Methodenartikel

Co-translationele insertie van membraaneiwitten in voorgevormde nanodiscs

DOI:

10.3791/61844

⸱

19 november 2020

 ,  ,  , 
1Institute of Biophysical Chemistry, Goethe University Frankfurt

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Co-translationele insertie in voorgevormde nanodiscs maakt het mogelijk om celvrije gesynthetiseerde membraaneiwitten te bestuderen in gedefinieerde lipideomgevingen zonder contact met detergentia. Dit protocol beschrijft de voorbereiding van essentiële systeemcomponenten en de kritieke parameters voor het verbeteren van de expressie-efficiëntie en monsterkwaliteit.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celvrije expressiesystemen maken het op maat gemaakte ontwerp van reactieomgevingen mogelijk om de functionele vouwing van zelfs complexe eiwitten zoals membraaneiwitten te ondersteunen. De experimentele procedures voor het co-translationeel inbrengen en vouwen van membraaneiwitten in voorgevormde en gedefinieerde membranen die als nanodiscs worden geleverd, worden gedemonstreerd. Het protocol is volledig wasmiddelvrij en kan binnen één dag milligrammen gezuiverde monsters genereren. De resulterende membraaneiwit / nanodisc-monsters kunnen worden gebruikt voor een verscheidenheid aan functionele studies en structurele toepassingen zoals kristallisatie, nucleaire magnetische resonantie of elektronenmicroscopie. De bereiding van belangrijke basiscomponenten zoals celvrije lysaten, nanodiscs met ontworpen membranen, kritieke voorraadoplossingen en de assemblage van celvrije expressiereacties met twee compartimenten wordt beschreven. Aangezien de vouwvereisten van membraaneiwitten zeer divers kunnen zijn, is een belangrijke focus van dit protocol de modulatie van parameters en reactiestappen die belangrijk zijn voor de monsterkwaliteit, zoals kritische basisreactieverbindingen, membraansamenstelling van nanodiscs, redox- en chaperonneomgeving of DNA-sjabloonontwerp. Het hele proces wordt aangetoond met de synthese van proteorhodopsine en een G-eiwit gekoppelde receptor.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Membraaneiwitten (MPs) zijn uitdagende doelen in eiwitproductiestudies vanwege hun onoplosbaarheid in waterige omgevingen. Conventionele MP-productieplatforms omvatten celgebaseerde systemen zoals E. coli, gist of eukaryote cellen. De gesynthetiseerde recombinante parlementsleden worden ofwel geëxtraheerd uit celmembranen of opnieuw gevouwen uit inclusielichamen1. Na detergentische oplosbaarheid kunnen parlementsleden worden overgebracht naar geschikte membraanomgevingen door middel van vastgestelde in vitro reconstitutieprotocollen. Naast blaasjes en liposomen zijn MP-reconstitutie in planaire membranen in de vorm van nanodiscs2 - of salipro3-deeltjes de afgelopen tijd routinetechnieken geworden. Al deze strategieën impliceren echter detergentcontact met parlementsleden dat kan leiden tot destabilisatie, dissociatie van oligomeren en zelfs verlies van eiwitstructuur en -activiteit4. Screening op optimale oplosbaarheid en reconstitutie van wasmiddelen kan daarom vervelend en tijdrovend zijn5.

Het open karakter van celvrije (CF) systemen maakt het mogelijk om de expressiereactie direct te voeden met voorgevormde membranen met een gedefinieerde lipidesamenstelling. In deze lipide-gebaseerde expressiemodus (L-CF) hebben de gesynthetiseerde parlementsleden de mogelijkheid om co-translationeelin te voegen in de geleverde bilayers 6,7 (figuur 1). Nanodiscs bestaande uit een membraansteigereiwit (MSP) rondom een vlakke lipide bilayer schijf8 blijken bijzonder geschikt voor deze strategie 9,10. Nanodiscs kunnen routinematig in vitro worden geassembleerd met een verscheidenheid aan verschillende lipiden, ze zijn zeer stabiel en voorraden kunnen tot 1 mM worden geconcentreerd. MSP-expressie in E. coli en de zuivering ervan is echter noodzakelijk. Als alternatieve strategie kan MSP samen met de beoogde MP worden uitgedrukt in CF-reacties die worden geleverd met liposomen 11,12,13. DNA-sjablonen voor zowel MSP als MP worden toegevoegd aan de reactie en MP / nanodiscs kunnen zich vormen bij expressie. Hoewel MSP-productie wordt vermeden, vereist de co-expressiestrategie een zorgvuldige verfijning van de uiteindelijke DNA-sjabloonconcentraties en kunnen hogere variaties in de efficiëntie van de monsterproductie worden verwacht.

De co-translationele insertie van parlementsleden in membranen van voorgevormde nanodiscs is een niet-fysiologisch en nog grotendeels onbekend mechanisme dat onafhankelijk is van transloconmachines en signaalsequenties 13,14,15,16. Belangrijke determinanten van de insertie-efficiëntie zijn het type membraaneiwit en de lipidesamenstelling van het geleverde membraan, met een frequente voorkeur voor negatief geladen lipiden 15,17. Omdat de nanodisc-membranen relatief beperkt zijn in grootte, komt een aanzienlijke hoeveelheid lipiden vrij bij mp-insertie18. Variatie van nanodisc-grootte maakt het mogelijk om hogere oligomere MP-complexen in te brengen en af te stemmen15,18. De juiste assemblage van homooligomeercomplexen werd onder andere aangetoond voor het ionkanaal KcsA, voor de ionpomp proteorhodopsine (PR) en voor de multidrugtransporter EmrE15,18. Kamerleden zullen waarschijnlijk van beide kanten met een relatief gelijke frequentie het symmetrische nanodisc-membraan betreden. Daarom moet ervan worden uitgegaan dat verschillende monomeren of oligomeren die in één nanodisc worden ingebracht, tegengestelde oriëntaties kunnen hebben. Een vertekening in oriëntatie kan echter worden veroorzaakt door coöperatieve insertiemechanismen zoals gerapporteerd voor de vorming van PR-hexameren en KcsA-tetrameren18. Een verdere vertekening in MP-oriëntatie kan het gevolg zijn van oriëntatieschakelaars van ingebrachte parlementsleden, waarschijnlijk aan de rand van de nanodisc-membranen.

De productie van CF-lysaten uit E. coli-stammen is een betrouwbare routinetechniek en kan in bijna elk biochemisch laboratorium worden uitgevoerd19,20. Er moet rekening mee worden gehouden dat naast de vorming van disulfidebrug, de meeste andere posttranslationele modificaties afwezig zijn als een MP wordt gesynthetiseerd met behulp van E. coli-lysaten. Hoewel dit meer homogene monsters voor structurele studies kan genereren, kan het nodig zijn om mogelijke effecten op de functie van individuele MP-doelen uit te sluiten. De efficiënte productie van hoogwaardige monsters van G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCR)14,21,22, eukaryote transporters23 of grote heteromere assemblages24 in E. coli CF-lysaten geeft echter aan dat ze geschikt zijn voor zelfs complexe doelen. Preparatieve schaalhoeveelheden (≈ 1 mg/ml) van een monster kunnen worden verkregen met de cecf-configuratie (continuous exchange cell-free) met twee compartimenten, bestaande uit een reactiemengsel (RM) en een voedingsmengselcompartiment (FM). Het FM-volume overschrijdt het RM-volume 15 tot 20-voudig en biedt een reservoir van laagmoleculaire energieverbindingen en precursoren19. De expressiereactie wordt dus enkele uren verlengd en de uiteindelijke opbrengst van het MP-doel wordt verhoogd. De RM- en FM-compartimenten worden gescheiden door een dialysemembraan met een cutoff van 10-14 kDa. De twee compartimenten vereisen een speciaal ontwerp van de CECF-reactiecontainer (figuur 1). Commerciële dialysecassettes als RM-containers in combinatie met op maat gemaakte plexiglas containers met de FM zijn geschikte voorbeelden. MP-opbrengsten kunnen verder worden gemanipuleerd door de RM:FM-verhoudingen te wijzigen of door de FM na een bepaalde incubatieperiode uit te wisselen.

Opbrengst en kwaliteit van een MP vereisen vaak een intensieve optimalisatie van de reactieparameters. Een belangrijk voordeel van CF-expressie is de mogelijkheid om bijna elke verbinding te wijzigen en af te stemmen volgens de individuele vereisten van een MP. Een eenvoudige strategie is om je eerst te concentreren op het verbeteren van de opbrengst van een MP door een basisproductieprotocol op te stellen en vervolgens de MP-kwaliteit te optimaliseren door de reactie- en vouwomstandigheden te verfijnen. De afwezigheid van fysiologische processen in CF-lysaten en hun verminderde complexiteit resulteren in hoge slagingspercentages voor de efficiënte productie van parlementsleden25. Routinematige overwegingen voor het ontwerp van DNA-sjablonen en optimalisatie van mg2 + ionenconcentratie zijn in de meeste gevallen voldoende om bevredigende opbrengsten te verkrijgen26. Afhankelijk van de expressiemodus kan optimalisatie van mp-kwaliteit tijdrovend worden, omdat een grotere verscheidenheid aan parameters moet worden gescreend 14,17,22.

Om het beschreven CF-expressieplatform vast te stellen, zijn protocollen nodig voor de productie van E. coli CF-lysaat (i), T7-RNA-polymerase (ii), nanodiscs (iii) en de basis CECF-reactieverbindingen (iv) (figuur 1). De E. coli K12 stam A1927 of BL21 derivaten worden vaak gebruikt voor de bereiding van efficiënte S30 (centrifugatie bij 30.000 x g) lysaten. Naast S30-lysaten mogen overeenkomstige lysaten worden gebruikt die bij andere g-krachten zijn gecentrifugeerd (bv. S12). De lysaten verschillen in expressie-efficiëntie en in proteoomcomplexiteit. Het proteoom van het S30-lysaat, bereid door het beschreven protocol, is in detail bestudeerd28. Het S30-proteoom bevat nog steeds enkele resterende buitenmembraaneiwitten die achtergrondproblemen kunnen geven bij expressie en analyse van ionkanalen. Voor dergelijke doelen wordt het gebruik van S80-S100-lysaten aanbevolen. Een waardevolle wijziging tijdens de lysaatvoorbereiding is de inductie van de SOS-respons door gecombineerde hitteschok- en ethanoltoevoer in de mid-log groeifase van de cellen. De resulterende HS30-lysaten zijn verrijkt met chaperones en kunnen worden gebruikt in mengsels met S30-lysaten voor verbeterdeMP-vouwing 22. CF-expressie in E. colilysaten wordt gebruikt als een gekoppeld transcriptie-/translatieproces met DNA-sjablonen die promotors bevatten die worden gecontroleerd door T7-RNA-polymerase (T7RNAP). Het enzym kan efficiënt worden geproduceerd in BL21(DE3) Stercellen die het pAR1219plasmide 29 dragen.

Twee kopieën van MSP1E3D1 worden samengevoegd tot één nanodisc met een diameter van 10-12 nm, maar het hieronder beschreven protocol kan ook werken voor andere MSP-derivaten. Nanodiscs groter dan die gevormd met MSP1E3D1 zijn echter meestal minder stabiel, terwijl kleinere nanodiscs gevormd met MSP-derivaten zoals MSP1 mogelijk geen grotere parlementsleden of MP-complexen herbergen. MSP1E3D1 nanodiscs kan in vitro worden geassembleerd met een grote verscheidenheid aan verschillende lipiden of lipidenmengsels. Voorgevormde nanodiscs zijn meestal stabiel voor > 1 jaar bij -80 °C, terwijl de stabiliteit kan variëren voor verschillende lipidecomponenten. Voor de screening van lipide-effecten op vouwen en stabiliteit van een MP, is het noodzakelijk om een uitgebreide set nanodiscs te bereiden die zijn samengesteld met een representatieve verscheidenheid aan lipiden / lipidemengsels. De volgende lipiden kunnen een goede startselectie geven: 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-fosfo-(1'-rac-glycerol) (DMPG), 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (DMPC), 1,2 dioleoyl-sn-glycero-3-fosfo-rac-(1-glycerol) (DOPG), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (DOPC), 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfo-(1'-rac-glycerol) (POPG) en 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-fosfocholine (POPC).

Een protocol voor de bereiding van een 3 ml CECF-reactie wordt beschreven. Verder omhoog of omlaag schalen in een verhouding van 1:1 is mogelijk. Voor de CECF-configuratie met twee compartimenten moet een RM worden bereid die alle verbindingen bevat en een FM die alleen de verbindingen met een laag molecuulgewicht bevat. Commerciële dialyseapparaten van 3 ml met 10-14 kDa MWCO kunnen worden gebruikt als RM-containers, die vervolgens in op maat gemaakte plexiglascontainers worden geplaatst met de FM (figuur 1D) 30. De verhouding van RM: FM is 1: 20, dus 60 ml FM moet worden voorbereid op 3 ml RM. Kwaliteit, concentratie of type van verschillende componenten kan van cruciaal belang zijn voor de uiteindelijke opbrengst en / of kwaliteit van de gesynthetiseerde MP (tabel 1). DNA-sjablonen moeten worden voorbereid volgens gepubliceerde richtlijnen en codonoptimalisatie van het leesframe van het doelwit kan de productopbrengst verder aanzienlijk verbeteren26. Voor cecf-reactie op preparatieve schaal wordt een vastgesteld protocol voor de productie van PR beschreven. Om expressieprotocollen voor nieuwe parlementsleden op te stellen, is het meestal nodig om optimalisatieschermen van bepaalde verbindingen uit te voeren (tabel 1) om de opbrengst en kwaliteit te verbeteren. Voor Mg2+ ionen bestaat een goed gericht concentratieoptimum dat vaak significante variatie vertoont voor verschillende DNA-sjablonen. Andere CF-reactieverbindingen zoals nieuwe partijen T7RNAP- of S30-lysaten kunnen de optimale Mg2+ concentratie verder verschuiven. Als voorbeeld wordt een typisch Mg2+ scherm binnen het bereik van 14-24 mM concentratie en in stappen van 2 mM beschreven. Elke concentratie wordt gescreend in duplicaten en in CECF-reacties op analytische schaal. Als CECF-reactiecontainer worden op maat gemaakte Mini-CECF-plexiglascontainers30 met de RM gebruikt in combinatie met standaard 24-well microplaten die de FM vasthouden (figuur 1B). Als alternatief kunnen commerciële dialysecartridges in combinatie met 96-diepe putmicroplaten of andere commerciële dialysatorapparaten in geschikte opstellingen worden gebruikt (figuur 1C).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Bereiding van S30-lysaat

  1. Dag 1: Streep cellen uit glycerolvoorraden op een LB-agarplaat en incubeer 's nachts bij 37 °C.
  2. Dag 2: Ent 200 ml LB-medium in met de cellen van de agarplaat en incubeer bij 37 °C gedurende 12-14 uur.
  3. Dag 3: Ent 10 L steriel YPTG-medium (10 g/L gistextract, 16 g/L trypton, 5 g/L NaCl, 19,8 g/L glucose, 4,4 mM KH2PO4, 8 mM K2HPO4) getemperd tot 37 °C in een 15 L geroerde tankreactor met 100 ml van de voorcultuur (1:100). Telen bij 37 °C, 500 tpm en hoge beluchting (~ 3 luchtvolumes per minuut). Om overmatig schuimen te voorkomen, voegt u steriel antischuim toe.
  4. Meet de optische dichtheid (OD) bij 600 nm in regelmatige tijdsintervallen. Na ongeveer 2 uur komt de kweek in de log-fase.
  5. Modificatie voor HS30 lysaat: Wanneer cellen zich in de middenlogfase bevinden (OD600 ≈ 3,6-4,2), voeg dan 300 ml ethanol toe aan het kweekmedium en ga verder met de teelt bij 42 °C, 500 tpm en hoge beluchting (ongeveer 3 luchtvolumes per minuut) gedurende nog eens 45 minuten. Ga vervolgens verder met het koelen en oogsten van de celcultuur zoals beschreven in stap 1.6. Voor de productie van standaard S30-lysaat slaat u deze stap over en gaat u verder met stap 1.6.
  6. Wanneer cellen zich in de middenlogfase bevinden (OD600 ≈ 3,6-4,2), koelt u de fermentor binnen < 30 min. De uiteindelijke OD600 zou ongeveer 4,5-5,5 moeten zijn. Oogst cellen bij 4.500 x g gedurende 20 minuten bij 4 °C en gooi het supernatant weg. Houd cellen op 4 °C gedurende de volgende stappen.
    OPMERKING: Tijdens het afkoelen kan overmatig schuimvorming optreden. Voeg in dit geval antischuim toe of verlaag de roersnelheid en/of verlaag de luchtstroom in de bioreactor.
  7. Suspensie cellen volledig in 300 ml S30-A-buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,2, 14 mM Mg(OAc)2, 60 mM KCl, 6 mM 2-mercaptoethanol) met behulp van een spatel gevolgd door het pipetteren van de suspensie op en neer tot homogeniteit. Centrifugeer bij 8.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Herhaal deze stap twee keer.
    LET OP: 2-mercaptoethanol is giftig. Vermijd contact met de huid of de luchtwegen. Werk indien mogelijk onder een motorkap. Weeg het lege centrifugebeker voor de laatste wasstap. Weeg na het centrifugeren de natte celpellet en ga verder met stap 1.8 of bewaar de pellet tot verder gebruik.
    OPMERKING: Het gewicht van de natte celkorrel is 5-7 g per 1 L bioreactorcultuur. Op dit punt kan het protocol worden gepauzeerd en kan de pellet worden ingevroren in vloeibare stikstof en gedurende 4-8 weken bij -80 °C worden bewaard.
  8. Suspensie cellen grondig in 1,1 volumes (1 g = 1 ml) S30-B-buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,2, 14 mM Mg(OAc)2, 60 mM KOAc, 1 mM DTT, 1 tablet cOmpletete-proteaseremmer). Vul de suspensie in een voorgekoelde Franse persdrukcel en verstoor cellen bij 1.000 psig. Passeer cellen een keer door de Franse pers.
  9. Centrifugeer het lysaat bij 30.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 °C. Breng het supernatant over in een verse buis en herhaal de centrifugatiestap.
    OPMERKING: Een losse en slijmerige laag kan na de eerste centrifugatie bovenop de pellet aanwezig zijn, die niet met het supernatant mag worden overgebracht.
  10. Breng een hoge zout- en warmtestap aan om onstabiele lysaatcomponenten te verwijderen en mRNA uit ribosomen vrij te maken. Breng het lysaat op 0,4 M NaCl en incubeer bij 42 °C gedurende 45 minuten in een waterbad.
    OPMERKING: Deze stap zal een aanzienlijke precipitatievorming veroorzaken. Draai of keer de buis om tijdens de incubatie van tijd tot tijd.
  11. Breng de troebele suspensie (meestal 50-80 ml) over in dialysebuizen met een afsnijding van 10-14 kDa en dialyseer tegen 5 L S30-C buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,2, 14 mM Mg(OAc)2, 60 mM KOAc, 0,5 mM DTT). Verwissel de S30-C dialysebuffer na 2-3 uur en dialyseer nog eens 12-14 uur.
  12. Dag 4: Breng de gedialyseerde suspensie over in centrifugebuizen en centrifugeer bij 30.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 °C. Breng supernatant (S30 lysaat) over in verse buizen van 50 ml en meng voorzichtig. De eiwitconcentratie van het lysaat moet ongeveer 30-40 mg / ml zijn. Bevries aliquots (bijv. 0,5 ml, 1 ml) in vloeibare stikstof en bewaar bij -80 °C. De aliquots zijn > 1 jaar stabiel.

2. Expressie en zuivering van T7 RNA polymerase

  1. Dag 1: Ent 200 ml LB medium met 100 μg/ml ampicilline met vers vergulde BL21(DE3) Star x pAR1219 cellen en incubeer bij 37 °C en 180 tpm gedurende 12-16 uur.
  2. Dag 2: Ent 1 L geweldige bouillon (12 g/L trypton, 24 g/L gistextract, 4 ml/l glycerol) in een verbijsterde kolf van 2 l met 10 ml van de voorcultuur en incubeer bij 37 °C en 180 tpm roeren. De beginnende OD600 zou ongeveer 0,1 moeten zijn.
  3. Wanneer de OD600 0,6-0,9 bereikt, voegt u IPTG toe aan een eindconcentratie van 1 mM om T7RNAP-expressie te induceren en de teelt nog eens 5 uur voort te zetten.
  4. Oogst cellen door centrifugeren bij 4.500 x g gedurende 20 minuten bij 4 °C. Vries cellen in vloeibare stikstof en bewaar bij -80 °C.
    OPMERKING: Het protocol kan hier worden onderbroken.
  5. Dag 3: Voeg 30 ml ijskoude suspensiebuffer (30 mM Tris-HCl, pH 8,0 met één tablet cOmplete-proteaseremmer) toe aan de bevroren celpellet en ontdooi de pellet in een waterbad bij kamertemperatuur. Hang vervolgens de pellet op door op en neer te pipetteren tot de homogeniteit.
  6. Voer celverstoring uit met behulp van een Franse pers zoals beschreven in de vorige sectie of gebruik een ultrasoonapparaat volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Vervolgens centrifugeren bij 20.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 °C en supernatant overbrengen in een verse buis.
  7. Om genomisch DNA neer te slaan, voegt u streptomycinesulfaat langzaam en onder zachte agitatie toe aan het supernatant totdat een uiteindelijke concentratie van 3% (w / v) is bereikt. Incubeer bij 4 °C gedurende 5-10 minuten onder voorzichtig roeren. Centrifugeer bij 20.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 °C.
  8. Filtreer het supernatant met een filter van 0,45 μm en laad het op een Q-Sepharose-kolom met een kolomvolume (CV) van 40 ml met 2 CV-equilibratiebuffer (30 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM EDTA, 50 mM NaCl, 5% glycerol en 10 mM 2-mercaptoethanol) met behulp van een peristaltische pomp met een debiet van 4 ml / min. Sluit vervolgens de kolom aan op een UV-detector en ga door met elutie met equilibratiebuffer totdat het UV-signaal bij 280 nm een stabiele basislijn bereikt.
  9. Elute T7RNAP met een gradiënt van 50 mM tot 500 mM NaCl per CV bij een debiet van 3 ml/min. Verzamel 1 ml fracties en bereid monsters voor SDS-PAGE-analyse voor door 10 μL van elke fractie te mengen met 2 x SDS-monsterbuffer. Voer SDS-PAGE uit en kleur de gel met Coomassie Blue R. T7RNAP moet verschijnen als een prominente band op ongeveer 90 kDa, samen met tal van extra banden van onzuiverheden.
  10. Poolfracties die T7RNAP bevatten en dialyseren met behulp van membranen met een 12-14 kDa MWCO gedurende 12-16 uur in dialysebuffer (10 mM K2HPO4/KH2PO4, pH 8,0, 10 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 1 mM DTT, 5% (w/v) glycerol).
  11. Dag 4: Verzamel de T7RNAP-oplossing en concentreer met behulp van filtereenheden met 12-14 MWCO tot een eindconcentratie van 3-10 mg / ml. T7RNAP kan tijdens de concentratie beginnen neer te slaan. Stop de concentratie onmiddellijk zodra troebelheid in het monster optreedt. Voeg glycerol toe aan een eindconcentratie van 50% (g/v) en meng voorzichtig. Shock-freeze 0,5-1 ml aliquots en bewaren bij -80 °C. Werkende T7RNAP aliquots kunnen worden bewaard bij -20 °C.
    OPMERKING: Ongeveer 20-40 ml van 5 mg / ml gedeeltelijk gezuiverde T7RNAP met 20.000-40.000 eenheden moet worden verkregen uit een fermentatie van 1 l. Om de optimale hoeveelheid van elke T7RNAP-batch te testen, moeten CF-expressiereacties van groen fluorescerend eiwit (GFP) met 0,02 mg/ml-0,1 mg/ml van het bereide T7RNAP-monster worden uitgevoerd.

3. Expressie en zuivering van MSP1E3D1

  1. Dag 1: Transformeer E. coli BL21 (DE3) Stercellen met de pET28(a)-MSP1E3D1 vector31 met behulp van standaard heat shock transformatie of elektroporatie protocollen. Streep uit of plaat getransformeerde cellen op LB agar met 30 μg/ml kanamycine en incubeer bij 37 °C gedurende 12-16 uur.
  2. Dag 2: Ent 200 ml LB-medium aangevuld met 0,5% (w /v) glucose en 30 μg / ml kanamycine met een enkele kolonie geplukt uit de agarplaat en incubeer bij 37 ° C bij 180 tpm gedurende 12-16 uur.
  3. Dag 3: Ent 10 L LB medium aangevuld met 0,5% (w/v) glucose en 30 μg/ml kanamycine met 100 ml van de voorcultuur in een geroerde bioreactor. Voer fermentatie uit bij 37 °C, 500 rpm en beluchting van ongeveer 3 bioreactorvolumes per minuut. Voeg in het geval van overmatig schuimen antischuim toe.
    OPMERKING: Verbijsterde schudkolven kunnen worden gebruikt in plaats van een fermentor.
  4. Voeg bij OD600 van 6,5-7,5 IPTG toe aan een eindconcentratie van 1 mM en zet de incubatie bij 37 °C gedurende 1 uur voort. Oogst cellen door centrifugeren bij 4.500 x g gedurende 20 minuten bij 4 °C. Was celpellets met 200 ml 0,9% (w/v) NaCl en centrifugeer opnieuw bij 8.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Gooi supernatant weg en breng cellen over in buizen van 50 ml met behulp van een spatel. Het verwachte natte pelletgewicht is 8-12 g per L bioreactorcultuur. Bevries celpellets in vloeibare stikstof en bewaar bij -80 °C tot verder gebruik.
    OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd.
  5. Dag 4: Voor zuivering ontdooien celpellets in een waterbad bij RT. Suspensie de cellen in MSP-A buffer (40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 300 mM NaCl, 1% (w/v) Triton X-100, 1 tablet c0mplete protease inhibitor cocktail per 50 ml celsuspensie) om een celsuspensie van 30-40% (w/v) op te leveren.
  6. Verstoor cellen door ultrasoonapparaat of met behulp van een Franse pers en centrifugeer bij 30.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 °C. Breng het supernatant over in een verse buis en filtreer door een filter van 0,45 μm. Breng het filtraat aan op een Ni2+ geladen nitrilotriacetinezuurkolom (CV > 15 ml) in evenwicht met 5 CV MSP-B-buffer (40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 300 mM NaCl, 1% (w/v) Triton X-100) met behulp van een peristaltische pomp.
    OPMERKING: Om filtratie te vergemakkelijken, kan het supernatant nog een minuut worden gesoniseerd om grote DNA-fragmenten af te breken.
  7. Was na het laden van het monster de kolom met 5 CV MSP-B, 5 CV MSP-C (40 mM Tris-HCl, pH 8,9, 300 mM NaCl, 50 mM ylzuur), 5 CV MSP-D (40 mM Tris-HCl, pH 8,9, 300 mM NaCl), 5 CV MSP-E (40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 300 mM NaCl) en 5 CV MSP-F (40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 300 mM NaCl, 50 mM imidazool).
    OPMERKING: Cholzuur in de MSP-C-buffer is belangrijk om lipiden te verwijderen die aan MSP zijn bevestigd. Cholzuur is niet volledig oplosbaar bij lage pH-waarden. De pH-waarde moet daarom worden aangepast naar 8,9 in MSP-C en MSP-D. Het is belangrijk om de kolom te wassen met MSP-D-buffer, omdat een lagere pH ervoor kan zorgen dat resterend cholzuur neerslaat en de kolom blokkeert of beschadigt.
  8. Elute MSP met MSP-G (40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 300 mM NaCl, 300 mM imidazool). Verzamel fracties van 1 ml en controleer de UV-absorptie bij 280 nm. Verzamel en pool de fracties van de elutiepiek.
  9. Breng gepoolde MSP-fracties over in 12-14 kDa MWCO dialysemembraanbuizen en dialyseer tegen 5 L MSP-H (40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 300 mM NaCl, 10% (w/v) glycerol) gedurende 2-3 uur bij 4 °C. Wissel over op verse 5 L MSP-H buffer en dialyseer nog eens 12-16 uur bij 4 °C.
  10. Dag 5: Breng MSP-oplossing over in centrifugebuizen en centrifugeer bij 18.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 °C om neerslag te verwijderen. Breng supernatant over in een verse buis en concentraat tot 200-800 μM met behulp van ultrafiltratie-apparaten met 12-14 kDa MWCO bij 4 °C. Meet de concentratie met behulp van een UV/VIS-meetapparaat. Gebruik de extinctiecoëfficiënt van 27,31 M-1 cm-1 en de molecuulmassa van 31,96 kDa voor de berekening van de concentratie.
    OPMERKING: Expressie in een bioreactor levert meestal 15-30 mg MSP1E3D1 per L-cultuur op.
  11. Bevries aliquots van de geconcentreerde MSP-oplossing in vloeibare stikstof en bewaar bij -80 °C.

4. Assemblage van MSP1E3D1 nanodiscs

  1. Dag 1: Bereid 1-2 ml lipidevoorraden (DMPG, DOPG, POPG DMPC, DOPC of POPC) in 100 mM natriumsirolaat. Bewaren bij -20 °C indien niet op dezelfde dag gebruikt.
    OPMERKING: De lipide-oplossing moet duidelijk zijn. Als de oplossing niet helder is, kan de natrium cholaatconcentratie worden verhoogd tot 150 mM.
  2. Meng de MSP1E3D1-oplossing met de lipidenoplossing. Voeg dodecylfosfocholine (DPC) toe in een eindconcentratie van 0,1% (w/v). Assemblagereacties kunnen worden aangepast tot eindvolumes van 3 ml (tabel 2) of 12 ml, wat overeenkomt met typische volumes dialysecassettes (10 kDa MWCO). Incubeer de assemblagereacties gedurende 1 uur bij 21 °C onder voorzichtig roeren.
    OPMERKING: Voor elk lipide moet een specifieke MSP1E3D1:lipideverhouding worden gebruikt om een homogene nanodisc-voorbereiding te garanderen (tabel 2). Voor nieuwe lipiden of lipidenmengsels moet de optimale verhouding worden bepaald met een proefexperiment en een chromatografieanalyse van degrootte-uitsluiting 14.
  3. Maak het membraan van een dialysecassette met schijfvormingsbuffer (DF) (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM NaCl) vooraf nat. Breng het assemblagemengsel met een spuit over in de dialysecassette. Potentiële luchtbellen kunnen worden verwijderd door aspiratie met behulp van de spuit.
  4. Dag 1-4: Dialyseer tegen 3 x 5 L DF buffer gedurende 10-20 h bij RT onder roeren met behulp van een roerstaaf. Breng vervolgens het assemblagemengsel van de dialysecassette over in centrifugale filtereenheden met 10 kDa MWCO in evenwicht met DF-buffer. Concentraat bij 4.000 x g bij 4 °C.
    OPMERKING: Een troebele dialysemix kan wijzen op een verkeerde stoichiometrische verhouding van MSP:lipide. Neerslag moet worden verwijderd bij 18.000 x g gedurende 20 minuten bij 4 °C vóór de concentratie van het monster. Om neerslag tijdens de monsterconcentratie te voorkomen, gebruikt u ultrafiltratie-eenheden met een grote deadstop.
  5. Concentreer de geassembleerde nanodiscs tot een concentratie van ten minste 300 μM. Meet de concentratie met behulp van een UV/VIS-lezer. Bedenk dat één nanodisc wordt gevormd door twee MSP1E3D1-moleculen en dus moet de concentratie MSP worden gedeeld door 2 om de juiste hoeveelheid nanodiscs te bepalen.
    OPMERKING: De beschreven opstelling (tabel 2) levert 0,6-1 ml van een nanodisc-oplossing van 300 μM op.
  6. Centrifugeer het geconcentreerde nanodisc-preparaat bij 18.000 x g gedurende 20 minuten bij 4 °C om neerslag te verwijderen. Aspirateer vervolgens het supernatant en bevries 50 μL aliquots in vloeibare stikstof en bewaar bij -80 °C.
    OPMERKING: Het is raadzaam om het succes van nanodisc-vorming te evalueren met behulp van grootte-uitsluitingschromatografie. Het monster moet monodisperse zijn en mag slechts een kleine hoeveelheid aggregaten bevatten. Aggregaten geven aan dat de hoeveelheid lipide in de opstelling te hoog is. Als referentie kan gezuiverde MSP1E3D1 worden gebruikt. Als het nanodisc-preparaat een piek vertoont op de hoogte van de referentie MSP1E3D1-piek, was de gekozen lipide-MSP13D1-verhouding te laag.

5. Preparatieve schaal 3 ml CECF-reactie-instelling

  1. Dag 1: Bereid alle benodigde voorraadoplossingen voor zoals vermeld (tabel 3). De voorraden worden opgeslagen bij -20 °C en ontdooid bij kamertemperatuur. Zorg ervoor dat u alle voorraden grondig mengt na het ontdooien en voor het pipetteren. Bereken de benodigde volumes voor alle voorraden en maak een pipetteerschema (tabel 4). Verbindingen met een hoog molecuulgewicht worden alleen aan de RM toegevoegd. Voor de verbindingen met een laag molecuulgewicht kan een gecombineerde 3 x mastermix voor RM en FM worden bereid.
    OPMERKING: De uiteindelijke volumes van samengestelde mengsels kunnen minder zijn dan berekend als gevolg van volumeverlies tijdens het mengen. Dit kan worden vermeden door een overtollig volume van 2-5% toe te voegen om volumeverlies te compenseren.
  2. Equilibrate het membraan van een 3 ml dialysecassette in 100 mM Tris-acetaat, pH 8,0. Zorg ervoor dat u overtollige buffer verwijdert.
  3. Gebruik een spuit om de RM in de dialysecassette over te brengen. Verwijder overtollige lucht in het RM-compartiment door aspiratie met de spuit. Plaats de dialysecassette in de dialysekamer.
  4. Vul de dialysekamer met 60 ml FM. Plaats het deksel op de kamer en draai de schroeven vast om deze te bevestigen. Incubeer de kamer gedurende 12-16 uur bij 30 °C bij 200 tpm.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de kamer tijdens het roeren rechtop blijft staan, anders wordt de uitwisseling van laagmoleculaire verbindingen belemmerd.
  5. Dag 2: Gebruik een spuit om de RM uit de dialysekamer te zuigen. Breng de RM over in verse buizen en centrifugeer bij 16.000 x g bij 4 °C gedurende 10 minuten om neerslag te verwijderen. Breng het supernatant over in verse buizen. Het eiwit in het supernatant kan nu verder geanalyseerd worden.
    OPMERKING: In sommige gevallen zal een pellet aanwezig zijn na centrifugeren. Dit kan belangrijke informatie opleveren over de geschiktheid van de geanalyseerde nanodiscs of de reactieverbindingen om het gesynthetiseerde MP oplosbaar te houden. Het is daarom raadzaam om de hoeveelheid doelwit die mogelijk aanwezig is in het neerslag te analyseren met behulp van SDS-PAGE, Western Blot of door visuele evaluatie van de pelletgrootte.

6. Analytische schaal 60 μL CECF-reactie-instelling voor Mg2+ ionenscreening

  1. Dag 1: Meng alle componenten van de respectievelijke 3x master mix en verdeel 60 μL over de RM en 825 μL over de FM. Vul FM met H2O en meng FM door vortexing. Breng FM over in 3 putten van de 24 putjes microplaat (tabel 5).
    OPMERKING: Aangezien de aangepaste Mini-CECF-container mogelijk niet toegankelijk is, worden de volumes in tabel 5 berekend voor een reactie die wordt uitgevoerd in dialysepatronen (10-14 kDa MWCO, RM: 100 μL) met een FM-volume van 1,7 ml in 96 deep-well (2 ml) platen (figuur 1).
  2. Snijd geregenereerde cellulosedialysebuizen met een 10-14 kDa MWCO in stukken van ongeveer 25 x 20 mm en bewaar in H2O met 0,05% (w/v) natriumazide.
    LET OP: Natriumazide is zeer giftig. Vermijd elk contact met de huid of het slijmvlies. Gebruik geen metalen containers omdat natriumazide kan reageren met metalen om explosieve metaalaziden te vormen.
  3. Verwijder vóór de assemblage van de Mini-CECF-container overtollige H2O uit de dialysemembranen met een tissue. Plaats een membraanstuk op elke container en bevestig de membranen met een polytetrafluorethyleenring.
  4. Breng de Mini-CECF-container over in de putjes van een 24-wellsplaat met 825 μL FM. Vermijd luchtbellen onder het dialysemembraan van de Mini-CECF-container.
  5. Voeg hoogmoleculaire componenten toe aan de RM zoals beschreven (tabel 5) en meng door op en neer te pipetteren. Voeg 60 μL toe aan de reactiecontainer. Vermijd luchtbellen tijdens de overdracht van de viskeuze oplossing.
  6. Snijd 2 vellen van 8 x 10 cm van een afdichtende thermoplastische film en wikkel ze rond de 24-wellsplaat met de reactiecontainers erin. Dit vermindert de verdamping van het reactiemengsel. Plaats nu het deksel van de celkweekplaat op de plaat en bevestig deze met tape. Incubeer de plaat bij 30 °C en 200 tpm roeren gedurende 12-16 uur.
  7. Dag 2: Oogst het reactiemengsel door met de pipetpunt bij de Mini-CECF-container door het dialysemembraan te prikken en de RM aan te zuigen. Breng RM over in verse buizen en centrifugeer bij 16.000 x g bij 4 °C gedurende 10 minuten om neerslag te verwijderen. Breng het supernatant over in verse buizen. Het eiwit in het supernatant kan nu verder geanalyseerd worden.
    OPMERKING: In sommige gevallen zal na centrifugeren een pellet aanwezig zijn. Dit kan belangrijke informatie opleveren over de geschiktheid van de geanalyseerde nanodiscs of andere reactieverbindingen om het gesynthetiseerde MP oplosbaar te houden. Het is daarom raadzaam om de hoeveelheid doelwit die mogelijk aanwezig is in het neerslag te analyseren door SDS-PAGE, Western Blot of visuele evaluatie van de pelletgrootte.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De impact van fijnafstemmingsreactieverbindingen op de uiteindelijke opbrengst of kwaliteit van gesynthetiseerde parlementsleden wordt geïllustreerd. Een frequente routinebenadering is om de optimale Mg2+ concentratie in CF-reacties aan te passen door expressie van groen fluorescerend eiwit (GFP) als een handige monitor van systeemefficiëntie. Als voorbeeld werd GFP gesynthetiseerd uit een pET-21a(+) vector bij Mg2+ concentraties tussen 14 en 24 mM (figuur 2). Sds-PAGE-...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De opzet en strategieën om de CF-expressie en co-translationele invoeging van functionele parlementsleden in nanodiscs te optimaliseren, worden beschreven. De benodigde apparatuur bestaat uit een bioreactor, een Frans persapparaat of iets dergelijks, een UV/VIS- en fluorescentielezer, CF-reactievaten die geschikt zijn voor een configuratie-opstelling met twee compartimenten en een temperatuurgecontroleerde incubator. Andere standaarduitrusting zijn centrifuges voor het oogsten van E. coli-cellen en tafelcentrifu...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We willen de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) subsidie BE1911/8-1, het LOEWE project GLUE en het collaboratieve onderzoekscentrum Transport and Communication across Membranes (SFB807) bedanken voor financiële steun.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (natriumzout) (DMPG)Avanti Polar Lipids (USA)840445P
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (DMPC)Avanti Polar Lipids (USA)850345C
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (natriumzout) (DOPC)Avanti Polar Lipids (USA)850375C
1,2 dioleoyl-sn-glycero-3-fosfo-rac-(1-glycerol) (natriumzout) (DOPG)Avanti Polar Lipids (USA)840475C
1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-fosfocholine (POPC)Avanti Polar Lipids (USA)850457C
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfo-(1'-rac-glycerol) (natriumzout) (POPG)Avanti Polar Lipids (USA)840034C
2-amino-2-(hydroxymethyl)-propaan-1,3-diol (Tris)Carl Roth (Duitsland)4855
2-MercaptoethanolCarl Roth (Duitsland)4227
2-propanolCarl Roth (Duitsland)9781
[3H]-dihydroalprenoloolhydrochlorideAmerican Radiolabeled Chemicals (USA)ART0134
acetylfosfaat lithiumkaliumzout (ACP)Merck (Duitsland)1409
Adenosine 5'-trifosfaat (ATP)Sigma Aldrich (Duitsland)A9251
AlprenololhydrochlorideMerck (Duitsland)A0360000
Aanwisseling chromatografiekolom materiaal: Q-sepharose®Sigma-Aldrich (Duitsland)Q1126
Autoclaaf Type GE 446EC-1Gettinge (Duitsland)
Bioreactor Type 884 124/1B.Braun (Duitsland)
CentrifugeSorvall RC12BP+; Thermo Scientific (Duitsland); Sorvall RC-5C; Thermo Scientific (Duitsland); Mikro 22 R; Hettich (Duitsland)
CholzuurCarl Roth (Duitsland)8137
Coomassie Briljant Blauw R250Carl Roth (Duitsland)3862
Kweekkolven 500 ml verende kolven, 2 l verende kolvenSchott Duran (Duitsland)
Cytidine 5'-trifosfaat dinatriumzoutSigma-Aldrich (Duitsland)C1506
D-glucose monohydraatCarl Roth (Duitsland)6780
Di-kaliumwaterstoffosfaat trihydraatCarl Roth (Duitsland)6878
Dialyseslang SpectrumTM Labs Spectra/PorTM 12-14 kD MWCO Standaard RC slangFisher Scientific (Duitsland)8700152
DithiothreitolCarl Roth (Duitsland)6908
EthanolCarl Roth (Duitsland)K928
Folinic zuur calciumzout hydraatSigma-Aldrich (Duitsland)47612
French drukcel disructorSLM; Amico Instruments (USA)
GlycerolCarl Roth (Duitsland)3783
Guanosine 5'-trifosfaat di-natriumzout (GTP)Sigma-Aldrich (Duitsland)G8877
ZoutzuurCarl Roth (Duitsland)K025
IMAC kolom: HiTrap IMAC HP 5 mLGE Life Sciences (Duitsland)GE17-5248
ImidazolCarl Roth (Duitsland)3899
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG)Carl Roth (Duitsland)2316
KanamycineCarl Roth (Duitsland)T832
L-AlanineCarl Roth (Duitsland)3076.1
L-ArginineCarl Roth (Duitsland)6908
L-AsparagineCarl Roth (Duitsland)HN23
L-AsparaginezuurCarl Roth (Duitsland)T202
L-CysteïneCarl Roth (Duitsland)T203
L-GlutaminzuurCarl Roth (Duitsland)3774
L-GlutamineCarl Roth (Duitsland)3772
L-GlycineCarl Roth (Duitsland)3187
L-HistidineCarl Roth (Duitsland)3852
L-IsoleucineCarl Roth (Duitsland)3922
L-LeucineCarl Roth (Duitsland)1699
L-LysineCarl Roth (Duitsland)4207
L-MethionineCarl Roth (Duitsland)9359
L-ProlineCarl Roth (Duitsland)1713
L-FenylalanineCarl Roth (Duitsland)1709
L-SerineCarl Roth (Duitsland)4682
L-ThreonineCarl Roth (Duitsland)1738
L-TryptofaenCarl Roth (Duitsland)7700
L-TyrosineCarl Roth (Duitsland)T207
MD100 dialyse eenhedenScienova (Duitsland)40077
N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethaansulfonic acid (HEPES)Carl Roth (Duitsland)6763
n-dodecylfosfocholineAntrace (USA)F308S
PAGE kamer: Mini-Protean Tetra CellBiorad (Duitsland)

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pandey, A., Shin, K., Patterson, R. E., Liu, X. Q., Rainey, J. K. Current strategies for protein production and purification enabling membrane protein structural biology. Biochemistry and Cell Biology. 94 (6), 507-527 (2016).
  2. Ritchie, T. K., et al. Reconstitution of membrane proteins in phospholipid bilayer nanodiscs. Methods in Enzymology. 464 (09), 211-231 (2009).
  3. Frauenfeld, J., et al. A novel lipoprotein nanoparticle system for membrane proteins. Nature Methods. 13 (4), 345-351 (2016).
  4. Yang, Z., et al. Membrane protein stability can be compromised by detergent interactions with the extramembranous soluble domains. Protein Science. 23 (6), 769-789 (2014).
  5. Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
  6. Junge, F., et al. Advances in cell-free protein synthesis for the functional and structural analysis of membrane proteins. New Biotechnology. 28 (3), (2011).
  7. Smolskaya, S., Logashina, Y. A., Andreev, Y. A. Escherichia coli extract-based cell-free expression system as an alternative for difficult-to-obtain protein biosynthesis. International Journal of Molecular Sciences. 21 (928), 1-21 (2020).
  8. Bayburt, T. H., Grinkova, Y. V., Sligar, S. G. Self-assembly of discoidal phospholipid bilayer nanoparticles with membrane scaffold proteins. Nano Letters. 2 (8), 853-856 (2002).
  9. Katzen, F., Peterson, T. C., Kudlicki, W. Membrane protein expression: no cells required. Trends in Biotechnology. 27 (8), 455-460 (2009).
  10. Roos, C., et al. Characterization of co-translationally formed nanodisc complexes with small multidrug transporters, proteorhodopsin and with the E. coli MraY translocase. Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes. 1818 (12), 3098-3106 (2012).
  11. Cappuccio, J. A., et al. Cell-free co-expression of functional membrane proteins and apolipoprotein, forming soluble nanolipoprotein particles. Molecular and Cellular Proteomics. 7 (11), 2246-2253 (2008).
  12. Patriarchi, T., et al. Nanodelivery of a functional membrane receptor to manipulate cellular phenotype. Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).
  13. Shelby, M. L., He, W., Dang, A. T., Kuhl, T. L., Coleman, M. A. Cell-free co-translational approaches for producing mammalian receptors: expanding the cell-free expression toolbox using nanolipoproteins. Frontiers in Pharmacology. 10 (744), 1-12 (2019).
  14. Rues, R. B., Dötsch, V., Bernhard, F. Co-translational formation and pharmacological characterization of beta1-adrenergic receptor/nanodisc complexes with different lipid environments. Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes. 1858 (6), 1306-1316 (2016).
  15. Henrich, E., et al. Analyzing native membrane protein assembly in nanodiscs by combined non-covalent mass spectrometry and synthetic biology. eLife. 6, 1-19 (2017).
  16. Harris, N. J., Pellowe, G. A., Booth, P. J. Cell-free expression tools to study co-translational folding of alpha helical membrane transporters. Scientific Reports. 10 (1), 1-13 (2020).
  17. Henrich, E., et al. Lipid requirements for the enzymatic activity of MraY translocases and in vitro reconstitution of the lipid II synthesis pathway. Journal of Biological Chemistry. 291 (5), 2535-2546 (2016).
  18. Peetz, O., et al. Insights into co-translational membrane protein insertion by combined LILBID-mass spectrometry and NMR spectroscopy. Analytical Chemistry. 89 (22), 12314-12318 (2017).
  19. Kigawa, T., et al. Preparation of Escherichia coli cell extract for highly productive cell-free protein expression. Journal of Structural and Functional Genomics. 5 (1-2), 63-68 (2004).
  20. Schwarz, D., et al. Preparative scale expression of membrane proteins in Escherichia coli-based continuous exchange cell-free systems. Nature Protocols. 2 (11), 2945-2957 (2007).
  21. Yang, J. P., Cirico, T., Katzen, F., Peterson, T. C., Kudlicki, W. Cell-free synthesis of a functional G protein-coupled receptor complexed with nanometer scale bilayer discs. BMC Biotechnology. 11 (57), (2011).
  22. Rues, R. B., Dong, F., Dötsch, V., Bernhard, F. Systematic optimization of cell-free synthesized human endothelin B receptor folding. Methods. 147 (1), 73-83 (2018).
  23. Keller, T., Gorboulev, V., Mueller, T. D., Dötsch, V., Bernhard, F., Koepsell, H. Rat organic cation transporter 1 contains three binding sites for substrate 1-methyl-4-phenylpyridinium per monomer. Molecular Pharmacology. 95 (2), 169-182 (2019).
  24. Matthies, D., et al. Cell-free expression and assembly of ATP synthase. Journal of Molecular Biology. 413 (3), 593-603 (2011).
  25. Schwarz, D., Daley, D., Beckhaus, T., Dötsch, V., Bernhard, F. Cell-free expression profiling of E. coli inner membrane proteins. Proteomics. 10 (9), 1762-1779 (2010).
  26. Haberstock, S., et al. A systematic approach to increase the efficiency of membrane protein production in cell-free expression systems. Protein Expression and Purification. 82, 308-316 (2012).
  27. Falkinham, J. O., Clark, A. J. Genetic analysis of a double male strain of Escherichia coli K12. Genetics. 78 (2), 633-644 (1974).
  28. Foshag, D., et al. The E. coli S30 lysate proteome: A prototype for cell-free protein production. New Biotechnology. 40, 245-260 (2018).
  29. Davanloo, P., Rosenberg, A. H., Dunn, J. J., Studier, F. W. Cloning and expression of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81 (7), 2035-2039 (1984).
  30. Reckel, S., et al. Strategies for the cell-free expression of membrane proteins. Methods in Molecular Biology. 607, 187-212 (2010).
  31. Denisov, I. G., Baas, B. J., Grinkova, Y. V., Sligar, S. G. Cooperativity in cytochrome P450 3A4: Linkages in substrate binding, spin state, uncoupling, and product formation. Journal of Biological Chemistry. 282 (10), 7066-7076 (2007).
  32. Scholz, O., Thiel, A., Hillen, W., Niederweis, M. Quantitative analysis of gene expression with an improved green fluorescent protein. European Journal of Biochemistry. 267 (6), 1565-1570 (2000).
  33. Henrich, E., et al. From gene to function cell-free electrophysiological and optical analysis of ion pumps in nanodiscs. Biophysical Journal. 113 (6), 1331-1341 (2017).
  34. Shen, H. H., Lithgow, T., Martin, L. L. Reconstitution of membrane proteins into model membranes: Seeking better ways to retain protein activities. International Journal of Molecular Sciences. 14 (1), 1589-1607 (2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Celvrije expressieeiwitvouwingdetergentvrijlipidesamenstellingproteorhodopsineGPCRstructurele analyse

Gerelateerde artikelen