Dit protocol heeft tot doel het hart en de longen van muizen te decellulariseren. De resulterende extracellulaire matrix (ECM) steigers kunnen immunos gekleurd en afgebeeld worden om de locatie en topologie van hun componenten in kaart te brengen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Decellularisatie van het Murine Cardiopulmonaal Complex
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
We presenteren hier een decellularisatieprotocol voor muizenhart en -longen. Het produceert structurele ECM-steigers die kunnen worden gebruikt om ECM-topologie en -samenstelling te analyseren. Het is gebaseerd op een microchirurgische procedure die is ontworpen om de luchtpijp en aorta van een geëuthanaseerde muis te katheteriseren om het hart en de longen te perfuseren met decellulariserende middelen. Het gedecellulariseerde cardiopulmonale complex kan vervolgens immunosijfd worden om de locatie van structurele ECM-eiwitten te onthullen. De hele procedure kan in 4 dagen worden voltooid.
De ECM-steigers die uit dit protocol voortkomen, zijn vrij van dimensionale vervormingen. De afwezigheid van cellen maakt structureel onderzoek van ECM-structuren tot submicronresolutie in 3D mogelijk. Dit protocol kan worden toegepast op gezond en ziek weefsel van muizen zo jong als 4 weken oud, inclusief muismodellen van fibrose en kanker, waardoor de weg wordt geopend om ECM-remodellering geassocieerd met cardiopulmonale ziekte te bepalen.
Inleiding
De ECM is een driedimensionaal netwerk gemaakt van eiwitten en glycanen dat alle cellen in een meercellig organisme herbergt, organen hun vorm geeft en het celgedrag gedurende het hele leven reguleert1. Vanaf de eicelbevruchting bouwen en hermodelleren cellen de ECM en worden er op hun beurt streng door gecontroleerd. Het doel van dit protocol is om een manier te openen om muis-ECM te analyseren en in kaart te brengen, omdat muizen het meest gebruikte modelorganisme zijn in de pathofysiologie van zoogdieren.
De ontwikkeling van deze methode werd gedreven door de noodzaak om metastase-geassocieerde native ECM2 te karakteriseren en te isoleren. Omdat tumoren geen goede anatomische vascularisatie hebben en muizen relatief kleine organismen zijn, werden microchirurgische procedures ontworpen om de aorta retrograde te katheteriseren, terwijl de circulatie van het belangrijkste vat dat naar een tumor leidt (bijvoorbeeld de longaders) wordt geïsoleerd, waardoor de reagensstroom wordt geconcentreerd en tumordecellularisatie mogelijk wordt. Deze methode produceert ECM-steigers met een geconserveerde structuur2 die immunostained en afgebeeld kunnen worden, waardoor ECM-structuur in submicron detail in kaart kan worden gebracht. Om dit protocol uit te voeren, is het noodzakelijk om chirurgische en microchirurgische vaardigheden te verwerven (dissectie, micros hechten en katheterisatie) die een mogelijke beperking van het gebruik ervan kunnen vormen. Voor zover wij weten, vertegenwoordigt deze methode de state-of-the-art voor native ECM-structuurbeeldvormingsanalyse2,3.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle procedures die hier zijn opgenomen, zijn beoordeeld en goedgekeurd door de ethische commissie voor experimentele geneeskunde aan de Universiteit van Kopenhagen en zijn in overeenstemming met de Deense en Europese wetgeving. Om dit protocol aan te tonen, hebben we vrouwelijke BALB / cJ-muizen van 8-12 weken oud en een MMTV-PyMT vrouwelijke muis van 11 weken oud gebruikt.
OPMERKING: Het vermijden van bacteriële besmetting van de gedecellulariseerde ECM-steiger geeft het beste beeldvormingsresultaat en maakt langdurige monsteropslag mogelijk. Het is daarom belangrijk om alle stappen steriel te houden. Als zodanig moeten alle instrumenten en chirurgisch materiaal, inclusief hechtdraad, micronaad, oplossingen, slangen, Luer-connectoren en katheters, steriel zijn. Oppervlakken, waaronder een polystyreenbak, moeten worden gedesinfecteerd met 70% ethanol en de perfusie moet bij voorkeur worden uitgevoerd onder een laminaire stroomkap. Alle procedures vinden plaats bij kamertemperatuur, tenzij anders aangegeven.
1. Postmortem microchirurgie
- Euthanaseer de muis met behulp van een CO2-kamer .
- Plaats de muis in een kamer van 4 L en begin te vullen met 100% CO2, beginnend bij 0,2 l / min gedurende 2 minuten, toenemend tot een stroom van 0,8 l / min na 3 minuten. De muis moet tijdens de eerste 2 minuten bewusteloos raken en dan moet de ademhaling stoppen (meestal ongeveer 5 minuten, maar de stroom kan indien nodig worden gehandhaafd). Bevestig de dood voordat u doorgaat naar de volgende stap.
- Scheer de thorax, buik en rug van de muis met de tondeuse en desinfecteer met 70% ethanol. Scheren vermindert het aantal artefacten aanzienlijk vanwege de aanwezigheid van haar op monsters voor beeldvorming of biochemische analyse.
- Pin de muis vast aan een polystyreenbak, waarbij de voor- en achterpoten worden verlengd, evenals de kop en staart. Plaats het onder de microchirurgiemicroscoop.
- Met behulp van een Mayo-schaar met recht patroon wordt chirurgische toegang tot stand gebracht met een cutane incisie die loopt van het submandibulaire gebied naar de onderbuik en subcutaan disseceert om de thoracale wand en het peritoneum bloot te leggen.
- Knip met behulp van een microchirurgische schaar de pectoralis major en pectoralis minor spieren langs de zesde intercostale ruimte aan beide zijden van de thoracale wand.
- Knip met een schaar met een recht patroon het borstbeen langs de vorige incisies en voltooi vervolgens een sternotomie door het borstbeen langs zijn lange as te snijden en vervolgens beide zijden van de thoracale wand te verheffen en vast te pinnen om het cardiopulmonale complex bloot te leggen.
- Gebruik micro-tang met ronde punt (of Dumont micro-tang) om de thymus en het omliggende vetweefsel te verwijderen door ze voorzichtig van hun aanhechtingen te trekken. Dit zal de belangrijkste schepen onthullen.
- Gebruik de cautery om de dalende cava-ader dicht te schroeien en knip met een rechte patroonschaar de slokdarm af.
- Met behulp van scherpe micro-tang, scheiden de brachiocephalische aderen en de brachiocephalic, links gemeenschappelijke halsslagaders en linker subclavia slagaders van het onderliggende weefsel om ligatie en cauterisatie te vergemakkelijken.
- Met behulp van micro-naaldhouder, scherpe micro-tang en 9-0 hechting plaatsen hechtingen boven de opkomst van de brachiocephalic, linkse gemeenschappelijke halsslagader en linker subclavia slagaders.
- Cauteriseer de brachiocephalische aderen.
- Scheid de submandibulaire speekselklieren langs de middellijn om de nekspieren en de luchtpijp bloot te leggen. Scheid de spieren om het cricothyroïde ligament bloot te leggen. Open met behulp van een microschaar een ingang door het ligament te snijden.
- Breng een katheter van 27 G in de luchtpijp en duw voorzichtig totdat de luchtpijp zich in de bronchiën vertakt (d.w.z. totdat de weerstand tegen de katheter is bereikt, trek dan 3 mm terug). Pas op dat u de bronchiën niet verstoort. Gebruik een 6-0 hechting en plaats 3 hechtingen rond de luchtpijp om de katheter vast te zetten.
- Sectie de muis ter hoogte van de 12e thoracale wervel. De dalende aorta loopt anterieur naar de wervelkolom en moet hier samen met de wervelkolom worden doorsneden. Zet de onderste helft apart.
- Katheteriseer de aorta retrograde en duw de katheter totdat deze de aortaboog bereikt. Gebruik 9-0 hechtdraad en plaats 4 hechtingen rond de aorta, beginnend 5 mm onder de katheterpunt.
2. Decellularisatie
- Sluit de muis aan op een pompsysteem met behulp van siliconen buizen en Luer-connectoren. Perfuseer met gedeïoniseerd water bij 200 μL/min gedurende 15 min. Handhaaf dit debiet tijdens decellularisatie.
- Verander het perfusiemiddel in 0,5% natriumdeoxycholaat (DOC) verdund in gedeïoniseerd water en perfundeer 's nachts.
- Verander het perfusiemiddel in 0,1% natriumdodecylfaat (SDS) verdund in gedeïoniseerd water en perfuseer gedurende 8 uur.
- Perfuseer een nacht met gedeïoniseerd water om SDS en DOC gedurende 24 uur weg te spoelen.
- Reseceer het gedecellulariseerde hart en de longen door de aanhechtingen aan de thorax te snijden met behulp van een gebogen schaar en bewaar in een steriele cryobuis met gedeïoniseerd water met 1% (v / v) penicilline-streptomycine en 0,3 μM natriumazide bij 4 °C. ECM-steigers kunnen minstens 12 weken worden bewaard1. Als de steiger zal worden gebruikt voor biochemische analyse (bijv. Massaspectrometrie), klik dan in vloeibare stikstof.
3. Immunostaining
- Plan de beeldvorming: bepaal primaire antilichamen (of antilichamen) en de combinatie van fluorescerend geconjugeerde secundaire antilichamen om bij elkaar te passen en om de laserlijnen van de fluorescentiemicroscoop te passen.
- Blokkeer het monster door het 's nachts onder te dompelen in een cryobuis met 6% (v/v) ezelserum - 3% (w/v) runderserumalbumine (BSA).
- Incubeer met primaire antilichamen (of antilichamen) in 3% ezelserum in PBS gedurende 24 uur.
- Was 5 keer gedurende 1 uur elke keer in 0,05% tween 20 in PBS (PBST).
- Incubeer het monster met fluorescerend geconjugeerd secundair antilichaam (of antilichamen) in 3% ezelserum in PBS gedurende 24 uur.
- Was 5 keer gedurende 1 uur in 0,05% (PBST). Wacht 1 uur tussen elke wasbeurt.
- Voeg gedeïoniseerd water toe en bewaar bij 4 °C uit de buurt van direct licht. Op dit punt is het schavot klaar om in beeld te komen.
4. Beeldvorming
- Plaats het monster in een schaal met glazen bodem en bevochtig het met twee druppels opslagoplossing (PBS of gedeïoniseerd water).
- Bereid het doel voor. We raden aan om een waterdompelingsdoelstelling te gebruiken.
- Inspecteer het monster met behulp van fluorescentielicht.
- Schakel over naar computerbesturing. Schakel lasers in en pas de laserintensiteit, pinhole-diafragma, detectorgolflengten, versterking, resolutie en zoom aan. Stel het aantal en de stapgrootte voor z-stack in en begin met acquisitie. We raden aan om multifoton laserexcitatie te gebruiken om de weefselpenetratie te vergroten en verstrooiing van licht, bleken en weefselschade te minimaliseren.
5. Hematoxyline-eosine kleuring
- Verwijder 1 longkwab van een geëuthanaseerde muis.
- Plaats in een cryomold van 10 mm x 10 mm x 5 mm en bedek deze met ongeveer 500 μL OCT-verbinding.
- Vries in op droogijs (-70 °C) en houd het monster op die temperatuur.
- Verwijder een gedecellulariseerde longkwab van een verwerkte muis volgens stap 2.5.
- Plaats in een cryomold met het grootste oppervlak naar beneden en bedek het met OCT-verbinding zoals gespecificeerd in stap 5.2.
- Vries in op droogijs (-70°C) en houd het monster op die temperatuur totdat anders nodig is. Het monster kan minstens 12 weken worden bewaard.
- Sectie bevroren weefselblokken bij -20 °C in een cryostaat met een dikte van 5 μm en plaats secties op zelfklevende glasplaten en bewaar bij -80 °C.
- Breng de glaasjes op kamertemperatuur totdat ze aan de lucht zijn gedroogd (ongeveer 20 min).
- Kort onderdompelen in PBS en fixeren door de dia's gedurende 15 minuten onder te dompelen in 4% paraformaldehyde in PBS. Was eenmaal in PBS gedurende 5 minuten en vervolgens tweemaal in gedestilleerd water gedurende 5 minuten.
- Dompel gedurende 10 minuten onder in de hematoxyline-oplossing van Mayer. Deze tijd kan worden geoptimaliseerd op basis van weefselbron en vlekvoorbereiding.
- Was in een Coplin pot onder stromend gedestilleerd water gedurende 10 min.
- Dompel gedurende 7 minuten onder in eosine-oplossing. Deze tijd kan worden geoptimaliseerd op basis van weefselbron en vlekvoorbereiding.
- Dip in 50% ethanol om overtollige eosine te verwijderen en uit te drogen door kort te dompelen in 70% ethanol en in 96% en 100% ethanol gedurende 30 seconden. Dip in xyleen meerdere keren.
- Breng enkele druppels DPX-montagemedium aan en plaats een glazen afdekplaat.
- Laat de glaasjes een nacht drogen onder een chemische kap.
- Dia's scannen in een diascanner.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Cardiopulmonale decellularisatie
Na het succesvol voltooien van het protocol zullen het hart en de longen, evenals het annexweefsel zoals de aortaboog, vrij zijn van cellen. Decellularisatie kan worden gevalideerd door hematoxyline-eosinekleuring (figuur 1) van de ECM-steigers die verwijdering van de kernen laten zien in vergelijking met het inheemse weefsel. Deze steigers behouden de afmetingen van verse organen en de onoplosbare ECM-stru...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Decellularisatietechnieken op basis van weefselagitatie veranderen de ECM-structuur, waardoor ze ongeschikt zijn voor ECM-structuuranalyse4. Perfusie-decellularisatie, met behulp van een anatomische route zoals de aorta van de luchtpijp, maakt het mogelijk om het capillaire bed of de terminale longblaasjes te bereiken en vergemakkelijkt de afgifte van decellulariserende middelen in het hele orgaan. Het gebruik van zwitterionische, anionische en niet-ionische detergentia om weefsel te decellularise...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
We bedanken Prof. Ivana Novak en Dr. Nynne Meyn Christensen (Centre for Advanced Bioimaging (CAB), Universiteit van Kopenhagen) voor het bieden van microscooptoegang. Dit werk werd ondersteund door de Europese Onderzoeksraad (ERC-2015-CoG-682881-MATRICAN; AEM-G, OW, RR en JTE); een PhD fellowship van de Lundbeck Foundation (R286-2018-621; MR); de Zweedse Onderzoeksraad (2017-03389; CDM); de Zweedse kankervereniging, Cancerfonden (CAN 2016/783, 19 0632 Pj, en 190007; CDM); Duitse kankerhulp (Deutsche Krebshilfe; RR); en de Deense kankervereniging (R204-A12454; RR).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| MICROCHIRURGISCHE TECHNIEKEN | |||
| 6-0 hechtdraad, rond lichaam, naald (Vicryl) | Ethicon | 6301124 | |
| 9-0 micro-naald (Safil) | B Braun | G1048611 | |
| Adson pincet | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Adson pincet met tanden | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Castroviejo micronaaldhouder | Fine Science Tools | nr. 12061-01 | |
| CO2 ventilatiekamer voor euthanasie van muizen | |||
| Gedeïoniseerd water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapuur labwatersysteem) | Merck | ZIQ7000T0 | |
| Weggeefpolystyreenbakje (~30 × 50 cm) | |||
| Dissectiemicroscoop (Greenough, met tweekoppige zwanenhals) | Leica | S6 D | |
| Dubbelzijdige microspatel | Fine Science Tools | 10091-12 | |
| Dumont micropincet (twee) | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Dumont micropincet met 45° uiteinden (twee) | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Haartjesknipmachine | Oster | 76998-320-051 | |
| Halsey naaldhaak (met bekken van wolfraamcarbide) | Fine Science Tools | 12500-12 | |
| Intraveneuze 24-gauge katheter (Insyte) | BD | 381512 | |
| Intraveneuze 26-gauge katheter (Terumo) | Surflo-W | SR+DM2619WX | |
| Mayo schaar (stevige snede, recht) | Fine Science Tools | 14110-15 | |
| Micropincet met ringvormige uiteinden (twee) | Aesculap | FM571R | |
| Microveer schaar (Vannas, gebogen) | Fine Science Tools | 15001-08 | |
| Minicutter | KLS Martin | 80-008-03-04 | |
| Molt Periostotome | Aesculap | D0543R | |
| Naalden (27 gauge; Microlance) | BD | 21018 | |
| Papierhanddoek (steriele) of chirurgische servet | |||
| Gekartelde schaar (CeramaCut, recht) | Fine Science Tools | 14958-09 | |
| Spatel (Freer-Yasargil) | Aesculap | OL166R | |
| Spuiten (1 mL; Plastipak) | BD | 3021001 | |
| Spuiten (10 mL; Plastipak) | BD | 3021110 | |
| Peenschaar (Walton) | Fine Science Tools | 14077-09 | |
| IMMUNOHISTOCHEMISCHE STALING | |||
| Alexa Fluor 488 ezel anti-guinea pig IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11055 | |
| Alexa Fluor 594 ezel anti-konijn IgG | Life Technologies | A11037 | |
| BSA(runde albumine fractie V, standaardkwaliteit, gelyofiliseerd) | Serva | 11930.03 | |
| Collageen IV polyklonaal antilichaam (RRID: AB_2276457) | Millipore | AB756P | Gastheer: konijn |
| PBS (pH 7.4, 10×, Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | Gastheer: geit |
| Periostijn polyklonaal antilichaam (een vriendelijk geschenk van Manuel Koch. RRID:AB2801621) | Gastheer: cavia | ||
| Scalpel wegwerpbaar met mes nr.11 (per stuk 10) | VWR | 233-5364) | |
| Serum (normaal ezelserum) | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416-50ML | |
| BEELDVORMING | |||
| Detectoren (hybride detector (Leica, HyD S model) en fotomultiplierbuizen (PMT's; ) | Leica | ||
| Fluorescentie lichtbron | Leica | EL6000 | |
| Microscoop (invers multifotonmicroscoop) | Leica | SP5-X MP | |
| Objectief (lambda blauw, 20×, 0,70 numerieke opening (NA) IMM UV) | Leica | HCX PL APO | |
| Twee-foton Ti–saffier laser (Spectra-physics, Mai Tai DeepSee model) | |||
| Witte-lichtlaser (WLL) | Leica | ||
| DECELLARISATIE | |||
| 70% Ethanol (absoluut alcohol 99,9%); absoluut alcohol moet worden aangepast naar 70% (vol/vol) met behulp van gedeïoniseerd water | Plum | 1680766 | |
| Gedeïoniseerd water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapuur labwatersysteem) | Merck | ZIQ7000T0 | |
| Luer-naar-slang mannelijke fittingen (1/8 inch) | World Precision Instruments | 13158-100 | |
| PBS (pH 7,4, 10×, Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | |
| Penicilline-streptomycine | Gibco | 15140122 | |
| Peristaltiekpomp (met 12 kanalen) | Ole Dich | 110AC(R)20G75 | |
| Siliconen slang (met 2 mm i.d. en 4 mm o.d.) | Ole Dich | 31399 | |
| Natriumaziet | Sigma-Aldrich | 08591-1ML-F | |
| Natrium deoxycholaat (DOC) | Sigma-Aldrich | D6750 |
Referenties
- Hynes, R. O. Extracellular matrix: not just pretty fibrils. Science. 326, 1216-1219 (2009).
- Mayorca-Guiliani, A. E., et al. ISDoT: in situ decellularization of tissues for high-resolution imaging and proteomic analysis of native extracellular matrix. Nature Medicine. 23, 890-898 (2017).
- Mayorca-Guiliani, A. E., et al. Decellularization and antibody staining of mouse tissues to map native extracellular matrix structures in 3D. Nature Protocols. 14, 3395-3425 (2019).
- White, L. J., et al. The impact of detergents on the tissue decellularization process: A TOF-sims study. Acta Biomaterialia. 50, 207-219 (2017).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nature Medicine. 14, 213-221 (2008).
- Uygun, B. E., et al. Organ re-engineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nature Medicine. 16, 814-820 (2010).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protocols. 9, 1682-1697 (2014).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7, 1983-1995 (2012).
- Wershof, E., et al. A FIJI Macro for quantifying pattern in extracellular matrix. BioRxiv. , (2019).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
