalde in vitro experimenten met de gezuiverde componenten uit te voeren. Microtubuli die uit deze tubuline worden geassembleerd, kunnen worden gebruikt bij reconstitutietests op basis van de totale interne reflectiefluorescentie (TIRF) microscopietechniek met dynamische of stabiele microtubuli, in experimenten waarbij microtubulidynamiek, interacties met MAPs of moleculaire mo.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De hier beschreven methode biedt een platform om snel hoogwaardige, assemblage-competente tubuline in middelgrote hoeveelheden te genereren uit cellijnen en enkele muizenhersenen. Het is gebaseerd op het gouden-standaardprotocol van tubulinezuivering van runderhersenen die vele jaren in het veld worden gebruikt16,17. Een bijzonder voordeel van de aanpak is het gebruik van suspensieculturen van HeLa S3-cellen, die, eenmaal vastgesteld, grote hoeveelheden cellen op.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets bekend te maken.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door de ANR-10-IDEX-0001-02, de LabEx Cell'n'Scale ANR-11-LBX-0038 en het Institut de convergence Q-life ANR-17-CONV-0005. CJ wordt ondersteund door het Institut Curie, het Franse National Research Agency (ANR) kent ANR-12-BSV2-0007 en ANR-17-CE13-0021 toe, het Institut National du Cancer (INCA) subsidie 2014-PL BIO-11-ICR-1, en de Fondation pour la Recherche Medicale (FRM) subsidie DEQ20170336. MMM wordt ondersteund door de Fondation Vaincre Alzheimer grant FR-16055p, en door de France Alzheimer grant AAP SM 2019 n°2023. JAS werd ondersteund door het horizon 2020-onderzoek- en innovatieprogramma van de Europese Unie in het kader van de Marie....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 1 M MgCl2 | Sigma | #M1028 | |
| 1-L cell culture vessels | Techne F7610 | Gebruikt voor spinnerculturen. Roer de lege spinnerflessen nooit. Wanneer de spinnerflessen in de cell culture incubator staan, houd de laterale kleppen van de spinnerflessen altijd lichtjes open om de gelijkwaardigheid van het medium met de atmosfeer van de incubator te vergemakkelijken. Vul de spinnerflessen na gebruik onmiddellijk met kraanwater om te voorkomen dat resterende cellen op de fleswanden uitdrogen. Was de flessen met gedeïoniseerd water, voeg ongeveer 200 ml gedeïoniseerd water toe en autoclaveer. Verwijder onder een steriele cell culture hood het water en laat de flessen volledig drogen, nog steeds onder de hood, gedurende enkele uren. Gebruik nooit detergenten voor het schoonmaken van de spinnerflessen omdat sporen van het detergent schadelijk kunnen zijn voor de cellen. | |
| 1.5- en 2-ml buisjes | |||
| 14-ml ronde bodem buisjes | |||
| 15-cm-diameter steriele kweekschotels | |||
| 15-ml schroefdopbuisjes | |||
| 2-mercaptoethanol | Sigma | #M3148 | 2-mercaptoethanol is giftig en moet onder de hood worden gebruikt. |
| 4-(2-aminoethyl)-benzeensulfonylfluoride | Sigma | #A8456 | |
| 40% Acrylamide | Bio-Rad | #161-0140 | |
| 5-, 10- 20-ml spuiten | |||
| 5-ml, 10-ml, 25-ml steriele pipetten | |||
| 50-ml schroefdopbuisjes | |||
| Ammoniumpersulfaat (APS) | Sigma | #A3678 | |
| Anti-alpha-tubuline antilichaam, 12G10 | Ontwikkeld door J. Frankel en M. Nelson, verkregen van de Developmental Studies Hybridoma Bank, ontwikkeld onder auspiciën van de NICHD, en onderhouden door de Universiteit van Iowa | dilutie: 1/500 | |
| Anti-glutamyleerde tubuline antilichaam, GT335 | AdipoGen | #AG-20B-0020 | dilutie: 1/20.000 |
| Aprotinine | Sigma | #A1153 | |
| Balans (0,1 & ndash; 10 g) | |||
| Beckman 1-l polypropyleen flessen | Voor het verzamelen van spinnerculturen | ||
| Beckman Avanti J-26 XP centrifuge | Voor het verzamelen van spinnerculturen | ||
| Biologische roerder | Techne MCS-104L | Geïnstalleerd in de cell culture incubator (voor spinnerculturen), 25 rpm voor Hela S3 en HEK 293 cellen | |
| Bis N,N’-Methyleen-Bis-Acrylamide | Bio-Rad | #161-0201 | |
| Blender IKA Ultra-Turrax® | Voor het lyseren van hersenweefsel, gebruik een 5-mm sonde, met de machine ingesteld op vermogen 6 of 7. Mix het hersenweefsel 2-3 keer gedurende 15 s op ijs. | ||
| Rund serum albumine (BSA) | Sigma | #A7906 | |
| Broomfenolblauw | Sigma | #1.08122 | |
| Carboxypeptidase A (CPA) | Sigma | #C9268 | Concentratie: 1,7 U/µl |
| Cell culture hood | |||
| Cell culture incubator ingesteld op 37°C, 5% CO2 | |||
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma | #D8418 | DMSO kan de permeabiliteit van cellen en huid verbeteren voor andere verbindingen. Vermijd contact en gebruik huid- en oogbescherming. |
| DMEM medium | Life Technologies | #41965062 | |
| DTT, DL-Dithiothreitol | Sigma | #D9779 | |
| EDTA | Euromedex | #EU0007-C | |
| EGTA | Sigma | #E3889 | |
| Absoluut ethanol | Fisher Chemical | #E/0650DF/15 | |
| Foetaal rund serum (FBS) | Sigma | #F7524 | |
| Franse drukcelpers | Thermo electron corporation | #FA-078A | Met een #FA-032 cel; voor het lyseren van grote hoeveelheden cellen. Ingesteld op medium ratio, en de meetdruk van 1.000 psi (komt overeen met 3.000 psi binnenin de disruptiekamer). |
| Glycerol | VWR Chemicals | #24388.295 | |
| Glycine | Sigma | #G8898 | |
| GTP | Sigma | #G8877 | |
| Verwarmingsblok | Stuart | #SBH130D | |
| Hela cellen | ATCC® CCL-2™ | ||
| Hela S3 cellen | ATCC | ATCC® CCL-2.2™ | |
| Zoutzuur (HCl ) | VWR | #20252.290 | |
| Inverteer microscoop | Met fluorescentie als celtransfectie moet worden geverifieerd | ||
| Isopropanol | VWR | #20842.298 | |
| jetPEI | Polyplus | #101 | |
| JLA-8.1000 rotor | Voor het verzamelen van spinnerculturen | ||
| KOH | Sigma | #P1767 | KOH is corrosief en veroorzaakt brandwonden; gebruik oog- en huidbescherming. |
| L-Glutamine | Life Technologies | #25030123 | |
| Laboratorium centrifuge voor 50-ml buisjes | Sigma | 4-16 K | |
| Leupeptine | Sigma |
Referenties
- Verhey, K. J., Gaertig, J. The tubulin code. Cell Cycle. 6 (17), 2152-2160 (2007).
- Janke, C. The tubulin code: Molecular components, readout mechanisms, and functions. Journal of Cell Biology. 206 (4), 461-472 (2014).
- Janke, C., Magiera, M. M.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
