Driedimensionale adipocytencultuur als model om door cachexie geïnduceerde remodellering van wit vetweefsel te bestuderen

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een driedimensionaal (3D) magnetisch printkweeksysteem dat dissectie van hermodellering van wit vetweefsel (WAT) mogelijk maakt, geïnduceerd door een geconditioneerd medium van kankercellen. Door gebruik te maken van een 3D-kweeksysteem van UCP1+-vetcellen die een groen fluorescerend eiwit (GFP) tot expressie brengen, kunnen beige vetcellen worden bestudeerd die bijdragen aan de remodellering van vetweefsel.

Samenvatting

Kankercachexie (CC) presenteert zich als een syndroom met meerdere manifestaties, waardoor een duidelijke metabole onbalans in meerdere organen ontstaat. Onlangs is voorgesteld dat cachectische verspilling wordt gestimuleerd door verschillende ontstekingsmediatoren, die de integratieve fysiologie van vetweefsel en andere weefsels zoals de hersenen en spieren kunnen verstoren. In dit scenario kan de tumor overleven ten koste van de gastheer. In recent klinisch onderzoek is de intensiteit van de uitputting van de verschillende vetophopingen negatief gecorreleerd met de overlevingsuitkomst van de patiënt. Studies hebben ook aangetoond dat verschillende stofwisselingsstoornissen de hermodellering van wit vetweefsel (WAT) kunnen veranderen, vooral in de vroege stadia van de ontwikkeling van cachexie. WAT-disfunctie als gevolg van weefselremodellering draagt bij aan de algehele cachexie, waarbij de belangrijkste modificaties in WAT bestaan uit morfo-functionele veranderingen, verhoogde adipocytenlipolyse, accumulatie van immuuncellen, vermindering van adipogenese, veranderingen in de populatie van voorlopercellen en de toename van "niches" die beige/brite-cellen bevatten.

Om de verschillende facetten van door cachexie geïnduceerde WAT-remodellering te bestuderen, met name de veranderingen in voorlopercellen en beige remodellering, was tweedimensionale (2D) cultuur de eerste optie voor in vitro studies. Deze benadering vat de complexiteit van WAT echter niet adequaat samen. Verbeterde assays voor de reconstructie van functionele AT ex vivo helpen bij het begrijpen van fysiologische interacties tussen de verschillende celpopulaties. Dit protocol beschrijft een efficiënt driedimensionaal (3D) printweefselkweeksysteem op basis van magnetische nanodeeltjes. Het protocol is geoptimaliseerd voor het onderzoeken van WAT-remodellering veroorzaakt door cachexie-geïnduceerde factoren (CIF's). De resultaten tonen aan dat een 3D-cultuur een geschikt hulpmiddel is voor het bestuderen van WAT-modellering ex vivo en nuttig kan zijn voor functionele schermen om bioactieve moleculen te identificeren voor toepassingen van individuele vetcelpopulaties en om de ontdekking van op WAT gebaseerde celanticachectische therapie te ondersteunen.

Inleiding

Levende organismen zijn samengesteld uit cellen in 3D-micro-omgevingen met een samenspel van cel-cel en cel-matrix en een uitgebreide transportdynamiek voor voedingsstoffen en cellen ^1,2. Het grootste deel van de fundamentele kennis die in de celbiologie is opgedaan, is echter gegenereerd met behulp van eenlaagse celcultuur (2D). Hoewel 2D-cultuur een aantal van de mechanistische vragen kan beantwoorden, geeft deze benadering onvoldoende een samenvatting van de natuurlijke omgeving waarin cellen zich bevinden en is het mogelijk onverenigbaar met het voorspellen van een complexe medicijnrespons¹. Bovendien voelen cellen hun fysieke omgeving door middel van mechanotransductie. Mechanische krachten worden namelijk vertaald naar biochemische signalen die uiteindelijk de genexpressiepatronen en het lot van de cel beïnvloeden. In de afgelopen decennia is 3D-weefselkweek naar voren gekomen als een nieuw in vitro hulpmiddel dat de in vivo micro-omgeving met een grotere getrouwheid kan nabootsen. Dit kan een aantal mechanistische valkuilen vermijden die worden gegenereerd door in vitro 2D-benaderingen³.

Kankercachexie (CC) wordt gedefinieerd als een syndroom met meerdere manifestaties, die een duidelijke metabole onbalans in meerdere organen veroorzaken. Tijdens de ontwikkeling van cachexie ondergaat WAT talrijke morfologische veranderingen die resulteren in verhoogde adipocytenlipolyse, accumulatie van immuuncellen, vermindering van adipogenese, veranderingen in de voorlopercelpopulatie en een toename van "niches" die beige/brite-cellen bevatten (beige remodellering)⁴. Het recapituleren van het mechanisme waarmee cachexie de WAT-remodellering beïnvloedt met behulp van in-vitromodellen vormt echter een aanzienlijke technische uitdaging. Inderdaad, een paar studies die probeerden de communicatie tussen tumor en weefsel te onderzoeken, hebben monolaagse in vitro celcultuur (2D) gebruikt, waardoor de complexiteit van de 3D-micro-omgeving van WAT wordt omzeild.

Hoewel verschillende experimentele benaderingen 3D-cultuur genereren, hebben drie verschillende assemblagemethoden de voorkeur om adiposferoïden te produceren: magnetische levitatie of printen⁵, hangende druppel⁶ en Matrigel-steigersystemen⁷. Ondanks dat ze geschikt zijn voor adiposferoïden, hebben deze systemen voor- en nadelen en moeten ze worden gekozen op basis van de kenmerken van elk experimenteel ontwerp. Op basis van de hierboven genoemde beperkingen werd de magnetische printmethode gebruikt om 3D-celculturen te genereren⁵. Deze methode maakt gebruik van een magnetische nanodeeltjesassemblage bestaande uit gouden nanodeeltjes en ijzeroxide, waardoor de printmethode geschikt is voor de meeste celtypen. Hier werden 3D-celculturen gebruikt om adipogenese te induceren en werden CIF's gebruikt om de omgevingsconditie van CC te reproduceren.

Protocol

1. Incubatie van 2D-cellen met magnetische nanodeeltjes

1. Kweek aanhangende 2D-culturen tot ~ 70% samenvloeiing met behulp van standaard celkweekprocedures.
2. Bereid de magnetische nanodeeltjesassemblage voor. Haal het uit de koelkast en laat het ongeveer 15 minuten opwarmen tot kamertemperatuur (20-25 °C)¹.
3. Gemengd medium: Voeg de magnetische nanodeeltjes rechtstreeks toe aan 12 ml medium in celkweekplaten van 100 mm. Susbel en suspendeer het medium een paar keer om een homogene verdeling van de nanodeeltjes te verkrijgen.
   OPMERKING: Het medium zal donker lijken vanwege de bruine kleur van het ijzeroxide. Een concentratie van 2,5 μl/^cm2 van het kweekoppervlak wordt aanbevolen.
4. Was de 100 mm 2D-kweekplaat drie keer met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
5. Voeg 12 ml van het gemengde medium uit stap 1.3 toe aan de celkweekplaten van 100 mm. Incubeer de platen een nacht in een incubator (37 °C, 5% CO₂) om de magnetische nanodeeltjes aan de cellen te kunnen hechten

2. Het creëren van 3D-culturen met sferoïde assemblage in platen met 96 putjes

1. Was de cellen na een nacht incubatie om resten en losse magnetische nanodeeltjes te verwijderen door de platen voorzichtig te roeren met 3 x 10 ml PBS.
2. Zuig de PBS op uit de petrischaal en maak de cellen los door incubatie met 0,25% trypsine-ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA)-oplossing gedurende 2-5 minuten bij 37 °C.
3. Terwijl u wacht tot de cellen zijn losgeraakt, desinfecteert u de magnetische schijven met 70% ethanol¹.
4. Nadat de cellen zijn losgekomen, voegt u serumbevattend medium toe met 4x het volume van de trypsine-EDTA-oplossing om het effect van trypsine te neutraliseren, en brengt u de suspensie vervolgens over in een conische buis.
5. Centrifugeer de suspensie bij 500 × g gedurende 10 minuten. Zuig de supernatant op en zorg ervoor dat u de pellet niet aanraakt.
   OPMERKING: Na centrifugatie moeten de cellen bruin lijken en moeten de celsuspensies in het medium donkerder lijken dan normaal. Cellen moeten eruitzien bezaaid met de nanodeeltjes¹.
6. Tel de cellen in suspensie en bereken het volume van de middelgrote volumes die nodig zijn om 3D-culturen te maken. Gebruik voor adiposferoïden 5.000 tot 10.000 cellen in 150 μL in platen met 96 putjes.
7. Plaats met behulp van een bioprintkit met 96 putjes een celafstotende plaat met 96 putjes bovenaan de Spheroid Drive.
8. Pipetteer 150 μL celsuspensie in elk putje van de plaat met 96 putjes en sluit de plaat zodat de cellen zich op de bodem kunnen ophopen in de vorm van een magneet.
9. Laat de plaat 1-2 uur op de sferoïde aandrijving in de broedmachine staan om een competente sferoïde op te leveren.
   OPMERKING: Deze culturen moeten er dicht en bruin uitzien en moeten op de plaat worden afgedrukt (Figuur S1). Figuur S2 toont een samenvattende workflow van de belangrijkste stappen van 3D magnetisch printen van sferoïde assemblage in platen met 96 putjes.

3. Inductie van witte adipogenese

1. Bereid onderhouds- en inductiemedia^{voor 8}; Bereid het inductiemedium voor elk gebruik voor.
   1. Bereid een onderhoudsmedium voor dat 5 μg/ml insuline bevat (10 mg/ml voorraad bewaard bij 4 °C gedurende één week) en 0,5 μM rosiglitazon (10 mM voorraad in dimethylsulfoxide (DMSO)).
   2. Bereid inductiemedium voor dat 125 μM indomethacine bevat uit een voorraad ethanol van 0,125 M, 2 μg/ml dexamethason uit een voorraad van 2 mg/ml in ethanol, 0,5 mM isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) uit een voorraad van 0,25 M in DMSO en 0,5 μM rosiglitazon uit een voorraad van 10 mM in DMSO.
      OPMERKING: Verwarm indomethacine tot 60 °C om op te lossen.
2. Vervang na 24-48 uur printen van sferoïden het gewone complete medium door het inductiemedium (dag 0).
3. Vervang na 48 uur (dag 2) het inductiemedium door het onderhoudsmedium.
4. Vervang het medium elke 3-5 dagen totdat de cellen volledig gedifferentieerd zijn.
   OPMERKING: Over het algemeen differentiëren cellen na 7-8 dagen stimulatie met het inductiemedium tot rijpe vetcellen en worden ze gevuld met oliedruppels die aan de randen van de adiposferoïden kunnen worden bekeken.

4. Productie van Lewis-longcarcinoom geconditioneerd medium (LLC-CM)

1. Zaad Lewis longcarcinoom (LL/2) cellen in 100 mm celkweekplaten in groeimedium met een dichtheid van 6000 cellen/cm².
   OPMERKING: Het groeimedium bevat Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) met 10% foetaal runderserum (FBS) en 100 E/ml penicilline-streptomycine.
2. Vervang na 2 dagen het medium in elke plaat door vers groeimedium.
   OPMERKING: LL/2-cellen bevatten een heterogene mix van aanhangende (hoger aantal) en zwevende cellen.
3. Oogst na 2 dagen (dag 4) het geconditioneerde medium en ontdoe het van cellen en puin door centrifugatie (500 × g, 10 min).
4. Vries aliquots van het geconditioneerde medium in vloeibare stikstof in voor later gebruik.
   OPMERKING: Om sferoïden met het geconditioneerde medium te behandelen, gebruikt u een combinatie van 75% vers groeimedium en 25% LLC-geconditioneerd medium.

Resultaten

Adiposferoïden uit 3D-cultuur van stromale vasculaire fractie (SVF) cellen
Zowel 3D- als confluente 2D-culturen werden opgezet met hetzelfde aantal SVF-cellen uit hetzelfde WAT-preparaat van de liesverwekking van muizen (Figuur 1A, Figuur 1B) en onderworpen aan hetzelfde experimentele protocol om de genexpressiemarker te vergelijken. Sferoïden gestimuleerd met inductiemedium z...

Discussie

Dit protocol zet een 3D-celkweeksysteem op om de differentiatie van adipocyten te bestuderen in adiposferoïden die zijn afgeleid van primaire SVF-cellen van WAT. Vergeleken met conventionele 2D-aanhangende cultuur, vergemakkelijkt dit 3D-systeem AT-remodellering, die sterk lijkt op in vivo-omstandigheden. In de afgelopen jaren hebben studies aangetoond dat het kweken van cellen in 3D een andere cellulaire morfologie en signalering oplevert in vergelijking met een 2D-kweeksysteem

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
3-Isobutyl-1-methylxanthine	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	I-5879	Celcultuur
96-Well Bioprinting Kit, black	Greiner (Monroe, NC, USA)	655841	Celcultuur
Alexa Fluor 647 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	711-606-152	Immunofluorescencekleuring, secundair, 1:400 in TBS met 0,1% Tween-20
CELL CULTURE MICROPLATE, 96 WELL, PS, F-BOTTOM, µCLEAR, BLACK, CELLSTAR, CELL-REPELLENT SURFACE, LID, STERILE, 8 PCS./BAG	Greiner (Monroe, NC, USA)	655976	Celcultuur
Dexamethason	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	D-1756	Celcultuur
DMEM	Corning (Manassas, VA, USA)	10-017-CV	Celcultuur
Fetal Bovine Serum (Tova)	Gemini Bio (West Sacramento, CA)	100-500	Celcultuur
Indomethacine	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	I-7378	Celcultuur
Insulin	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	I0516	Celcultuur
LL/2 (LLC1) (ATCC CRL-1642)	American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)	CRL-1642	Lewis Longkanker cellijn
NanoShuttle-PL	Greiner (Monroe, NC, USA)	657843	Celcultuur
NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent (DAPI)	ThermoFisher (Waltham, MA, USA)	R37606	Immunofluorescencekleuring, volgens de instructies van de fabrikant
Pen strep	Corning (Manassas, VA, USA)	30-002-CI	Celcultuur
Perilipin-1 (D1D8) XP Rabbit mAb	Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA)	9349	Immunofluorescencekleuring, primair, 1:1000 in TBS met 0,1% Tween-20
Rosiglitazone	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	R-2408	Celcultuur
Trypsin-EDTA, 0,05%	Corning (Manassas, VA, USA)	25-052-CI	Celcultuur
Reverse-transcription PCR primers
Primer	Voorwaarts	Omgekeerd
Adipoq	GTTCCCAATGTACCCATTCGC	TGTTGCAGTAGAACTTGCCAG
Col4a1	TCCAAGGGCGAAGTGGGTTT	ACCCTTGCTCGCCTTTGACT
Cyclophilin a	ATGGCACTGGCGGCAGGTCC	TTGCCATTCCTGGACCCAAA
Fabp4	TGGTGACAAGCTGGTGGTGGAATG	TCCAGGCCTCTTCCTTTGGCTCA
Fn1	GCTTCCCCAACTGGTTACCCT	GGGTTGGTGATGAAGGGGGT
Pgc1a	GAAAACAGGAACAGCAGCAGAG	GGGGTCAGAGGAAGAGATAAAG
Ucp1	TCCTAGGGACCATCACCACCC	AGCCGGCTGAGATCTTGTTTCC
Muis genotypering
Primernaam	Beschrijving	Sequentie
Cre F	Generic Cre voorwaarts	GCG GTC TGG CAG TAA AAA CTA TC
Cre R	Generic Cre omgekeerd	GTG AAA CAG CAT TGC TGT CAC TT
oIMR7318	mT/mG voorwaarts	CTC TGC TGC CTC CTG GCT TCT
oIMR7319	mT/mG wild type omgekeerd	CGA GGC GGA TCA CAA GCA ATA
oIMR7320	mT/mG mutant omgekeerd	TCA ATG GGC GGG GGT CGT T
WH336	UCP1 mutant voorwaarts	CAA TCT GGG CTT AAC GGG TCC TC
WH337	UCP1 mutant omgekeerd	GTT GCA TCG ACC GGT TAA TGC AG
WH338	UCP1 wild type voorwaarts	GGT CAG CCT AAT TAG CTC TGT
WH339	UCP1 wild type omgekeerd	GAT CTC CAG CTC CTC CTC TGT C