PCR Mutagenese, Klonen, Expressie, Snelle Eiwitzuiveringsprotocollen en Kristallisatie van het Wilde Type en Mutante Vormen van Tryptofaan Synthase

Samenvatting

Dit artikel presenteert een reeks opeenvolgende methoden voor de expressie en zuivering van Salmonella typhimurium tryptofaan synthase comp dit protocol een snel systeem om het eiwitcomplex in een dag te zuiveren. Behandelde methoden zijn site-gerichte mutagenese, eiwitexpressie in Escherichia coli,affiniteitschromatografie, gelfiltratiechromatografie en kristallisatie.

Samenvatting

Structurele studies met tryptofaan synthase (TS) bi-enzym complex (α₂β₂ TS) van Salmonella typhimurium zijn uitgevoerd om het katalytische mechanisme, allosterisch gedrag en details van de enzymatische transformatie van substraat naar product in PLP-afhankelijke enzymen beter te begrijpen. In dit werk maakte een nieuw expressiesysteem om de geïsoleerde α- en geïsoleerde β-subeenheid te produceren, de zuivering van grote hoeveelheden zuivere subeenheden en α₂β₂StTS-complex van de geïsoleerde subeenheden binnen 2 dagen mogelijk. De zuivering werd uitgevoerd door affiniteitschromatografie gevolgd door decolleté van de affiniteitstag, ammoniumsulfaatprecipitatie en grootte-uitsluitingschromatografie (SEC). Om de rol van belangrijke residuen in het enzym β-site beter te begrijpen, werd site-directe mutagenese uitgevoerd in eerdere structurele studies. Een ander protocol werd gemaakt om het wilde type en mutant te zuiveren α₂β₂StTS complexen. Een eenvoudig, snel en efficiënt protocol met ammoniumsulfaatfractie en SEC maakte zuivering van α₂β₂StTS-complex in één dag mogelijk. Beide zuiveringsprotocollen die in dit werk worden beschreven, hebben aanzienlijke voordelen in vergelijking met eerdere protocollen om hetzelfde complex te zuiveren met BEHULP van PEG 8000 en spermine om de α₂β₂StTS-complex langs het zuiveringsprotocol te kristalliseren. Kristallisatie van het wilde type en sommige mutante vormen vindt plaats onder iets andere omstandigheden, waardoor de zuivering van sommige mutanten met PEG 8000 en spermine wordt aangetast. Om kristallen voor te bereiden die geschikt zijn voor röntgenkristallografische studies werden verschillende inspanningen geleverd om kristallisatie, kristalkwaliteit en cryoprotectie teoptimaliseren. De hier gepresenteerde methoden moeten algemeen toepasbaar zijn voor de zuivering van tryptofaansynthasesubeenheden en wilde α₂β₂StTS-complexen.

Inleiding

Het tryptofaan synthase (TS) bi-enzym complex (α₂β₂) is een allosterisch enzym, dat de laatste twee stappen in de biosynthese van het aminozuur L-tryptofaan in bacteriën, planten en schimmels^1,2,3katalyseert. Bacterie Salmonella enterica serovar typhimurium (St) veroorzaakt een ernstige gastro-intestinale infectie bij mens en andere dieren. Aangezien mensen en hogere dieren geen TS hebben (EC 4.2.1.20), is de_remmingvan S. typhimurium α 2 β₂ TS-complex (α₂β₂StTS) onderzocht als een potentieel geneesmiddeldoel voor de behandeling van cryptosporidiose en tuberculose⁴, genitale en oculaire infecties⁵, en voor potentieel herbicidegebruik in de landbouw⁶. De α-subeenheid katalyseert het aldolytische decolleté van indool-3-glycerolfosfaat (IGP) tot glyceraldehyde-3-fosfaat (GAP) en indool, door de vorming van een indolytine tautomeer intermediair en vervolgens koolstof-koolstofbindingssplitsing om GAP en indool^3,6te produceren . De β-katalytische plaats bevat een pyridoxaal 5′-fosfaat (PLP) cofactormolecuul gebonden aan β-Lys87 via een Schiff-basis, dat functioneert als een elektronenzinking in de loop van de reacties op het enzym β-subeenheid^3,7. De β-site katalyseert de vervanging van de L-Serine side-chain hydroxyl door indool om L-tryptofaan en een watermolecuul in een PLP-afhankelijke reactie te geven. Sint TS dient als een reeds lang bestaand model voor het onderzoek naar substraatangeulering en allosterische communicatie binnen multi-enzymcomplexen^2,3. Bidirectionele allosterische communicatie tussen de α- en β-subeenheden van TS is noodzakelijk om de katalytische stappen te synchroniseren en indoolafgifte tijdens L-tryptofaansynthese te voorkomen³. Om deze inspanning uit te breiden, hebben we verschillende mutanten (β-Gln114Ala, β-Lys167Thr en β-Ser377Ala) voorbereid door eenpuntsmutatie om te worden gebruikt bij verdere verkenningen van de relatie tussen enzymstructuur, mechanisme en functie op de katalytische locatie van de StTS β-subeenheid.

Gedetailleerd onderzoek naar het katalytische mechanisme van α₂β₂StTS is geïnitieerd door de onderzoeksgroep van Edith W. Miles. Vroege studies met inheemse Escherichia coli α₂β₂ TS-complex hebben zich gericht op de zuivering en karakterisering van het geïsoleerde α-subeenheid^8,9, geïsoleerde β-subeenheid^10,11 en de reconstitutie van het α₂β₂ TS-complex van de geïsoleerde subeenheden¹². De zuivering werd uitgevoerd door ammoniumsulfaatprecipitatie, monsterdialyse, DEAE-Sephadexchromatografie, dialyse en een tweede chromatografische ronde op een DEAE-Sephadex kolom¹². In een ander protocol werd de zuivering van hetzelfde complex verbeterd door het geklaarde cellysaat op een DEAE-Sephadex-kolom te laden, gevolgd door een chromatografische stap op een Sepharose 4B-kolom, ammoniumsulfaatprecipitatie en dialyse¹³. Beide zuiveringsprotocollen duren 4-5 dagen. Escherichia coli α₂β₂ TS complex gekristalliseerd, maar kristallen waren op dat moment niet geschikt voor röntgendiffractie.

In een nieuwe studie werden recombinante en wilde typevormen van S. typhimurium α₂β₂ TS-complex gezuiverd en gekristalliseerd^14,15. Het recombinant α₂β₂StTS complex werd overexpressie in E. coli stam CB149 met de pEBA-10 expressievector. Initiële kristallisatie en röntgendiffractiegegevensverzameling en analyse van de α₂β₂StTS-complex werden gerapporteerd¹⁴. Lange en dunne naalden zoals α₂β₂StTS-kristallen hebben echter de structurele studies aangetast. In een poging om betere röntgendiffractiegegevens te verzamelen, werd een ander zuiveringsprotocol beschreven om het wilde type en de mutante vormen van de α₂β₂StTS-complex¹⁵te zuiveren. Zuivering werd uitgevoerd met een eerste neerslag met spermine en PEG 8.000 in het geklaarde cellysaat en een groot omvangrijk neerslag werd verwijderd door centrifugeren. De supernatansfractie met grote hoeveelheden α₂β₂StTS-complex werd 16-48 uur bij 4 °C bewaard totdat gele kristallen neersloegen. Kristallen werden gewassen en uitgebreid gedialyseerd tegen verschillende buffers. Eiwitcomplex werd opnieuw gekeerd in buffer met ammoniumsulfaat en gedialyseerd¹⁵. Hoewel eiwitkristallisatie afhankelijk is van eiwit- en precipitante concentraties in oplossing, is het moeilijk om zuivering te controleren, te voorspellen en te reproduceren voor andere mutante vormen van α₂β₂StTS-complex in oplossing. Dit protocol heeft als voordeel dat het geen chromatografische methoden gebruikt; de nadelen zijn echter de lange zuiveringstijd die nodig is om te kristalliseren, dialyseren en recrystalliseren, meestal 5-7 dagen. Om kristallen te verkrijgen die geschikt zijn voor het verzamelen van röntgengegevens, werden meer dan 600 kristallisatieomstandigheden geëvalueerd met behulp van een combinatie en variatie van eiwitconcentratie, temperatuur, precipitanten (PEG 4.000, 6.000 en 8.000) en additieven (CaCl_2,MnCl_2,ZnCl_2,cadaverine, putrescine, spermine of spermidine)¹⁵. Kristallen hadden een betere kristallijne vorm en groeiden sneller in omstandigheden met 12% PEG 8.000 en 2 mM spermine. Kristallisatie was gunstiger bij 25 °C in plaats van bij 4, 30 of 42 °C en groeide binnen 3 dagen¹⁵uit tot maximale afmetingen. Verschillende α₂β₂StTS kristalstructuren werden gemeld op dat moment (1996-1999)^{16,17,18,19,20,21} en vele andere structuren zijn tot op heden gepubliceerd.

Hier is het belangrijkste doel om alternatieve protocollen te presenteren om tryptofaansynthase te zuiveren en eiwitkristallisatie te optimaliseren. Het huidige werk toont significante verbeteringen om het wilde type geïsoleerde α-subeenheid (αStTS), geïsoleerde β-subeenheid (βStTS) te zuiveren, gereconstitueerd α₂β₂StTS-complex van de geïsoleerde subeenheden, en wilde type en mutante vormen van de α₂β₂StTS complex. De voordelen ten opzichte van eerdere protocollen zijn aanzienlijk omdat de zuiveringstijd aanzienlijk werd verkort en kristallisatie en cryoprotectie werden geoptimaliseerd. Mutante vormen van α₂β₂StTS complex ontworpen in dit werk hebben gekristalliseerd in de buurt van dezelfde voorwaarde gebruikt voor de wild type vorm. Echter, fijne kristallisatie optimalisatie was nodig om grote enkele kristallen van voldoende kwaliteit te verkrijgen voor structuurbepaling bij bijna atoomresolutie. Tot op heden zijn er 134 tryptofaan synthase kristalstructuren afgezet in de Protein Data Bank (PDB), respectievelijk 101, 31 en 2 kristalstructuren voor bacteriën, archaea en eukaryote. Mooi, 73 structuren behoren tot S. enterica serovar typhimurium en 5 kristalstructuren van de α₂β₂StTS complex hebben resolutielimieten hoger dan 1,50 Angstroms. Het is niet verwonderlijk dat 4 van de 5 werden voorbereid in onze onderzoeksgroep (PDB ID's: 5CGQ om 1,18 Å, 4HT3 om 1,30 Å, 4HPJ om 1,45 Å, 6DZ4 om 1,45 Å-resolutie). De verfijnde kristalstructuren van mutante vorm van α₂β₂StTS complex zullen naar verwachting nieuwe inzichten verschaffen in het mechanisme en de rollen die worden gespeeld door essentiële aminozuurresiduen die betrokken zijn bij de L-tryptofaansynthese.

Protocol

1. Snel protocol om de α- en β-subeenheid en de opnieuw verbonden α₂β₂StTS complex te zuiveren

1. DNA-subcloning in pETSUMO-expressievector
   1. Verkrijg het translationeel koppelingsgen (trpA en trpB) dat codeert voor de α- en β- subeenheden van het tryptofaansynthase van de bacterie Salmonella enterica serovar typhimurium gekloond in de pEBA-10 expressievector²². Gebruik pEBA-10 vector als DNA-sjabloon.
      OPMERKING: Als alternatief kunnen de onderstaande primers worden gebruikt om beide genen uit het salmonella enterica serovar typhimurium genoom te versterken. Alle moleculaire biologie stappen werden gevolgd zoals beschreven in Molecular Cloning: A Laboratory Manual²³.
   2. Gebruik polymerasekettingreactie (PCR) om de volledige polynucleotidesequentie van de α-subeenheid(αStTS) individueel te versterken met primers αStTS-FW-Bam en αStTS-Rev-Eco en de volledige reeks van β-subeenheid (βStTS) met primers βStTS-FW-Bam en βStTS-Rev-Hind. Gebruik een smelttemperatuur van ongeveer 55 °C en een polymeraseverlengingstijd van 2 min.
      1. Gebruik high-fidelity DNA polymerase (bijv. Phusion) en het protocol van de fabrikant om de DNA-sequenties te versterken. Voeg voor een 50 μL PCR-reactie 34 μL nucleasevrij water, 10 μL 5x reactiebuffer, 1 μL 10 mM dNTPs, 1 μL 10 μM voorwaartse primer, 1 μL 10 μM reverse primer, 1 μL Template DNA (200 ng), 1,5 μL DMSO toe.
      2. Gebruik voor het PCR-programma een warme start (180 seconden bij 98 °C), gevolgd door 30 versterkingscycli (30 seconden bij 98 °C, 30 seconden bij 55 °C en 120 seconden bij 72 °C) en een laatste verlenging (300 seconden bij 72 °C).
         OPMERKING: De cursief sequenties komen overeen met respectievelijk de bamHI, EcoRI, BamHI en HindIII restrictie sites. De efficiëntie van enzymsplitsing dicht bij de termini van PCR-fragmenten werd verbeterd door extra basen toe te voegen (kleine letters).
         αStTS-FW-Bam: 5′-cgcGGATCCATGGAACGCTACGAAAA-3′
         αStTS-Rev-Eco: 5′-ccgGAATTCTTATGCGCGGCTGGC-3′
         βStTS-FW-Bam: 5′-cgcGGATCCATGACAACACTTCTCAAC-3′
         βStTS-Rev-Hind: 5′-cccAAGCTTTCAGATTTCCCCTC-3′
   3. Laad het PCR-product op 0,8% agarosegel in 1x TAE-buffer (40 mM Tris, 20 mM azijnzuur en 1 mM EDTA) op 6 V/cm, gel-extract de DNA-band van belang en gel zuiver het PCR-fragment met behulp van een silicaparelkit volgens de instructies van de fabrikant.
      1. Verteer ten minste 200 ng van elk DNA-fragment met geschikte restrictie-enzymen en omstandigheden die door de fabrikant gedurende 2 uur bij 37 °C worden aanbevolen.
      2. Voeg voor het opzetten van een 50 μL-beperkingsverteringsreactie 34 μL nucleasevrij water, 10 μL DNA (200 ng), 5 μL 10x reactiebuffer, 0,5 μL restrictie-enzym 1 en 0,5 μL restrictie-enzym 2 toe.
      3. Laad het verteringsproduct op 0,8% agarosegel op 1x TAE op 6 V/cm, gelextract en gel zuiver het verteerde fragment met behulp van een commerciële kit.
   4. Subklonen afzonderlijk elk fragment in de E. coli expressie gemodificeerde vector pET SUMO, eerder verteerd met geschikte enzymen en gel gezuiverd.
      OPMERKING: Deze vector is een aangepaste versie van de commerciële pET SUMO. Deze vector is geoptimaliseerd voor beperking enzym klonen. De multikloonsite (MCS) van pET28b vector(BamHI, EcoRI, SacI, SalI, HindIII, NotI en XhoI) is ingevoegd in de pET SUMO-kloonsite. Deze vector bevat een N-terminal 6x-Histidine tag in frame met het Small Ubiquitin-achtige Modifier eiwit (SUMO) en meerdere kloonsites.
   5. Ligaat 100 ng gemodificeerde pET SUMO en 50 ng PCR-fragment met T4 DNA-ligase gedurende 2 uur bij 25 °C.
   6. Transformeer de geconstrueerde plasmide in competente cellen van E. coli stam DH10Bα cellen. Plaatcellen op LB-agarplaten die 35 μg/ml kanamycine bevatten. Incubeer de plaat 's nachts bij 37 °C.
   7. Selecteer een enkele kolonie uit elke transformatie, bereid ultrazuiver plasmide-DNA voor en voer DNA-sequencing uit om te controleren of αStTS of βStTS in frame zijn gekloond met de N-terminal His6-SUMO-tag.
      OPMERKING: Bereid glycerolvoorraden celkweek voor (draai celsuspensie in 16% eindconcentratie steriele glycerol) en bewaar ze op lange termijn bij -80 °C.
   8. Transformeer de expressie plasmide SUMO-αStTS of SUMO-βStTS individueel in competente cellen van E. coli expressiestam Rosetta (DE3) pLysS met een T7 promotor-gebaseerd systeem. Plaat de recombinante cellen op Luria Bertani (LB) agarplaten die 35 μg/ml kanamycine en chlooramfenicol bevatten. Incubeer de plaat 's nachts bij 37 °C.
   9. Kies na succesvolle kolonievorming één enkele kolonie (zonder satellietkolonies) en verspreid deze in 5 ml LB-medium met beide antibiotica. Kweekcellen 's nachts met schudden bij 200 tpm bij 37 °C.
      OPMERKING: Bereid glycerolvoorraden celkweek voor, bewaar ze op lange termijn bij -80 °C of gebruik ze onmiddellijk voor recombinante eiwitexpressie.
2. Expressie van de subeenheden SUMO-αStTS en SUMO-βStTS
   1. Inentoogetische verse E. coli stam Rosetta (DE3) pLysS cellen met SUMO-αStTS of SUMO-βStTS bouwt of schraapt een deel van de bevroren glycerolvoorraad in een 50 ml cultuur van LB met 35 μg/ml kanamycine en chlooramfenicol. Kweek cellen 's nachts met schudden bij 200 tpm bij 37 °C.
   2. Inenteer de volgende ochtend 5 ml van de nachtcelkweek in een verse en steriele 2x 1000 ml LB met 2% glycerol plus kanamycine en chlooramfenicol (2,8 L Fernbach-kolf). Kweek celkweek met schudden bij 200 tpm bij 37 °C.
      OPMERKING: De expressie van SUMO-αStTS of SUMO-βStTS in LB bouillon levert 125-150 mg gelabeld eiwit per liter op. Overweeg het schaalprotocol omhoog of omlaag om aan specifieke eisen te voldoen.
   3. Induceer recombinante eiwitexpressie wanneer de OD₆₀₀ 0,6-0,8 bereikt door toevoeging van isopropyl β-D-1 thiogalactopyranoside (IPTG) bij een eindconcentratie van 0,4 mM gevolgd door incubatie bij 30 °C 's nachts met schudden bij 200 tpm.
   4. Oogst de cellen door gedurende 20 minuten bij 4.000 x g bij 4 °C te centrifugeren. Verwijder het supernatant en hang de celkorrels met koude lysisbuffer 1 (50 mM Tris-Cl, pH 8.0, met 500 mM NaCl, 5% glycerol, 10 mM 2-mercaptoethanol en 40 mM imidazol-Cl) opnieuw op tot een eindvolume van 60 ml.
      OPMERKING: Cellen kunnen langdurig bij -80 °C worden opgeslagen of onmiddellijk worden gebruikt voor eiwitzuivering. Om cellen op te slaan, splitst u de celsuspensie in 2 x 50 ml wegwerpcentrifuge conische buizen en houdt u celkorrels op -80 °C tot de eiwitzuiveringsstap.
3. Zuivering van de α- en β-subeenheden tryptofaansynthase
   OPMERKING: Alle procedures moeten worden uitgevoerd bij 4 °C, tenzij anders vermeld. Om de zuiveringstijd te verkorten, equilibreert u Ni-NTA agarose nikkel-geladen affiniteitskolommen en grootte-uitsluitingskolom in buffer voorafgaand aan eiwitzuivering of tijdens recombinante eiwitexpressie.
   1. Verstoor celkorrels door sonicatie met behulp van een digitale sonifier met 1/2" Horn-sonde (of een vergelijkbare apparatuur). Voer 20 cycli uit bij 80% amplitude duty cycle op ijswaterbad met 10 s pulse en 20 s rust of tot volledige celverstoring.
   2. Centrifugeer de cellysaat op 30.000 x g gedurende 30 min. Aspireer supernatant, zodat de pellet niet uit de buis loskomt. Filtreer het supernatant met een filtereenheid van 0,45 μm op ijs en laat het door een 15 ml Ni-NTA agarose nikkel-geladen affiniteitskolom stromen die vooraf is geëquilibreerd in lysisbuffer 1.
      OPMERKING: Elke Ni-NTA agarose kolom zal worden gebruikt om SUMO-αStTS of SUMO-βStTS recombinant eiwit te zuiveren. Zuivering kan worden uitgevoerd in een 2x 5 ml Ni-NiTA kolom bevestigd aan een snel eiwit vloeibaar chromatografie systeem. Zuiver één eiwit tegelijk.
   3. Was ni-NTA agarose kolom in 100 ml lysis buffer 1.
   4. Ga verder met een 80 ml eenstaps elutie met buffer E1 (25 mM Tris-Cl buffer, pH 7,8, met 200 mM NaCl, 5% glycerol en 400 mM imidazol-Cl).
      OPMERKING: SUMO-protease verdraagt tot 300 mM imidazol en het membraan van centrifugale filterapparaten verdraagt tot 100 mM imidazol. We raden aan om een ammoniumsulfaatprecipitatie uit te voeren om grote hoeveelheden imidazol te verwijderen en de zuiveringstijd te verkorten in plaats daarvan het eiwitmonster te verdunnen en tijd te verspillen met eiwitconcentratie.
   5. Beoordeel het beginvolume van de supernatansfractie. Voeg langzaam kleine hoeveelheden ammoniumsulfaat per keer toe, totdat een verzadiging van 60% (39,48 g/ 100 ml) bij 25 °C is bereikt. Roer de oplossing voorzichtig gedurende 30 minuten en vermijd bubbels. Centrifugeer op 10.000 x g gedurende 15 min.
   6. Aspireer en gooi de supernatansfractie voorzichtig weg. Resuspendeer de pelletfractie in 20 ml monsterbuffer (20 mM Tris-Cl, pH 8,0, 300 mM NaCl en 5% glycerol).
   7. Voeg voor His-SUMO-tag decolleté met SUMO-protease het recombinante fragment van Ubl-specifiek protease 1 uit Saccharomyces cerevisiae toe in een verhouding van 1:1000 en incubeer het mengsel gedurende 2 uur bij 4 °C.
   8. Centrifugeer het vergistingsproduct gedurende 20 minuten bij 10.000 x g in 25 °C om eiwitaggregaten te verwijderen voordat het monster door een affiniteitschromatografiekolom wordt geladen.
   9. Verwijder sporen van His6-SUMO-tag die het 20 ml geresuspendeerde monster passeert op een 15 ml Ni-NTA-agarosekolom, eerder geëquilibreerd in lysisbuffer 1.
   10. Verzamel het doorvoermonster met de niet-gelabelde αStTS of βStTS.
   11. Was de Ni-NTA kolom in 20 ml buffer 1 om restjes niet-gelabelde αStTS of βStTS te verzamelen.
   12. Concentreer elke subeenheid afzonderlijk met een 15 ml 10 kDa cutoff centrifugaalfiltereenheid door te draaien op 3.000 x g bij 4 °C. Breng het geconcentreerde eiwit over in een verse buis van 2,0 ml en microcentrifuge (10.000 x g, 10 min, 4 °C) om aggregaten te verwijderen. Bepaal eiwitconcentratie^24,bereid 1 ml aliquots bij 20-25 mg ml^-1,label, flash-freeze in vloeibare stikstof en bewaar ze bij -80 °C.
       OPMERKING: Voorgezuiverde eiwitmonsters kunnen op lange termijn bij -80 °C worden bewaard of onmiddellijk worden gebruikt voor eiwitzuivering op een kolom voor grootte-uitsluitingschromatografie (SEC).
   13. Neem een eiwit aliquot (20 mg) en microcentrifuge op 10.000 x g gedurende 10 minuten om aggregaten vóór SEC te verwijderen.
   14. Bemonsteringsmonster op een kolom voor grootte-uitsluitingschromatografie (bijv. HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR) bevestigd aan een snelle eiwitvloeistofchromatografie met een debiet van^0,5ml min -1 , eerder geëquilibreerd in SEC-buffer (10 mM Tris-Cl, pH 7,8, 100 mM NaCl, 5% glycerol, 0,0 mM).
       OPMERKING: Om hogere hoeveelheden geïsoleerde αStTS of βStTS-subeenheid te zuiveren en het aantal SEC-rondes te verminderen, laadt u een monster van 5 ml bij 20-25 mg ml^-1 op een kolom met grootte-uitsluitingschromatografie bij een debiet van 1,5 ml min^-1.
   15. Beoordeel de kwaliteit van αStTS of βStTS in de piekfractie met behulp van respectievelijk een 12% of 15% natrium dodecyl sulfaatgel elektroforese (SDS-PAGE), gekleurd met Coomassie briljant blauwe^{vlek 25}.
   16. Concentraat eiwit met verse 15 ml 10 kDa cutoff centrifugaal filtereenheden, bepaal eiwitconcentratie^24,bereid 0,5 ml aliquots bij 20-25 mg ml^-1,label, flash-freeze in vloeibare stikstof, en bewaar ze bij -80 °C.
4. Zuivering van het α₂β₂StTS complex vanuit de α- en β-subeenheden
   OPMERKING: Equilibreer de kolom grootte-uitsluitingschromatografie (Sephadex S-200 HR of Superdex 200 pg) in SEC-buffer (10 mM Tris-Cl, pH 7,8, 100 mM NaCl, 5% glycerol, 0,1 mM pyridoxaal fosfaat).
   1. Om het wildtype α₂β₂StTS-complex te zuiveren van de α- en β-subeenheden, ontdooit u concentraatmonsters van αStTS en βStTS-subeenheden bij 4 °C.
   2. Combineer aliquots (1,2 αStTS: 1,0 βStTS molaire verhouding) en geïncubeerd bij 4 °C gedurende 1 uur.
      OPMERKING: Overmaat aan αStTS is noodzakelijk om ervoor te zorgen dat het grootste deel van βStTS wordt opgenomen in het α₂β₂StTS-complex.
   3. Verwijder eiwitaggregaten door microcentrifugatie (10.000 x g, 10 min, 4 °C).
   4. Laad de opgehelderde supernatant in de kolom grootte-uitsluiting.
   5. Beoordeel de kwaliteit van αStTS of βStTS in de piekfractie met behulp van respectievelijk een 12% of 15% natrium dodecyl sulfaatgel elektroforese (SDS-PAGE), gekleurd met Coomassie briljant blauwe^{vlek 25}.
   6. Bepaal eiwitconcentratie^24,bereid 250-1000 μL aliquots bij 15-20 mg ml^-1,flash-freeze in vloeibare stikstof, en bewaar bij -80 °C.

2. Zuivering van het wilde type of de mutante vorm van de α₂β₂StTS-complex

1. Site-gerichte mutagenese om mutante βStTS voor te bereiden
   1. Gebruik construct pEBA-10 expressievector²² als DNA-sjabloon tijdens twee stappen polymerasekettingreactie om specifieke puntmutaties in de β-ketenTS-polynucleotidesequentie te introduceren.
      OPMERKING: Dit protocol kan worden gebruikt om een eenpuntsmutatie in α- of β-subeenheid van Salmonella typhimurium tryptofaansynthase in te voeren. Voor aanvullende, nieuwe oligonucleotideprimers die de gewenste mutatie bevatten, moeten op de juiste wijze worden ontworpen. In dit werk worden mutaties βQ114A, βK167T βS377A vermeld.
   2. Voer PCR-reacties uit met behulp van paren nucleotideprimers TS-FW-NcoI/Q114A-Rev, TS-FW-NcoI/K167T-Rev en TS-FW-NcoI/S377A-Rev om respectievelijk fragmenten A1, B1 en C1 te genereren.
      OPMERKING: Oligonucleotide TS-NcoI-FW en TS-SacI-Rev, respectievelijk, gloeien stroomopwaarts en stroomafwaarts van de αβ StTS polynucleotidesequentie gekloond in de pEBA-10 vector.
      1. Gebruik high-fidelity DNA polymerase (bijv. Phusion) en het protocol van de fabrikant om de DNA-sequenties te versterken. Voeg voor een PCR-reactie van 50 μL 34 μL nucleasevrij water, 10 μL 5x reactiebuffer, 1 μL 10 mM dNTPs, 1 μL 10 μM voorwaartse primer, 1 μL 10 μM reverse primer, 1 μL Template DNA (200 ng), 1,5 μL DMSO toe.
      2. Gebruik voor het PCR-programma een warme start (180 seconden bij 98 °C), gevolgd door 30 versterkingscycli (30 seconden bij 98 °C, 30 seconden bij 55 °C en 120 seconden bij 72 °C) en een laatste verlenging (300 seconden bij 72 °C).
         OPMERKING: Alle moleculaire biologiestappen werden gevolgd zoals beschreven in Molecular Cloning: A Laboratory Manual²³. Terwijl een kleine letters sequentie overeenkomt met een beperkingsplaats, komt een vetgedrukte en cursief sequentie overeen met een mutatie.
         TS-FW-NcoI: 5'-CAA TTT CAC ACA GGA AAC AGA cca tgg-3"
         Q114A-Rev: 5'-C AGA GGC GAC GCC GTG CGC ACC GGC GCC GGT TTC-3"
         K167T-Rev: 5'-CTC GTT ACA GGC ATC TGT TAG CGT AGC GGA GCC-3'
         S377A-Rev: 5'-C TTT ATC TCC GCG GCC AGC GAG ATT GAC CAC CAG-3'
   3. Voer PCR-reacties uit met behulp van paren nucleotideprimers TS-Rev-SacI/Q114A-FF, TS-Rev-SacI/K167T-FF en TS-Rev-SacI/S377A-FF om fragmenten A2, B2 en C2 te genereren.
      TS-Rev-SacI (5'-TTA tgc gcg GCT GGC GGC TTT KAT GGC TGA G-3'
      Q114A-FF 5'-GAA ACC GGC GCC GGT GCG CAC GGC GTC GCC TCT G-3"
      K167T-FF 5'-GGC TCC GCT ACG CTA ACA GAT GCC TGT AAC GAG-3"
      S377A-FF 5'-CTG GTG GTC AAT CTC GCT GGC CGC GGA GAT AAA G-3'
   4. Gebruik polymerasekettingreactie om de partiële fragmenten individueel te versterken. Gebruik een smelttemperatuur van 55 °C en een polymeraseverlengingstijd van 2 min.
   5. Om de tweede ronde van PCR-reacties uit te voeren, laadt u het PCR-product hierboven op 0,8% agarosegel op 1x TAE op 6 V/ cm en gelextract en gel zuiveren de fragmenten van belang.
      1. Meng de fragmenten A1/A2, B1/B2 en C1/C2 afzonderlijk in equivalente hoeveelheden, verwarm het mengsel gedurende 10 minuten bij 96 °C en gloei bij 25 °C. Breid de recombinante strengen uit met een high-fidelity polymerase en deoxyribonucleotiden volgens het protocol van de fabrikant.
   6. Om een hoog kopieernummer van het volledige mutante DNA-fragment te genereren, voegt u oligoprimers TS-FW-NcoI en TS-Rev-SacI toe om een tweede PCR uit te voeren.
   7. Laad het PCR-product op 0,8% agarose in 1x TAE-buffer bij 6 V/cm, pak de DNA-band van belang, gel zuiver het PCR-fragment en ga door met de juiste beperkingsvertering gedurende 2 uur bij 37 °C volgens de juiste buffer en de door de fabrikant aanbevolen omstandigheden.
      1. Verteer ten minste 200 ng van elk DNA-fragment met geschikte restrictie-enzymen en omstandigheden die door de fabrikant gedurende 2 uur bij 37 °C worden aanbevolen. Voeg voor het opzetten van een 50 μL-beperkingsverteringsreactie 34 μL nucleasevrij water, 10 μL DNA (200 ng), 5 μL 10x reactiebuffer, 0,5 μL restrictie-enzym 1 en 0,5 μL restrictie-enzym 2 toe. Laad het vergistingsproduct op 0,8% agarose in 1x TAE buffer op 6 V/cm en zuiver het verteerde PCR fragment.
   8. Digest 200 ng pEBA-10 construct met restrictie enzymen NcoI en SacI volgens de aanbeveling van de fabrikant. Laad het verteringsproduct op 0,8% agarosegel in 1x TAE-buffer op 6 V/cm, accijns de bandcorrespondent naar de vector en gel zuiver de verteerde vector.
   9. Ligate 100 ng vector met 50 ng PCR-fragment, eerder verteerd en gezuiverd, met T4 DNA-ligase gedurende 2 uur bij 25 °C. Transformeer de geconstrueerde plasmide in competente cellen E. coli stam DH10B cellen. Plaatcellen op LB-agarplaten die 50 μg/ml ampicilline bevatten. Incubeer de plaat 's nachts bij 37 °C.
   10. Kies een enkele kolonie (zonder satellietkolonies) uit elke celtransformatie en verspreid deze in 5 ml LB-medium dat ampicilline bevat. Kweek cellen 's nachts met schudden bij 200 tpm bij 37 °C. Bereid 10 μg ultrazuiver plasmide-DNA van elke ontworpen constructie. Bereid glycerolvoorraden celkweek voor (draai celsuspensie in 16% eindconcentratie steriele glycerol) en bewaar langdurig bij -80 °C.
   11. Voer DNA-sequencing uit om de volledige reeks te bevestigen die codeert voor de α- en β-subeenheden van tryptofaansynthase. Bevestig elke afzonderlijke mutatie en gooi elke plasmideconstructie weg die ongewenste willekeurige mutatie bevat. De oligonucleotide primers die in deze studie worden gebruikt, staan hieronder vermeld.
       TS-1F: 5'-ATGACAACACTTCTCAAC-3"
       TS-1R: 5'-GAAATGCCAGAACATTAC-3'
       TS-2F: 5'-CAGTCGCCGAACGTC-3'
       TS-3F: 5'-GATGATGCAAACAGC-3"
       TS-4F: 5'-CTGGCATTGAACAGTC-3"
       TS-5F: 5'-CGTTGCATCATCTCATTG-3"
       OPMERKING: Oligonucleotide primers TS-1F, TS-1R, TS-2F en TS-3F gloeien op de polynucleotidesequentie van de β-subeenheid (GenBank toetredingscode: CP051286.1). Primers TS-4F en TS-5F gloeien op de polynucleotidesequentie van de α-subeenheid (GenBank toetredingscode: CP053865.1).
   12. Gebruik 200 ng van elke plasmideconstructie (pEBA-10-βQ114A, pEBA-10-βK167T en pEBA-10-βS377A) om competente cellen van E. coli expressiestam CB149 te transformeren, zonder de trp operon²⁶. Kies na succesvolle kolonievorming één enkele kolonie en kweek de cellen in 5 ml LB-medium met 50 μg/ml ampicilline. Kweek in de bacteriële incubator bij 37 °C 's nachts. Bereid glycerolvoorraden celkweek voor, bewaar langdurig bij -80 °C of gebruik onmiddellijk voor recombinante eiwitexpressie.
       OPMERKING: Een enkele eenpuntsmutatie in α-of β-subeenheid van Salmonella typhimurium tryptofaan synthase kan de enzymfunctie of lagere synthese van L-tryptofaan in E. coli stam CB149 aantasten. Overweeg het gebruik van E. coli stam BL21(DE)pLys-S of Rosetta (DE3)pLys-S als er geen expressie of lagere hoeveelheden recombinant α₂β₂StTS complex wordt gedetecteerd in een SDS-PAGE gel.
2. Expressie van wild type en mutante vorm van α₂β₂StTS complex in E. coli
   1. Kweek E. coli expressiestam met de gewenste constructie in een vers en steriel 50 ml LB-medium met 50 μg/ml ampicilline. Kweek cellen 's nachts met schudden bij 200 tpm bij 37 °C.
   2. Voeg 5 ml van de nachtcelkweek toe in een verse en steriele 2x 1000 ml LB met 2% glycerol plus ampicilline (2,8 L Fernbach-kolf). Kweek celkweek met schudden bij 200 tpm bij 37 °C.
   3. Induceer recombinante eiwitexpressie wanneer de OD₆₀₀ 0,6-0,8 bereikt door toevoeging van IPTG bij een eindconcentratie van 0,4 mM, gevolgd door incubatie bij 30 °C 's nachts met schudden bij 200 tpm.
   4. Oogst de cellen door gedurende 20 minuten bij 4.000 x g in 4 °C te centrifugeren. Verwijder het supernatant en hang de celkorrels met koude lysisbuffer 2 (50 mM Tris-Cl, pH 7,80, met 100 mM NaCl, 5 mM dithiothreitol, 1 mM EDTA en 1 mM PMSF) opnieuw op tot een eindvolume van 50 ml buffer.
      OPMERKING: Cellen kunnen langdurig bij -80 °C worden opgeslagen of onmiddellijk worden gebruikt voor eiwitzuivering. Om cellen op te slaan, splitst u de celsuspensie in 2 x 50 ml wegwerpcentrifuge conische buizen en houdt u celkorrels op -80 °C tot de eiwitzuiveringsstap. De expressie van mutante en wilde type vorm van α₂β₂StTS complex in LB bouillon levert 125-150 mg eiwit per liter. Overweeg het schaalprotocol omhoog of omlaag om aan specifieke eisen te voldoen.
3. Zuivering van wild type of mutante vorm van α₂β₂StTS complex
   OPMERKING: Het volgende protocol is bedoeld om het niet-gelabelde recombinante wilde type of de mutante vorm van het recombinant α₂β₂StTS complex binnen 1 dag, afhankelijk van vaardigheden en inspanningen. Om de zuiveringstijd te verkorten, moet u de uitsluitingskolom grootte in buffer eerdere eiwitzuivering/-expressie gelijksluiten. Zuivering van wild type of mutant α₂β₂StTS-complex wordt uitgevoerd door een zuivering in twee stappen bestaande uit ammoniumsulfaatfractie en een grootte-uitsluitingschromatografie. Dit protocol levert 60-100 mg puur complex op uit 1 L LB medium.
   1. Verstoor celkorrels door sonicatie met behulp van een digitale sonifier met 1/2" Horn-sonde (of een vergelijkbare apparatuur). Voer 20 cycli uit bij 80% amplitude duty cycle op ijswaterbad met 10 s pulse en 20 s rust of tot volledige celverstoring.
   2. Centrifugeer het cellysaat gedurende 30 minuten bij 25 °C op 30.000 x g. Aspireer supernatant, zodat de pellet niet uit de buis loskomt. Filtreer de geklaarde supernatantfractie met een filter van 0,45 μm bij kamertemperatuur.
   3. Beoordeel het beginvolume van de verduidelijkte supernatansfractie. Voeg langzaam kleine hoeveelheden ammoniumsulfaat per keer toe, totdat een verzadiging van 20% is bereikt (11,51 g / 100 ml). Voer ammoniumsulfaatfractie uit bij 25 °C. Roer de oplossing voorzichtig gedurende 10 minuten en vermijd bubbels.
   4. Centrifugeer bij 30.000 x g gedurende 10 min bij 25 °C. Breng de 20% supernatansfractie over in een schone kolf. Resuspend 20% pelletfractie in 20 ml monsterbuffer 2 (50 mM Tris-Cl, pH 7,80, met 100 mM NaCl, 1 mM EDTA en 2 mM dithiothreitol) en bereid een monster voor om SDS-PAGE-gel uit te voeren. Gooi de 20% pelletfractie weg.
   5. Beoordeel het beginvolume van de 20% supernatansfractie. Voeg ammoniumsulfaat toe tot 30% verzadiging is bereikt (5,94 g / 100 ml), roer de oplossing, vermijd bellen en centrifugeer zoals voorheen. Breng de 30% supernatansfractie over in een schone kolf. Resuspend 30% pelletfractie voorzichtig in 20 ml monsterbuffer 2 en bereid een monster voor om SDS-PAGE gel uit te voeren. Gooi de 30% pelletfractie weg.
   6. Beoordeel het beginvolume van de 30% supernatansfractie. Voeg ammoniumsulfaat toe bij een verzadiging van 40% (6,14 g / 100 ml), roer de oplossing, vermijd bellen en centrifugeer zoals voorheen. Breng de 40% supernatansfractie over in een schone kolf. Resuspend 40% pelletfractie voorzichtig in 10 ml monsterbuffer 2 en bereid een monster voor om SDS-PAGE gel uit te voeren. Gooi de 40% supernatante fractie weg.
      OPMERKING: Beoordeel de kwaliteit van het αβStTS-complex met behulp van monsters van de 30% en 40% supernatant- en pelletfracties in een 12% SDS-PAGE gel25. Als u controleert of een ander mutant αβStTS-complex zich in de 40% supernatante fractie bevindt, gaat u verder met een verzadiging van 60% ammoniumsulfaat (13,0 g / 100 ml). Voorgezuiverde eiwit aliquots van de voorgezuiverde α₂β₂ StTS complex kunnen langdurig worden opgeslagen bij -80 °C of onmiddellijk worden gebruikt voor eiwitzuivering op een grootte-uitsluitingschromatografiekolom (SEC).
   7. Microcentrifugeer het eiwitmonster op 10.000 x g,20 min, 4 °C en laad de supernatansfractie op een HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR kolom bevestigd aan een snelle eiwit vloeistofchromatografie bij een debiet van^0,5ml min -1 , voorheen geëquilibreerd in SEC buffer (10 mM Tris-Cl, pH 7,8, 0,1 mM pyridoxaal fosfaat).
      OPMERKING: Om grote hoeveelheden complex te zuiveren, laadt u een monster van 5 ml bij 20-25 mg ml^-1 op een HiLoad 26/600 Superdex 200 pg kolom met een debiet van 1,5 ml min^-1.
   8. Beoordeel monsters verzameld langs de ammoniumsulfaatfractie en piekfracties uit de SEC-kolom op een 12% SDS-PAGE gel bevlekt met Coomassie^{briljantblauwe vlek 25}.
   9. Concentreer het wilde type of mutant α₂β₂StTS-complex met een 15 ml 100 kDa cutoff centrifugaalfiltereenheid door te draaien bij 3.000 x g bij 4 °C. Breng het geconcentreerde eiwit over in een verse buis van 2,0 ml en microcentrifuge (10.000 x g, 10 min, 4 °C) om aggregaten te verwijderen.
   10. Bepaal eiwitconcentratie^24,bereid 0,5 ml aliquots bij 20-25 mg ml^-1,label, flash-freeze in vloeibare stikstof en bewaar ze bij -80 °C.

3. Geoptimaliseerde kristallisatie voor wild type en mutante vorm van de α₂β₂StTS complex

OPMERKING: De initiële kristallisatieconditie voor de α₂β₂StTS-complex werd eerder gemeld in omstandigheden met 12% PEG 8.000 en 2 mM spermine²².

1. Bereid voorraadoplossingen voor voorafgaand aan de kristallisatietesten om een betere kristallisatiereproduceerbaarheid te bereiken. Om structurele studies met TS uit te voeren, kristalliseert u eiwitten met Na⁺ of Cs⁺ ion op de metaalcoördinatieplaats van het bi-enzymcomplex.
   1. Bereid 5 ml stamoplossing van 200 ml spermine in water en houd 500 μL aliquots bij -20 °C.
   2. Bereid 50 ml voorraadoplossing van 30% (m/v) PEG 8000 in water en bewaar 25 ml aliquots in een 50 ml wegwerpcentrifuge conische kolven bij 25 °C.
   3. Bereid een voorraadoplossing van 25 ml van 1 M CsCl in water en bewaar deze op 25 °C.
   4. Bereid een voorraadoplossing van 25 ml van 1 M NaCl in water en houd deze op 25 °C.
   5. Bereid 3x 50 ml stamoplossing van 1 M bicine en titreer met CsOH of NaOH om gebufferde oplossingen te verkrijgen bij pH 7,6, 7,8 en 8,0. Houd 25 ml aliquots bij 4 °C.
2. Ontdooi een monster van α₂β₂StTS complex (20-25 mg ml^-1) op een ijsbad.
3. Microcentrifugemonster bij 10.000 x g gedurende 10 minuten bij 25 °C om eiwitaggregaten te verwijderen.
4. Breng de ontruimde supernatantfractie over in een schone microcentrifugebuis.
5. Geschatte eiwitconcentratie²⁴ en verdunde eiwit aliquots (150-200 μL) bij 15 mg ml^-1 met 50 mM bicine-CsOH of -NaOH, pH 7,8 met 50 mM CsCl of NaCl. Houd het eiwitmonster op 25 °C.
6. Bereid de reservoiroplossingen van 500 μL voor 3x 24-put zitdruppelplaten in steriele microcentrifugebuizen met een label van 1,5 ml. De reservoiroplossing bevat 50 mM bicine-CsOH of -NaOH, 50 mM CsCl of NaCl en PEG 8000. Varieer de concentratie PEG 8000 (6-11%) op de plaatkolommen en de concentratie spermine (2-8 mM) op de plaatrijen. Verander de pH van de buffer (pH 7,6, 7,8 en 8,0) voor elke set.
7. Sluit de buizen en vortex krachtig ten minste 10 sec. Centrifugeer buizen bij 10.000 x g gedurende 10 minuten bij 25 °C om bellen te verwijderen. Doseer 500 μL gebufferde oplossing in elk gelabeld reservoir.
8. Gebruik een P-10 micropipet en doseer 5 μL eiwitoplossing bij 15 mg ml^-1 per zitdruppel goed. Vermijd bubbels. Voeg 5 μL van elke correspondentreservoiroplossing toe aan de eiwitdruppel. Vermijd bubbels tijdens het mengen en pipetteer niet op en neer om het mengsel te homogeniseren.
9. Plak de plaat vast met een transparante plakband en bewaar de plaat op 25 °C. Kristallen verschijnen in 2-5 dagen en groeien binnen twee weken tot hun volle afmetingen.

4. Röntgendiffractiegegevensverzameling en α₂β₂StTS complexe structuuroplossing

OPMERKING: Bereid voorafgaand aan het verzamelen van röntgendiffractiegegevens vooraf een cryoprotectantoplossing voor elk kristal voor. Gebruik de specifieke reservoiroplossing om 3 aliquots te bereiden die toenemende concentraties dimethylsulfoxide bevatten in oplossing (10, 20 en 30% v/v) en specifieke ligand(en). Dimethylsulfoxide bleek een beter cryoprotectant te zijn dan glycerol, ethyleenglycol en PEG 200-300.

1. Oogst een groot enkel kristal met behulp van een cryoloop onder de stereoscopische microscoop.
2. Pipet 2 μL van elke cryoprotectantoplossing die de neerslagoplossing bevat plus hogere concentraties dimethylsulfoxide en ligand(en) op een nieuwe afdekschuif.
3. Week c rystalachtereenvolgens in elke druppel en laat het kristal 30 s in de cryoprotectant-oplossing equilibreren.
4. Flash-cooling het cryo-beschermde kristal met behulp van een gasvormige stikstofstroom bij -173 °C (100 K) of dompel onder in vloeibare stikstof voor langdurige opslag in pucks.
   OPMERKING: Vul een schuim Dewar met vloeibare stikstof, koel een kristallen puck vooraf af, bewaar kristallen in de cryogene opslag Dewar en verzend kristallen naar de synchrotron met behulp van een droge verzender.
5. Ga verder met het verzamelen van röntgendiffractiegegevens bij -173 °C. Neem röntgendiffractiegegevens op met een belichtingstijd van 0,5-4,0 s en oscillaties van 0,5°. Draai kristal 180-360°.
6. Verwerk de röntgendiffractiebeelden met iMosflm²⁷ om een reflectiebestand in de juiste ruimtegroep te genereren. Over het algemeen behoren α₂β₂StTS kristallen tot de ruimtegroep C 121 (C2).
7. Schaal meerdere observaties van reflecties samen met Scala²⁸, geïmplementeerd in het CCP4-pakket²⁹.
8. Los de structuur van de hoge resolutie α₂β₂StTS complex op door moleculaire vervanging met MolRep³⁰ en een geschikt zoekmodel. Inspecteer het model en de elektronendichtheidskaart in Coot³¹ na een succesvolle structuuroplossing.
   OPMERKING: Er zijn veel TS-kristallenstructuren afgezet in de Protein Data Bank met verschillende ligand(en). Gebruik voor een betere moleculaire vervangingsstap en een kortere tijd die past bij de nieuwere kristalstructuur het beste zoekmodel met ligand (s) van belang. Ga verder met de verfijning van de kristalstructuur in CCP4^29,30 of Phenix³¹.
9. Maak handmatige aanpassingen aan het model met Behulp van Coot³², gevolgd door automatische verfijning met Refmac^29,33 of phenix.refine^31,34. Bouw en verfijn het uiteindelijke model door iteratieve rondes van modelbouw in Coot³² en geautomatiseerde verfijning uit te voeren.
10. Ga verder met de afzetting van coördinaten- en structuurfactoren op de website van de Protein Data Bank.

Resultaten

Zuivering van de α- en β- subeenheden van het tryptofaansynthase
De α-subeenheid (αStTS) en de β-subeenheid (βStTS) van het Salmonella typhimurium tryptofaan synthase werden gesubclod in de gemodificeerde pET SUMO vector. Figuur 1A toont representatieve SDS-PAGE resultaten van twee sterke banden die overeenkomen met de His6-SUMO-αStTS (lane αO...

Discussie

We hebben met succes mutante vorm α₂β₂ βQ114A, α₂β₂ βK167T, en α₂β₂ βS377A StTS complexen voor structuur-functie correlatie studies. Aanvankelijk hebben we geprobeerd de mutanten te zuiveren met behulp van een eerder zuiveringsprotocol²², dat α₂β₂StTS-complex kristallisatie met PEG 8000 en spermine vereist tijdens zuivering. Hoewel de kristallisatiesnelheid afhangt van de mutante vorm en van d...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
15 mL 10 kDa filter	MilliporeSigma	UFC901024	centrifugal filter unit
15 mL 100 kDa filter	MilliporeSigma	UFC910024	centrifugal filter unit
2 mL cryogenic vials	Corning	CLS430489	Cryogenic vials
2 mL microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	05-408-141	microcentrifuge tubes
24-well Cryschem Plate	Hampton Research	HR3-158	24-well sitting drop plates
2-mercaptoethanol	Fisher Scientific	O3446I-100	Chemisch
50 mL centrifuge conical tubes	Thermo Scientific	12-565-270	centrifuge conical tubes
AB15 ACCUMET Basic	Fisher Scientific	13-636-AB15	pH meter
Agarose	Fisher Scientific	BP1356-100	Agarose gel
ammonium sulfate	Fisher Scientific	A702-500	Chemisch
Ampicillin	Fisher Scientific	BP1760-5	Antibioticum
Bacterial incubator	Fisher Scientific	S35836	incubator.
BamHI	New England Biolabs	R0136S	Restriction enzyme
bicine	Fisher Scientific	BP2646100	Chemisch
Branson 450 Digital Sonifier	Brason	B450	Cell disruptor
Cesium chloride	Fisher Scientific	BP210-100	Chemisch
Cesium hydroxide	Acros Organics	AC213601000	Chemisch
Chloramphenicol	Fisher Scientific	BP904-100	Antibioticum
dimethyl sulfoxide	Fisher Scientific	D1391	Chemisch
dithiothreitol	Fisher Scientific	BP172-5	Chemisch
DNA Polymerase	Thermo Scientific	F530S	HF polymerase
dNTP Set	Invitrogen	10-297-018	dNTPs set
EcoRI	New England Biolabs	R0101S	Restriction enzyme
Ethylenediaminetetraacetic acid	Fisher Scientific	S311-100	Chemisch
Excella E25R Orbital Shaker	Eppendorf New Brunswick	M1353-0004	Orbital incubator
GE AKTA Prime Plus	GE Healthcare	8149-30-0004	FPLC
Gel Extraction Kit	Invitrogen	K210012	DNA purification kit
Glycerol	Fisher Scientific	G33-500	Chemisch
HindIII	New England Biolabs	R0104S	Restriction enzyme
His-Trap columns	GE Healthcare	GE17-5255-01	5 mL Histrap column
imidazole	Fisher Scientific	O3196-500	Chemisch
IPTG	Thermo Fisher Scientific	R0392	Inducer
Kanamycin	Fisher Scientific	BP906-5	Antibioticum
Kelvinator Series-100	Kelvinator	discontinued	Ultra low freezer
LB broth	Fisher Scientific	BP1426-500	Liquid broth
Luria Bertani agar	Fisher Scientific	BP1425-2	Solid broth
NaCl	Fisher Scientific	S271-500	Chemisch
NcoI	New England Biolabs	R0193S	Restriction enzyme
Ni-NTA affinity beads	Thermo Fisher Scientific	R90115	Ni-NTA agarose beads
PEG 8000	Fisher Scientific	BP233-100	Chemisch
phenylmethylsulfonyl fluoride	Fisher Scientific	44-865-0	Chemisch
pyridoxal phosphate	Acros Organics	AC228170010	Chemisch
S-200 HR	Cytiva	45-000-196	Size exclusion column
SacI	New England Biolabs	R0156S	Restriction enzyme
Sodium hydroxide	Fisher Scientific	S318-100	Chemisch
Sorvall RC-5B centrifuge	Sorvall	8327-30-1004	Floor cetrifuge
Spermine	Acros Organics	AC132750010	Chemisch
Superdex 200 prep grade	Cytiva	45-002-491	Size exclusion column
T4 DNA ligase	New England Biolabs	M0202S	DNA liagse
Tris	Fisher Scientific	BP152-500	Chemisch
Ubl-specific protease 1	Thermo Scientific	12588018	SUMO Protease