Co-translationele insertie in voorgevormde nanodiscs maakt het mogelijk om celvrije gesynthetiseerde membraaneiwitten te bestuderen in gedefinieerde lipideomgevingen zonder contact met detergentia. Dit protocol beschrijft de voorbereiding van essentiële systeemcomponenten en de kritieke parameters voor het verbeteren van de expressie-efficiëntie en monsterkwaliteit.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Co-translationele insertie van membraaneiwitten in voorgevormde nanodiscs
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Celvrije expressiesystemen maken het op maat gemaakte ontwerp van reactieomgevingen mogelijk om de functionele vouwing van zelfs complexe eiwitten zoals membraaneiwitten te ondersteunen. De experimentele procedures voor het co-translationeel inbrengen en vouwen van membraaneiwitten in voorgevormde en gedefinieerde membranen die als nanodiscs worden geleverd, worden gedemonstreerd. Het protocol is volledig wasmiddelvrij en kan binnen één dag milligrammen gezuiverde monsters genereren. De resulterende membraaneiwit / nanodisc-monsters kunnen worden gebruikt voor een verscheidenheid aan functionele studies en structurele toepassingen zoals kristallisatie, nucleaire magnetische resonantie of elektronenmicroscopie. De bereiding van belangrijke basiscomponenten zoals celvrije lysaten, nanodiscs met ontworpen membranen, kritieke voorraadoplossingen en de assemblage van celvrije expressiereacties met twee compartimenten wordt beschreven. Aangezien de vouwvereisten van membraaneiwitten zeer divers kunnen zijn, is een belangrijke focus van dit protocol de modulatie van parameters en reactiestappen die belangrijk zijn voor de monsterkwaliteit, zoals kritische basisreactieverbindingen, membraansamenstelling van nanodiscs, redox- en chaperonneomgeving of DNA-sjabloonontwerp. Het hele proces wordt aangetoond met de synthese van proteorhodopsine en een G-eiwit gekoppelde receptor.
Inleiding
Membraaneiwitten (MPs) zijn uitdagende doelen in eiwitproductiestudies vanwege hun onoplosbaarheid in waterige omgevingen. Conventionele MP-productieplatforms omvatten celgebaseerde systemen zoals E. coli, gist of eukaryote cellen. De gesynthetiseerde recombinante parlementsleden worden ofwel geëxtraheerd uit celmembranen of opnieuw gevouwen uit inclusielichamen1. Na detergentische oplosbaarheid kunnen parlementsleden worden overgebracht naar geschikte membraanomgevingen door middel van vastgestelde in vitro reconstitutieprotocollen. Naast blaasjes en liposomen zijn MP-reconstitutie in planaire membranen in de vorm van nanodiscs
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Bereiding van S30-lysaat
- Dag 1: Streep cellen uit glycerolvoorraden op een LB-agarplaat en incubeer 's nachts bij 37 °C.
- Dag 2: Ent 200 ml LB-medium in met de cellen van de agarplaat en incubeer bij 37 °C gedurende 12-14 uur.
- Dag 3: Ent 10 L steriel YPTG-medium (10 g/L gistextract, 16 g/L trypton, 5 g/L NaCl, 19,8 g/L glucose, 4,4 mM KH2PO4, 8 mM K2HPO4) getemperd tot 37 °C in een 15 L geroerde tankreactor met 100 ml van de voorcultuur (1:100). Telen bij 37 °C, 500 tpm en hoge beluchting (~ 3 luchtvolumes per minuut). Om overmatig schuimen te....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De impact van fijnafstemmingsreactieverbindingen op de uiteindelijke opbrengst of kwaliteit van gesynthetiseerde parlementsleden wordt geïllustreerd. Een frequente routinebenadering is om de optimale Mg2+ concentratie in CF-reacties aan te passen door expressie van groen fluorescerend eiwit (GFP) als een handige monitor van systeemefficiëntie. Als voorbeeld werd GFP gesynthetiseerd uit een pET-21a(+) vector bij Mg2+ concentraties tussen 14 en 24 mM (figuur 2). Sds-PAGE-.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De opzet en strategieën om de CF-expressie en co-translationele invoeging van functionele parlementsleden in nanodiscs te optimaliseren, worden beschreven. De benodigde apparatuur bestaat uit een bioreactor, een Frans persapparaat of iets dergelijks, een UV/VIS- en fluorescentielezer, CF-reactievaten die geschikt zijn voor een configuratie-opstelling met twee compartimenten en een temperatuurgecontroleerde incubator. Andere standaarduitrusting zijn centrifuges voor het oogsten van E. coli-cellen en tafelcentrifu.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
We willen de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) subsidie BE1911/8-1, het LOEWE project GLUE en het collaboratieve onderzoekscentrum Transport and Communication across Membranes (SFB807) bedanken voor financiële steun.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (natriumzout) (DMPG) | Avanti Polar Lipids (USA) | 840445P | |
| 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (DMPC) | Avanti Polar Lipids (USA) | 850345C | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (natriumzout) (DOPC) | Avanti Polar Lipids (USA) | 850375C | |
| 1,2 dioleoyl-sn-glycero-3-fosfo-rac-(1-glycerol) (natriumzout) (DOPG) | Avanti Polar Lipids (USA) | 840475C | |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-fosfocholine (POPC) | Avanti Polar Lipids (USA) | 850457C | |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfo-(1'-rac-glycerol) (natriumzout) (POPG) | Avanti Polar Lipids (USA) | 840034C | |
| 2-amino-2-(hydroxymethyl)-propaan-1,3-diol (Tris) | Carl Roth (Duitsland) | 4855 | |
| 2-Mercaptoethanol | Carl Roth (Duitsland) | 4227 | |
| 2-propanol | Carl Roth (Duitsland) | 9781 | |
| [3H]-dihydroalprenoloolhydrochloride | American Radiolabeled Chemicals (USA) | ART0134 | |
| acetylfosfaat lithiumkaliumzout (ACP) | Merck (Duitsland) | 1409 | |
| Adenosine 5'-trifosfaat (ATP) | Sigma Aldrich (Duitsland) | A9251 | |
| Alprenololhydrochloride | Merck (Duitsland) | A0360000 | |
| Aanwisseling chromatografiekolom materiaal: Q-sepharose® | Sigma-Aldrich (Duitsland) | Q1126 | |
| Autoclaaf Type GE 446EC-1 | Gettinge (Duitsland) | ||
| Bioreactor Type 884 124/1 | B.Braun (Duitsland) | ||
| Centrifuge | Sorvall RC12BP+; Thermo Scientific (Duitsland); Sorvall RC-5C; Thermo Scientific (Duitsland); Mikro 22 R; Hettich (Duitsland) | ||
| Cholzuur | Carl Roth (Duitsland) | 8137 | |
| Coomassie Briljant Blauw R250 | Carl Roth (Duitsland) | 3862 | |
| Kweekkolven 500 ml verende kolven, 2 l verende kolven | Schott Duran (Duitsland) | ||
| Cytidine 5'-trifosfaat dinatriumzout | Sigma-Aldrich (Duitsland) | C1506 | |
| D-glucose monohydraat | Carl Roth (Duitsland) | 6780 | |
| Di-kaliumwaterstoffosfaat trihydraat | Carl Roth (Duitsland) | 6878 | |
| Dialyseslang SpectrumTM Labs Spectra/PorTM 12-14 kD MWCO Standaard RC slang | Fisher Scientific (Duitsland) | 8700152 | |
| Dithiothreitol | Carl Roth (Duitsland) | 6908 | |
| Ethanol | Carl Roth (Duitsland) | K928 | |
| Folinic zuur calciumzout hydraat | Sigma-Aldrich (Duitsland) | 47612 | |
| French drukcel disructor | SLM; Amico Instruments (USA) | ||
| Glycerol | Carl Roth (Duitsland) | 3783 | |
| Guanosine 5'-trifosfaat di-natriumzout (GTP) | Sigma-Aldrich (Duitsland) | G8877 | |
| Zoutzuur | Carl Roth (Duitsland) | K025 | |
| IMAC kolom: HiTrap IMAC HP 5 mL | GE Life Sciences (Duitsland) | GE17-5248 | |
| Imidazol | Carl Roth (Duitsland) | 3899 | |
| Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) | Carl Roth (Duitsland) | 2316 | |
| Kanamycine | Carl Roth (Duitsland) | T832 | |
| L-Alanine | Carl Roth (Duitsland) | 3076.1 | |
| L-Arginine | Carl Roth (Duitsland) | 6908 | |
| L-Asparagine | Carl Roth (Duitsland) | HN23 | |
| L-Asparaginezuur | Carl Roth (Duitsland) | T202 | |
| L-Cysteïne | Carl Roth (Duitsland) | T203 | |
| L-Glutaminzuur | Carl Roth (Duitsland) | 3774 | |
| L-Glutamine | Carl Roth (Duitsland) | 3772 | |
| L-Glycine | Carl Roth (Duitsland) | 3187 | |
| L-Histidine | Carl Roth (Duitsland) | 3852 | |
| L-Isoleucine | Carl Roth (Duitsland) | 3922 | |
| L-Leucine | Carl Roth (Duitsland) | 1699 | |
| L-Lysine | Carl Roth (Duitsland) | 4207 | |
| L-Methionine | Carl Roth (Duitsland) | 9359 | |
| L-Proline | Carl Roth (Duitsland) | 1713 | |
| L-Fenylalanine | Carl Roth (Duitsland) | 1709 | |
| L-Serine | Carl Roth (Duitsland) | 4682 | |
| L-Threonine | Carl Roth (Duitsland) | 1738 | |
| L-Tryptofaen | Carl Roth (Duitsland) | 7700 | |
| L-Tyrosine | Carl Roth (Duitsland) | T207 | |
| MD100 dialyse eenheden | Scienova (Duitsland) | 40077 | |
| N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethaansulfonic acid (HEPES) | Carl Roth (Duitsland) | 6763 | |
| n-dodecylfosfocholine | Antrace (USA) | F308S | |
| PAGE kamer: Mini-Protean Tetra Cell | Biorad (Duitsland) |
Referenties
- Pandey, A., Shin, K., Patterson, R. E., Liu, X. Q., Rainey, J. K. Current strategies for protein production and purification enabling membrane protein structural biology. Biochemistry and Cell Biology. 94 (6), 507-527 (2016).
- Ritchie, T. K., et al.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
