Kwantitatieve Proteomics Workflow met behulp van multiple reaction monitoring gebaseerde detectie van eiwitten uit menselijk hersenweefsel

Samenvatting

Het protocol is bedoeld om het gebruik van een triple quadrupole mass spectrometer voor Multiple Reaction Monitoring (MRM) van eiwitten uit klinische monsters in te voeren. We hebben een systematische workflow voorzien, van monstervoorbereiding tot gegevensanalyse voor klinische monsters met alle nodige voorzorgsmaatregelen die moeten worden genomen.

Samenvatting

De proteomische analyse van het menselijk hersenweefsel in de afgelopen tien jaar heeft ons begrip van de hersenen aanzienlijk verbeterd. Hersengerelateerde aandoeningen blijven echter een belangrijke bijdrage leveren aan sterfgevallen over de hele wereld, waardoor de behoefte aan nog meer begrip van hun pathobiologie noodzakelijk is. Traditionele op antilichamen gebaseerde technieken zoals westerse blotting of immunohistochemie lijden aan een lage doorvoer, naast arbeidsintensief en kwalitatief of semi-kwantitatief. Zelfs conventionele massaspectrometrie-gebaseerde shotgun benaderingen leveren geen sluitend bewijs om een bepaalde hypothese te ondersteunen. Gerichte proteomics benaderingen zijn grotendeels hypothese gedreven en verschillen van de conventionele shotgun proteomics benaderingen die al lang in gebruik zijn. Meervoudige reactiebewaking is zo'n gerichte aanpak die het gebruik van een speciale massaspectrometer vereist, de tandemviervoudige massaspectrometer of drievoudige viervoudige massaspectrometer. In de huidige studie hebben we systematisch de belangrijkste stappen benadrukt die gepaard gaan met het uitvoeren van een succesvolle tandemviervoudige op massaspectrometrie gebaseerde proteomics-workflow met behulp van menselijk hersenweefsel met als doel deze workflow te introduceren in een bredere onderzoeksgemeenschap.

Inleiding

In de afgelopen tien jaar hebben snelle ontwikkelingen in massaspectrometrie (MS) in combinatie met een beter begrip van chromatografietechnieken sterk bijgedragen aan de vooruitgang van op MS gebaseerde proteomica. Moleculaire biologie-gebaseerde technieken zoals westerse blotting en immunohistochologie hebben lang geleden aan reproduceerbaarheidsproblemen, trage doorlooptijd, variabiliteit tussen waarnemers en hun onvermogen om eiwitten nauwkeurig te kwantificeren, om er maar een paar te noemen. Daartoe blijft de superieure gevoeligheid van proteomics-benaderingen met hoge doorvoer moleculair biologen een alternatief en betrouwbaarder hulpmiddel bieden in hun zoektocht naar een beter begrip van de rollen van eiwitten in cellen. Echter, shotgun proteomics benaderingen (Data dependent Acquisition of DDA) vaak niet te detecteren lage overvloedige eiwitten in complexe weefsels naast sterk afhankelijk van de gevoeligheid en resolutie van het instrument. In de afgelopen jaren hebben laboratoria over de hele wereld technieken ontwikkeld zoals Data Independent Acquisition (DIA) die meer rekenkracht en betrouwbare software vereisen die deze zeer complexe datasets aankan. Deze technieken zijn echter nog steeds een werk in uitvoering en niet erg gebruiksvriendelijk. Gerichte MS-gebaseerde proteomics-benaderingen bieden een perfecte balans tussen de hoge doorvoer van MS-benaderingen en de gevoeligheid van moleculaire biologiebenaderingen zoals ELISA. Een gericht op massaspectrometrie gebaseerd proteomics-experiment richt zich op het detecteren van hypothesegestuurde eiwitten of peptiden uit op ontdekking gebaseerde proteomics-experimenten of via beschikbare literatuur^1,2. Multiple Reaction Monitoring (MRM) is zo'n gerichte MS-benadering die een tandemviervoudige massaspectrometer gebruikt voor nauwkeurige detectie en kwantificering van eiwitten /peptiden uit complexe monsters. De techniek biedt een hogere gevoeligheid en specificiteit, ondanks het gebruik van een instrument met lage resolutie.

Een viervoeter is gemaakt van 4 parallelle staven, waarbij elke staaf is verbonden met de diagonaal tegenoverliggende staaf. Tussen de viervoudige staven ontstaat een fluctuerend veld door afwisselend RF- en DC-spanningen toe te passen. De baan van de ionen in de viervoeter wordt beïnvloed door de aanwezigheid van dezelfde spanningen over tegenovergestelde staven. Door de RF op gelijkspanning aan te brengen, kan het traject van de ionen worden gestabiliseerd. Het is deze eigenschap van de viervoeter die het mogelijk maakt om te worden gebruikt als een massafilter dat selectief specifieke ionen kan laten passeren. Afhankelijk van de behoefte kan een quadrupole worden bediend in de statische modus of de scanmodus. De statische modus laat alleen ionen met een gespecificeerde m/z door, waardoor de modus zeer selectief en specifiek is voor het ion van belang. De scanmodus daarentegen laat ionen over het hele m/z-bereik passeren. Tandemviervoudige massaspectrometers kunnen dus op 4 mogelijke manieren werken: i) de eerste viervoeter werkt in de statische modus terwijl de tweede in scanmodus werkt; ii) de eerste viervoeter die in de scanmodus werkt, terwijl de tweede in de statische modus werkt; iii) beide quadrupoles die in de scanmodus werken; en iv) beide viervoeters die in statische modus werken³. In een typisch MRM-experiment werken beide quadrupolen in de statische modus, waardoor specifieke precursoren en de daaruit voortvloeiende producten na fragmentatie kunnen worden gecontroleerd. Dit maakt de techniek zeer gevoelig en selectief waardoor nauwkeurige kwantificering mogelijk is.

Voor moleculair biologen zijn het menselijk hersenweefsel en zijn cellen een schatkamer. Deze opmerkelijke eenheden van een steeds interessanter orgaan van het menselijk lichaam kunnen moleculaire en cellulaire inzichten geven in de werking ervan. Proteomische onderzoeken van het hersenweefsel kunnen ons niet alleen helpen de systemische werking van een gezond brein te begrijpen, maar ook de cellulaire paden die ontregeld raken wanneer ze worden toegebracht door een ziekte⁴. Het hersenweefsel met al zijn heterogeniteit is echter een zeer complex orgaan om te analyseren en vereist een gecoördineerde aanpak voor een beter begrip van de veranderingen op moleculair niveau. Het volgende werk beschrijft de hele workflow, beginnend met het extraheren van eiwitten uit hersenweefsel, het creëren en optimaliseren van de methoden voor MRM-test, tot validatie van de doelen (Figuur 1). Hier hebben we systematisch de belangrijkste stappen benadrukt die betrokken zijn bij een succesvol MRM-gebaseerd experiment met menselijk hersenweefsel met als doel de techniek en de uitdagingen ervan te introduceren in een bredere onderzoeksgemeenschap.

Protocol

Deze studie omvat hersenweefselmonsters van menselijke deelnemers, beoordeeld en goedgekeurd door TMH en IITB IEC - (IITB-IEC/2018/019). De deelnemers gaven hun geïnformeerde en schriftelijke toestemming om deel te nemen aan dit onderzoek.

1 Eiwitextractie uit hersenweefsel

1. Weeg ongeveer 50 mg hersenweefsel en was het weefsel met 300 μL 1x fosfaatbufferoplossing (PBS) met behulp van een micropipet.
   OPMERKING: Deze stap wordt uitgevoerd om bloed op het buitenoppervlak van het weefsel te verwijderen en moet indien nodig worden herhaald. Het is raadzaam om zoveel mogelijk bloed uit weefsel te verwijderen omdat het de downstream eiwitschatting en -verwerking verstoort.
2. Voeg na het wassen met PBS 300 μL lysisbuffer (buffer A) toe aan de buis die het weefsel bevat. Buffer A bevat 8 M ureum, 50 mM Tris pH 8,0, 75 mM NaCl, 1 mM MgCl₂ en Protease inhibitor cocktail (volgens de instructies van de fabrikant).
   OPMERKING: De eiwitopbrengst varieert afhankelijk van verschillende factoren, variërend van de omstandigheden waarin de monsters worden opgeslagen, de hoeveelheid uitgangsmateriaal en de efficiëntie van de behandeling van de monsters tijdens de verwerking. Verminder het volume van buffer A proportioneel bij het werken met hoeveelheden weefsel lager dan 50 mg.
3. Lyse het weefsel met behulp van een sonde sonicator terwijl het houden van de buis op een ijsbad. Gebruik de volgende parameters voor sonicatie: 40% amplitude, 5 seconden aan en uit cyclus gedurende 2:30 min.
4. Ga verder met weefselhomogenisatie met behulp van een kraalklopper om het weefsel volledig te lyseren.
   OPMERKING: Deze stap moet gedurende 90 seconden op gemiddelde snelheid worden uitgevoerd, gevolgd door incubatie op ijs gedurende 3-5 minuten.
5. Centrifugeer de inhoud van de buis bij 6.000 x g gedurende 15 min bij 4 °C. Breng het supernatant over in een verse buis en meng homogeen.
   OPMERKING: Maak aliquots van het monster en bewaar bij -80°C tot verder gebruik.

2 Eiwitkwantificering en kwaliteitscontrole

1. Kwantificeer de monsters voorafgaand aan de spijsvertering met behulp van een standaardgrafiek gemaakt met bekende concentraties BSA.
   OPMERKING: Zorg ervoor dat de test die wordt gebruikt voor het schatten van eiwitten compatibel is met de buffer die wordt gebruikt voor het maken van het eiwitlysaat. Controleer de kwaliteit van het eiwitlysaat door een SDS-PAGE gel uit te voeren.

3 Eiwitvertering

1. Neem 50 μg eiwit in een microcentrifugebuisje en verminder de eiwitten door Tris 2-carboxyethylfosfine (TCEP) toe te voegen, zodat de uiteindelijke concentratie 20 mM is. Incubeer de inhoud gedurende 1 uur bij 37 °C.
2. Na incubatie, alkylaat de verminderde eiwitten door het toevoegen van iodoacetamide (IAZ) aan de buis, zodat de uiteindelijke concentratie is 40 mM. Incubeer de tube in het donker gedurende 30 minuten.
   OPMERKING: Bereid de IAA vers vlak voor de toevoeging aan de buis.
3. Voeg buffer B toe aan de buis met de gereduceerde en gekalkte eiwitten, zodat de uiteindelijke concentratie ureum in de buis minder dan 1 M bedraagt.
   OPMERKING: Buffer B bestaat uit 25 mM Tris (pH 8,0) en 1 mM CaCl₂ en wordt gebruikt voor het verdunnen van de monsters. Zorg er bij verdunning voor dat de inhoud van de buis een pH van 8 heeft voor een optimale eiwitvertering na toevoeging van trypsine.
4. Voeg trypsine toe in een verhouding tussen enzym en eiwit van 1:30 en incubeer de buizen 's nachts bij 37 °C met constant schudden.
5. Concentreer het verteerde product na de spijsvertering in een vacuümconcentrator. Bij deze stap kunnen de peptiden worden gereconstitueerd en ontzout of opgeslagen bij -80 °C voor toekomstig gebruik.

4 Desalting en peptide kwantificering

OPMERKING: Het ontzouten of reinigen van peptiden is essentieel voordat de monsters voor LC-MS/MS worden geladen. Zouten en andere verontreinigingen in het monster kunnen de kolommen verstoppen en ook schade aan het instrument veroorzaken. Het proces kan worden uitgevoerd met behulp van in de handel verkrijgde C18-fasetips of kolommen.

1. Activeer de stagetip met 20 μL 50% acetonitril (ACN) in 0,1% mierenzuur (FA). Centrifugeer de inhoud gedurende 1 minuut op 1000 x g en gooi de stroom weg.
   OPMERKING: De voorwaarden voor centrifugeren zijn hetzelfde tot het einde van de procedure.
2. Voeg 20 μL 100% ACN toe in 0,1% FA en centrifugeer de inhoud zoals in stap 4.1.
   OPMERKING: Activeringsstappen kunnen een paar keer worden herhaald.
3. Geef na activering 20 μL gereconstitueerd peptidemonster door de stage-tip en centrifuge zoals uitgevoerd in stap 4.1.
   OPMERKING: Gooi de stroom er in deze stap niet door.
4. Herhaal stap 4.3 met de stroom er minstens 5 keer doorheen om een maximale peptidebinding aan de stage-tip te garanderen.
5. Passeer 20 μL 0,1% FA door de stage-tip en gooi de stroom weg.
   OPMERKING: Herhaal deze stap nog twee keer voor betere resultaten.
6. Elute de gebonden peptiden in een verse microfuge buis door het passeren van toenemende concentraties van ACN, d.w.z. 40%, 60% en 80%, respectievelijk.
7. Droog de peptiden in een vacuümconcentrator en ga verder met het kwantificeren van peptiden.
8. Reconstitueer de gedroogde peptiden in 0,1% FA en kwantificeer met behulp van de Scopes-methode⁵.

5 Voorbereiding overgangslijst van afgeronde doelstellingen

OPMERKING: Een overgang verwijst naar de waarden van het paar precursoren (Q1) naar product (Q3) m/z in een MRM-experiment. Een peptide kan één tot vele overgangen hebben, met dezelfde Q1-waarde maar verschillende Q3-waarden. Een drievoudige viervoudige massaspectrometer vereist informatie over de overgangen voor de peptiden en hun producten om te worden gedetecteerd. Daarom moet, voordat een gericht experiment wordt gestart, een overgangslijst worden opgesteld. Dit kan worden gedaan met behulp van de online repository van SRMAtlas⁶ (https://db.systemsbiology.net/sbeams/cgi/PeptideAtlas/GetTransitions) of een open source software genaamd Skyline⁷ (https://skyline.ms/project/home/software/Skyline/begin.view).

1. Download het recente humane proteoom FASTA-bestand van UniProt (https://www.uniprot.org/) en maak een proteoombestand op de achtergrond door het in Skyline in te voegen. Ga in peptide-instellingen naar de vervolgkeuzelijst Achtergrond proteoom en klik op Toevoegen. Voer in het FASTA-sequentiebestand van het menselijke proteoom. Zorg ervoor dat deze database is geselecteerd en dat de toegestane waarde voor gemist decolleté is ingesteld op 0 voordat u doorgaat naar de volgende stap.
2. Nu, onder het tabblad Filter in Peptide-instellingen de lengte van geaccepteerde peptiden afbakenen van 8 tot 25 aminozuren.
3. Stel in Overgangsinstellingenonder Filtertabblad Precursorladingen in als 2,3, Stel Ionenladingen in als 1 en stel Iontypen in op y. Productionen kunnen worden geselecteerd afhankelijk van de keuze van de gebruiker. Selecteer N-terminal om te proline voor speciale ionen en laat alle andere parameters als standaard.
   OPMERKING: De peptide- en overgangsinstellingen kunnen variëren afhankelijk van het experiment.
4. Voeg de peptiden of eiwitten van belang in door te klikken op Bewerken en naar Invoegente gaan. Als u eiwitten wilt invoegen, hun toetredings-ID's wilt kopiëren en specifieke peptiden wilt invoegen, kopieert u de peptidesequenties. De software brengt de toetredings-ID's in kaart met het achtergrond proteoom en de overgangslijst wordt gemaakt op basis van de peptide- en overgangsinstellingen.
5. Exporteer de overgangslijst. Zorg ervoor dat in de vervolgkeuzelijst voor Instrumenttypehet juiste instrument is geselecteerd. Voor de optimalisatie-experimenten kan men ervoor kiezen om de overgangslijsten in kleinere aantallen op te splitsen door het gewenste aantal overgangen per bestand in Skyline in te stellen. Dit zorgt ervoor dat het instrument niet overweldigd wordt om te veel overgangen in één keer te screenen. Het aantal overgangen moet verder worden geoptimaliseerd om één enkele methode te krijgen - dit noemen we voortaan in de sectie methode-verfijning.

6 LC-parameters

1. Gebruik een binair oplosmiddelsysteem met het waterige oplosmiddel dat 0,1% FA (Oplosmiddel A) bevat en het organische oplosmiddel dat 80% ACN (Oplosmiddel B) bevat.
2. Stel de kolomtemperatuur in op 45 °C.
3. Stel een LC-gradiënt van 10 min in met een debiet van 450 μL/min (zoals weergegeven in tabel S1).

7 MS-parameters

OPMERKING: De uitgelegde test is ontwikkeld en geoptimaliseerd voor TSQ Altis Triple Quadrupole Mass Spectrometer.

1. Optimize voert parameters uit zoals Q1- en Q3-resolutie, verblijftijd en cyclustijd - één parameter tegelijk. We vinden dat 0,7 resolutie voor Q1 en Q3 het beste werkt. De cyclustijd of verblijftijd moet mogelijk worden aangepast op basis van het aantal overgangen en de gemiddelde piekbreedte van de peptiden die worden gecontroleerd.
2. Gebruik de MS-parameters in tabel S2 en tabel S3. De totale duur van de methode is 10 min.
   OPMERKING: De parameters blijven hetzelfde voor alle uitvoeringen tijdens en na de verfijning van de methode, tenzij anders vermeld. Voor een nieuw experiment kan het nodig zijn bepaalde parameters te wijzigen, afhankelijk van het type monster en de monsterverwerkingsstappen.

8 Looppasopeenvolging en Instrument QC

1. Bereid een mengsel van water: methanol: isopropanol: acetonitril in verhouding 1:1:1:1. Gebruik dit mengsel als blanco.
2. Bereid peptiden voor op elk standaardmonster dat kan worden gebruikt om de prestaties van het instrument consistent te controleren. Dit zal als QC norm worden gebruikt. We detecteren peptiden uit BSA-digesten die zijn geoptimaliseerd en geven een goede en consistente respons gedurende meerdere dagen (Figuur 2).
3. Om monsters uit te voeren, moet de reeks beginnen met een paar spaties, gevolgd door de QC-standaard en klinische monsters. Zorg er altijd voor dat er één spatie tussen twee opeenvolgende monsters zit.
4. Voor het gemak van vergelijking, zorg ervoor dat gelijke hoeveelheden en volumes van elk monster elke keer worden geïnjecteerd.

9 Methode verfijning

1. Analyseer de voorlopige gegevens die zijn verkregen uit de samengevoegde monsters met behulp van Skyline. Zoek naar de juiste piek, overgangen en parameters zoals piekvorm en intensiteit om de beste resultaten te selecteren. Sla het bestand op als een nieuw Skyline-project.
2. Gebruik een bibliotheek om de best passende piek te vinden en daarom wordt de best mogelijke overgangslijst geadviseerd. Een bibliotheek is een set MS/MS-pieken die beschikbaar zijn uit literatuur of interne experimenten.
3. Exporteer een nieuwe overgangslijst van het nieuw opgeslagen Skyline-project en gebruik deze overgangslijst om een nieuwe methode te maken. Verzamel gegevens van de nieuwe methode die is gemaakt en herhaal het proces van het verfijnen van de overgangen met Behulp van Skyline.
4. Zodra de lijst met peptiden en overgangen is voltooid na gegevensanalyse met Behulp van Skyline, finetun de methode door het uitproberen van verschillende permutaties van cyclustijd en verblijftijd.
   OPMERKING: Het gebruik van zware gelabelde synthetische peptiden en geïndexeerde retentietijd (iRT) peptiden maakt methode verfijning gemakkelijk^8,9. Het is daarom raadzaam om de methode nauwkeurig af te stemmen met behulp van deze peptiden.
5. Maak met behulp van de bewaartijdgegevens van de verfijningsexperimenten een definitieve methode die is gepland (met een gedefinieerd verwervingsvenster).
6. Bereid monsters voor individuele proefpersonen voor. Voor deze monsters worden gegevens verkregen met behulp van de definitieve geplande methode.
7. Zodra de gegevens zijn verkregen, kunnen verdere downstream-analyse en groepsvergelijking worden uitgevoerd door de onbewerkte bestanden naar Skyline te importeren.

Resultaten

We voerden relatieve kwantificering uit van 3 eiwitten uit 10 monsters, 5 monsters van elke groep patiënten met afwijkingen in de hersenen. Deze eiwitten omvatten Apolipoproteïne A-I (APOA-I), Vimentin (VIM) en Nicotinamide phosphoribosyltransferase (NAMPT) waarvan bekend is dat ze verschillende rollen vervullen in de hersencellen. De analyse na uitvoering van de gegevens werd uitgevoerd met behulp van Skyline-daily (Ver 20.2.1.286). In totaal werden 10 peptiden die overeenkomen met 3 eiwitten gecontroleerd. Deze omvatte...

Discussie

Technieken zoals immunohistochistry en westerse blotting werden beschouwd als de gouden normen voor validatie van eiwitdoelen voor vele jaren. Deze methoden vinden gebruik zelfs vandaag met kleine wijzigingen in het protocol en weinig afhankelijkheid van technologie waardoor ze zeer omslachtig en vervelend. Daarnaast gaat het ook om het gebruik van dure antilichamen die niet altijd dezelfde specificiteit vertonen in batches en veel expertise vereisen. Bovendien heeft slechts een klein deel van de eiwitten die zijn geïden...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Reagentia
Acetonitril (MS-kwaliteit)	Fisher Scientific	A/0620/21
Bovine Serum Albumine	HiMedia	TC194-25G
Calciumchloride	Fischer Scienific	BP510-500
Mierenzuur (MS-kwaliteit)	Fisher Scientific	147930250
Iodoacetamid	Sigma	1149-25G
Isopropanol (MS-kwaliteit)	Fisher Scientific	Q13827
Magnesiumchloride	Fischer Scienific	BP214-500
Methanol (MS-kwaliteit)	Fisher Scientific	A456-4
MS-kwaliteit water	Pierce	51140
Fosfaat Buffer Saline	HiMedia	TL1006-500ML
Protease-remmercocktail	Roche Diagnostics	11873580001
Natriumchloride	Merck	DF6D661300
TCEP	Sigma	646547
Tris Base	Merck	648310
Trypsine (MS-kwaliteit)	Pierce	90058
Urea	Merck	MB1D691237
Benodigdheden
Hypersil Gold C18-kolom	Thermo	25002-102130
Micropipetten	Gilson	F167380
Stage tips	MilliPore	ZTC18M008
Zirconia/Silica-kralen	BioSpec producten	11079110z
Apparatuur
Bead beater (Homogenisator)	Bertin Minilys	P000673-MLYS0-A
Microplate reader (spectrofotometer)	Thermo	MultiSkan Go
pH-meter	Eutech	CyberScan pH 510
Probe Sonicator	Sonics Materials, Inc	VCX 130
Shaking Drybath	Thermo	88880028
TSQ Altis-massaspectrometer	Thermo	TSQ02-10002
uHPLC - Vanquish	Thermo	VQF01-20001
Vacuum concentrator	Thermo	Savant ISS 110