Method Article

Beoordeling van cardiale herprogrammering met behulp van High Content Imaging Analysis

DOI:

10.3791/61859

⸱

October 26th, 2020

 , 
1Department of Medicine, Division of Cardiovascular Medicine, Vanderbilt University Medical Center, 2Department of Cell and Developmental Biology, Vanderbilt University, 3Vanderbilt Center for Stem Cell Biology, Vanderbilt University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We presenteren een protocol om direct geherprogrammeerde geïnduceerde cardiomyocyt-achtige cellen (iCM's) in vitro te kwantificeren met behulp van beeldvormingsanalyse met een hoog gehalte. Deze methode stelt ons in staat om de efficiëntie van cardiale herprogrammering op een geautomatiseerde manier te kwantificeren en iCM's direct te visualiseren.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het doel van dit protocol is het beschrijven van een methode voor het kwantificeren van geïnduceerde cardiomyocyt-achtige cellen (iCM's), die direct in vitro worden geherprogrammeerd door een herprogrammeringstechniek. Cardiale herprogrammering biedt een strategie om nieuwe cardiomyocyten te genereren. Door cardiogene transcriptiefactoren in de kern in fibroblasten te introduceren; fibroblasten kunnen worden omgezet in iCM's zonder overgang door de pluripotente stamceltoestand. De conversieratio van fibroblasten naar iCM's blijft echter nog steeds laag. Dienovereenkomstig zijn er tal van aanvullende benaderingen geweest om de efficiëntie van cardiale herprogrammering te verbeteren. De meeste van deze onderzoeken beoordeelden de efficiëntie van cardiale herprogrammering met behulp van flowcytometrie, terwijl ze tegelijkertijd immunocytochemie uitvoerden om iCM's te visualiseren. Er zijn dus ten minste twee afzonderlijke reeksen herprogrammeringsexperimenten nodig om het succes van iCM-herprogrammering aan te tonen. Geautomatiseerde beeldvormingsanalyse met een hoog gehalte daarentegen zal zowel kwantificering als kwalificatie van iCM-herprogrammering met een relatief klein aantal cellen opleveren. Met deze methode is het mogelijk om met een enkel herprogrammeringsexperiment direct de kwantiteit en kwaliteit van iCM's te beoordelen. Deze aanpak zal toekomstige onderzoeken naar cardiale herprogrammering kunnen vergemakkelijken die grootschalige herprogrammeringsexperimenten vereisen, zoals het screenen van genetische of farmacologische factoren om de herprogrammeringsefficiëntie te verbeteren. Bovendien is de toepassing van een beeldvormingsanalyseprotocol met hoge inhoud niet beperkt tot cardiale herprogrammering. Het kan worden toegepast op het herprogrammeren van andere cellijnen, evenals op immunokleuringsexperimenten die zowel kwantificering als visualisatie van immunogekleurde cellen nodig hebben.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cardiale herprogrammering is ontwikkeld als een alternatieve benadering van stamcelgemedieerde benaderingen om nieuwe cardiomyocyten te genereren. Aangezien het niet door de stamceltoestand gaat, heeft het een groot potentieel om enkele overgeërfde beperkingen in stamcelgemedieerde benaderingen te omzeilen. Het is aangetoond dat virale infectie van ten minste drie of vier cardiogene transcriptiefactoren in fibroblasten fibroblasten kan omzetten in een cardiaal lot door fibroblastgenprogramma's te elimineren en cardiogene transcriptienetwerken in fibroblasten opnieuw op te bouwen 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13,14,15,16,17.

Sinds de eerste baanbrekende studie die cardiale herprogrammering in vitro1 aantoont, is het cardiale herprogrammeringsprotocol geoptimaliseerd door talrijke onderzoeken 3,5,6,7,9,11,12,13,14,15,16,18. Veelgebruikte technische benaderingen om cardiale fenotypes in fibroblasten te beoordelen na cardiale herprogrammering zijn flowcytometrie-analyse voor het kwantificeren van cellen die specifieke cardiomyocytmarkers tot expressie brengen en immunocytochemie voor het visualiseren van die cellen op een enkel celniveau. Hoewel beide experimenten (d.w.z. flowcytometrie en immunocytochemie) de expressie van cardiomyocytmarkers moeten aantonen met behulp van dezelfde antilichamen, moeten ze afzonderlijk worden uitgevoerd. Bovendien heeft flowcytometrie een relatief groter aantal cellen nodig, waardoor de hoeveelheid reagentia die nodig zijn voor het experiment toeneemt. Als alternatief kunnen positieve cellen van cardiomyocytenmarkers worden gekwantificeerd door handmatig te tellen na immunocytochemie. Het is echter erg arbeidsintensief en is meestal minder nauwkeurig.

Het doel van dit protocol is het beschrijven van de methode die iCM's kan kwantificeren en visualiseren door middel van een enkel immunokleuringsexperiment met behulp van geautomatiseerde beeldvormingsanalyse met hoge inhoud. Het vereist een relatief klein aantal startcellen omdat dit protocol wordt uitgevoerd in een putje met een plaat van 24 putjes. Er kunnen maar liefst drie verschillende markers tegelijk worden gebruikt. Enkele, dubbele en drievoudige positieve cellen kunnen automatisch worden gekwantificeerd. Naast kwantificering van immunogekleurde cellen, levert beeldvormingsanalyse met een hoog gehalte 2-100x objectieve beelden van hoge kwaliteit op. Indien nodig kunnen dezelfde immunogekleurde cellen die worden gebruikt bij beeldvormingsanalyse met een hoog gehalte opnieuw worden gebruikt voor verder beeldvormend onderzoek, zoals confocale microscopie. Het belangrijkste voordeel van dit protocol is dat het niet alleen een onbevooroordeelde kwantificering van iCM's met een veel kleiner aantal cellen biedt, maar ook visualisatie van iCM's. Bovendien kan dit protocol worden gebruikt voor het beoordelen van herprogrammering van niet-cardiale afstammingslijnen (bijv. herprogrammering van iPSC, neuronen en hepatocyten).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle dierprocedures werden uitgevoerd met de goedkeuring van het Vanderbilt University Medical Center Institutional Animal Care and Use Committee.

1. Retrovirusgeneratie en in vitro cardiale herprogrammering

  1. Kweek platina E-cellen in DMEM aangevuld met 10% FBS, 1% penicilline/streptomycine, 1 μg/ml puromycine en 10 μg/ml blasticidine totdat de platina E-celsamenvloeiing 70%-80% bereikt.
  2. Op dag 1, zaad ~0,55 x 106 cellen (eerste putje) en ~0,18 x 106 cellen (tweede putje) in twee afzonderlijke putjes van 12-well plaat met 1 ml DMEM aangevuld met 10% FBS en 1% penicilline/streptomycine een dag voorafgaand aan de eerste transfectie.
    OPMERKING: Er kunnen verschillende maten kweekschalen worden gebruikt, afhankelijk van de hoeveelheid virale media die nodig is voor de experimenten. Zie Tabel 1 voor andere schalen van experimenten.
  3. Transfecteer op dag 2 het quad-cistronic M-G-T-H retrovirale construct dat codeert voor Mef2c, Gata4, Tbx5 en Hand2 beschreven in de vorige studie9 of lege vector in platina E-cellen van de eerste put. Voeg 3 μL transfectiereagens toe aan 30 μL gereduceerde serummedia. Vijf minuten later, voeg 1 μg retrovirale constructie of de lege vector toe aan het mengsel van transfectiereagens en gereduceerde serummedia. Voeg na 20 minuten incubatie bij kamertemperatuur het mengsel toe aan platina E-cellen.
  4. Op dag 3, 16-20 uur na transfectie, verwijder de media en vul verse DMEM aan, aangevuld met 10% FBS en 1% penicilline/streptomycine.
  5. Op Dag 3, 24 h na de eerste transfectie, voer de tweede transfectie in de tweede put uit waarin de cellen van Platina E op Dag 1 werden geplateerd zoals beschreven in stap 1.3).
  6. Zaai op dag 3 ~5 x 104 ingevroren embryonale fibroblasten (MEF's) van muizen geïsoleerd uit Titin-GFP reporter knock-in muizen19 in een putje met een plaat met 24 putjes. Er zijn in totaal twee putjes met een plaat met 24 putjes nodig (d.w.z. niet-geïnfecteerde controle en M-G-T-H-infectie).
    OPMERKING: Het aantal geplateerde MEF's moet mogelijk worden aangepast, omdat het herstelpercentage van bevroren MEF's kan variëren afhankelijk van de vriesomstandigheden van de cellen. Ongeveer 10% samenvloeiing een dag na het zaaien van cellen is voldoende voor herprogrammering. De efficiëntie van de herprogrammering kan worden verbeterd met behulp van verse, niet-ingevroren MEF's.
  7. Op dag 4, 16-20 uur na de tweede transfectie, verwijdert u de media en vult u verse DMEM aan, aangevuld met 10% FBS en 1% penicilline/streptomycine.
  8. Op dag 4, 48 uur na de eerste transfectie, verzamelt u de virale media in het eerste putje van platina E-cellen met behulp van een spuit van 5 ml en filtreert u ze door een membraanfilter van 0,45 μm polyethersulfon (PES). Verwijder de fibroblastgroeimedia op MEF's en vervang ze door de virale media aangevuld met polybreen in een dosis van 6 μg/ml (eerste infectie).
  9. Op dag 5, 48 uur na de tweede transfectie, voer de tweede infectie uit met behulp van de virale media in de tweede put zoals beschreven in stap 1.8).
  10. Op dag 6, 24 uur na de tweede infectie, worden de virale media vervangen door cardiale inductiemedia bestaande uit DMEM/199 (4:1), 10% FBS, 5% paardenserum, 1% penicilline/streptomycine, 1% niet-essentiële aminozuren, 1% essentiële aminozuren, 1% B-27, 1% insuline-selenium-transferrine, 1% vitaminemengsel en 1% natriumpyruvaat, 1 μM SB431542 en 0,5 μm A83-01. Vervang de hartinductiemedia om de drie dagen totdat de cellen zijn geoogst.

2. Immunokleuring

  1. Fixeer de cellen 14-15 dagen na infectie op een plaat met 24 putjes met 2% paraformaldehyde gedurende 15 minuten.
  2. Permeabiliseer de gefixeerde cellen met permeabilisatiebuffer (0,05% Triton-X in PBS) door de cellen elke 5 minuten driemaal te wassen met permeabilisatiebuffer.
  3. Incubeer de cellen met de universele blokkeerbuffer gedurende 45 minuten.
  4. Incubeer de cellen met muizen-α-actinine (verdunning 1:400) en GFP-antilichamen van kippen (verdunning 1:400) gedurende 1,5 uur bij kamertemperatuur.
    OPMERKING: Ongeveer 150 μL antilichaamoplossing kan het hele gebied van een putje met een plaat met 24 putjes bedekken.
  5. Was de cellen driemaal 5 minuten met permeabilisatiebuffer.
  6. Incubeer de cellen met anti-muis Alexa-555 en anti-kip Alexa-488 secundaire antilichamen (1:400 verdunning) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur
  7. Was de cellen driemaal 5 minuten met permeabilisatiebuffer.
  8. Voeg 2,5 μL DAPI-oplossing toe aan 250 μL permeabilisatiebuffer.

3. Beeldvorming met hoge inhoud

  1. Schakel het beeldvormingssysteem in.
  2. Open de bijbehorende software.
  3. Log in op het systeem.
  4. Selecteer op de taakbalk de optie Een plaat uitvoeren.
  5. Klik op Open Door-Eject Plate om de deur op de machine te openen en plaats de plaat erin. Zorg ervoor dat de plaat in de juiste richting staat. Klik op Deurlaadplaat sluiten om de deur te sluiten.
  6. Klik op Instellingen laadplateau. Selecteer een sjabloonprotocol en klik vervolgens op Laden uit DB.
  7. Klik op Acquisitie instellen.
  8. Klik in het dialoogvenster Plaatacquisitie-instelling op Configureren.
  9. Selecteer op het tabblad Objectief en camera de optie 10x objectief.
  10. Selecteer op het tabblad Plaat een plaat met 24 putjes.
  11. Kies op het tabblad Te bezoeken sites op Site-opties de optie 'Vast aantal sites' om het aantal afbeeldingssites te bepalen door het aantal in kolommen en rijen te kiezen. In totaal worden 36 beeldvormingssites gebruikt door 6 in kolommen en 6 in rijen te selecteren. Selecteer de afstand tussen elke beeldvormingslocatie (d.w.z. 500 μm).
  12. Stel op het tabblad Acquisitie het aantal golflengten in op 3.
  13. Selecteer op het tabblad Golflengten op Verlichting DAPI, FITC of Texas Red voor elke golflengte afzonderlijk.
  14. Klik op het tabblad Uitvoeren en stel vervolgens de "Mapnaam" en "Plaatnaam" in voor de plaat.  Klik op de putjes in het plaatdiagram voor beeldvorming en vervolgens op Berekenen om de focusverschuiving voor elke golflengte in te stellen. Stel eerst de foucs-offset voor DAPI in. Klik op Auto Expose om de belichtingstijd automatisch in te stellen voor elke golflengte. Klik vervolgens op Plaat verwerven om te beginnen met het maken van een afbeelding van de geselecteerde sites.

4. Analyse van beeldvorming met een hoog gehalte

  1. Zodra de beeldvorming met hoge inhoud is voltooid, klikt u op het menu Screening en selecteert u Plaatgegevens controleren om een plaat voor analyse te selecteren.
  2. Klik op Plaat selecteren. Open in het dialoogvenster Plaat selecteren voor controle de map en selecteer de plaat die in de database is opgeslagen en klik vervolgens op Selecteren.
    OPMERKING: Als u de afbeeldingen wilt weergeven, selecteert u DAPI, FITC en Texas Red in het veld Golflengten . Selecteer in het veld Sites de optie Alle sites. Klik op een site uit de geselecteerde 36 sites om deze weer te geven in elk golflengteafbeeldingsvenster en klik vervolgens op Opzoektabel om een kleur voor de golflengte te selecteren. Gebruik de Print Screen-toets op het toetsenbord en plak de afbeelding in een fotobewerkingssoftware (bijv. Paint en Photoshop) om deze op te slaan.
  3. Klik op Analyse uitvoeren en selecteer een sjablooninstelling.
  4. Klik op Instellingen configureren en vervolgens op Aantal golflengten. Selecteer drie golflengten (d.w.z. DAPI voor kernkleuring, Teaxs Red voor α-actinine en FITC voor Titine-GFP).
  5. Meet met het gereedschap Lijn op de werkbalk de breedte over de korte as van een cel. Stel op basis van de gemeten breedtes van cellen de "Geschatte minimale breedte" en "Geschatte maximale breedte" in om de meeste cellen op de geselecteerde beeldvormingslocatie op te nemen.
  6. Klik op Voorbeeld om te controleren of bijna alle kernen zijn geselecteerd. De geselecteerde kernen vertonen een witte kleur, terwijl de niet-geselecteerde kernen blauw blijven (DAPI-gekleurd). Breng indien nodig aanpassingen aan voor "Geschatte minimale breedte" en "Geschatte maximale breedte".
  7. Als u Intensiteit boven Lokale achtergrond wilt instellen, plaatst u een muiscursor binnen en buiten een cel. De intensiteitswaarde wordt onder aan het venster weergegeven. Verminder de intensiteit van een zwakke cel iets om de intensiteit gelijkmatig over het hele gebied van elke cel weer te geven. Definieer deze intensiteitswaarde als Intensiteit boven lokale achtergrondwaarde . Deze waarde moet voor elk kanaal afzonderlijk worden ingesteld.
  8. Klik op het menu Screening en selecteer Plate Data Utilities. Klik in het dialoogvenster Hulpprogramma's voor plaatgegevens op Analyse uitvoeren om de plaat te selecteren.
  9. Selecteer in het veld Instellingen de opgeslagen instelling voor analyse; selecteer Toevoegen aan lijst met automatische uitvoeringen en klik vervolgens op OK om de analyse uit te voeren.
  10. Nadat de analyse is voltooid, klikt u op het menu Screening en selecteert u Plaatgegevenshulpprogramma's. Klik vervolgens in het dialoogvenster Hulpprogramma's voor plaatgegevens op Metingen exporteren om de analyseresultaten te exporteren.
  11. Klik op Cel- en afbeeldingsmetingen en vervolgens op OK.
  12. Selecteer op de pagina Afmetingen exporteren - Stap 1 de plaat en klik op Volgende.
  13. Klik op de pagina Afmetingen exporteren - Stap 2 op Voltooien.
  14. Selecteer op de pagina Gegevensexport configureren de gegevenstypen (d.w.z. putnaam, totaal celnummer, subtotaal celnummer voor DAPI+, subtotaal celnummer voor Texas Red+, subtotaal celnummer voor FITC+, subtotaal celnummer voor DAPI+Texas Red+, subtotaal celnummer voor DAPI+FITC+, subtotaal celnummer voor DAPI+FITC+Texas Red+, percentage DAPI+cellen, percentage DAPI+Texas Red+-cellen, percentage DAPI+FITC+-cellen en percentage DAPI+Texas Red+FITC+-cellen) en klik vervolgens op OK.
  15. Selecteer op de pagina Exporteren als tekstbestand de bestemming om het bestand op te slaan en klik op OK.
  16. Open het bestand in Microsoft Excel. De resultaten zullen per locatie worden gepresenteerd (tabel 2). Er zijn 36 locaties per put. Gebruik de analysetool, draaitabel, om de gegevens van de 36 sites samen te vatten (d.w.z. de som van het aantal cellen en de gemiddelden van het aangegeven celpercentage op alle 36 sites) (Tabel 3).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Na herprogrammeringsexperimenten hebben we iCM's gekwantificeerd met behulp van beeldvormingsanalyse met een hoog gehalte, zoals hierboven beschreven. Samengestelde afbeeldingen van 36 beeldvormingslocaties die werden gebruikt voor beeldvormingsanalyse met een hoog gehalte werden getoond in figuur 1. iCM's worden in deze experimenten gedefinieerd als dubbel-positieve cellen (α-actinine+Titine-eGFP+). Beeldvormingsanalyse met een hoog ge...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De vorige herprogrammeringsstudies beoordeelden de efficiëntie van herprogrammering met behulp van flowcytometrie en toonden de structurele kwaliteit van iCM's aan met behulp van immunocytochemie in twee afzonderlijke experimenten. Flowcytometrie-analyse vereist een veel groter aantal startcellen, waardoor de schaal van experimenten toeneemt. Daarentegen kan beeldvormingsanalyse met een hoog gehalte zowel de kwaliteit als de kwantiteit van iCM-herprogrammering evalueren door een enkel ex...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Beeldvormingsanalyse met een hoog gehalte werd uitgevoerd in de Vanderbilt High-Throughput Screening (HTS) Core Facility met hulp van David Westover en Joshua Bauer. De HTS Core krijgt ondersteuning van het Vanderbilt Institute of Chemical Biology en het Vanderbilt Ingram Cancer Center (P30 CA68485). Dit werk werd ondersteund door AHA Innovative Project Award 18IPA34110341 en NIH R01 HL146524 (Y-.J. N.), en AHA postdoctoral fellowship award 20POST35210170 (Z.Z).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
A83-01Tocris2939
anti-chicken Alexa 488ThermofisherA11039
anti-GFP antilichaamInvitrogenA10262
anti-muis Alexa 555ThermofisherA21422
anti-α-actinine antilichaamSigmaA7811
DAPI-oplossingVector labsH1200
Fugene 6PromegaE2691
Insulin-Transferrine-SeleniumG supplementInvitrogen41400-045
Medium 199Invitrogen11150059
MEM-vitamineoplossingInvitrogen11120-052
MetaXpress softwareMolecular device
Micro XL geautomatiseerd celbeeldsysteemMolecular device
Minimale essentiële aminozuuroplossingSigmaM7145
Opti-MEMGibco31905-070
PES-filter (0,45 µm)Thomas scientific1159T84
Platninum E-cellenCell BiolabsRV-101
PolybrenSigmaH9268
SB431542SigmaS4317
Universele blokkeringsbufferBiogeneXHK083-50K

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 375-386 (2010).
  2. Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).
  3. Ifkovits, J. L., Addis, R. C., Epstein, J. A., Gearhart, J. D. Inhibition of TGFbeta signaling increases direct conversion of fibroblasts to induced cardiomyocytes. PLoS One. 9 (2), 89678(2014).
  4. Nam, Y. J., et al. Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors. Development. 141 (22), 4267-4278 (2014).
  5. Muraoka, N., et al. MiR-133 promotes cardiac reprogramming by directly repressing Snai1 and silencing fibroblast signatures. The EMBO Journal. 33 (14), 1565-1581 (2014).
  6. Umei, T. C., et al. Single-construct polycistronic doxycycline-inducible vectors improve direct cardiac reprogramming and can be used to identify the critical timing of transgene expression. International Journal of Molecular Sciences. 18 (8), 1805(2017).
  7. Wang, L., et al. Stoichiometry of Gata4, Mef2c, and Tbx5 influences the efficiency and quality of induced cardiac myocyte reprogramming. Circulation Research. 116 (2), 237-244 (2015).
  8. Zhang, Z., Zhang, A. D., Kim, L. J., Nam, Y. J. Ensuring expression of four core cardiogenic transcription factors enhances cardiac reprogramming. Science Reports. 9 (1), 6362(2019).
  9. Zhang, Z., Zhang, W., Nam, Y. J. Stoichiometric optimization of Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5 expression for contractile cardiomyocyte reprogramming. Science Reports. 9 (1), 14970(2019).
  10. Zhao, Y., et al. High-efficiency reprogramming of fibroblasts into cardiomyocytes requires suppression of pro-fibrotic signalling. Nature Communications. 6, 8243(2015).
  11. Zhou, H., Dickson, M. E., Kim, M. S., Bassel-Duby, R., Olson, E. N. Akt1/protein kinase B enhances transcriptional reprogramming of fibroblasts to functional cardiomyocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 11864-11869 (2015).
  12. Zhou, H., et al. ZNF281 enhances cardiac reprogramming by modulating cardiac and inflammatory gene expression. Genes & Development. 31 (17), 1770-1783 (2017).
  13. Zhou, Y., et al. Bmi1 is a key epigenetic barrier to direct cardiac reprogramming. Cell Stem Cell. 18 (3), 382-395 (2016).
  14. Muraoka, N., et al. Role of cyclooxygenase-2-mediated prostaglandin E2-prostaglandin E receptor 4 signaling in cardiac reprogramming. Nature Communications. 10 (1), 674(2019).
  15. Yamakawa, H., et al. Fibroblast growth factors and vascular endothelial growth factor promote cardiac reprogramming under defined conditions. Stem Cell Reports. 5 (6), 1128-1142 (2015).
  16. Abad, M., et al. Notch inhibition enhances cardiac reprogramming by increasing MEF2C transcriptional activity. Stem Cell Reports. 8 (3), 548-560 (2017).
  17. Protze, S., et al. A new approach to transcription factor screening for reprogramming of fibroblasts to cardiomyocyte-like cells. Journal of Molecular and Cell Cardiology. 53 (3), 323-332 (2012).
  18. Addis, R. C., et al. Optimization of direct fibroblast reprogramming to cardiomyocytes using calcium activity as a functional measure of success. Journal of Molecular and Cell Cardiology. 60, 97-106 (2013).
  19. da Silva Lopes, K., Pietas, A., Radke, M. H., Gotthardt, M. Titin visualization in real time reveals an unexpected level of mobility within and between sarcomeres. The Journal of Cell Biology. 193 (4), 785-798 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cardiac ReprogrammingHigh Content ImagingInduced Cardiomyocyte like CellsFlow CytometryImmunocytochemistryTranscription Factor ReprogrammingFibroblast ConversionAutomated Image AnalysisReprogramming EfficiencyGenetic Screening
Video Coming Soon

Related Articles