Beoordeling van cardiale herprogrammering met behulp van High Content Imaging Analysis

Summary

We presenteren een protocol om direct geherprogrammeerde geïnduceerde cardiomyocyt-achtige cellen (iCM's) in vitro te kwantificeren met behulp van beeldvormingsanalyse met een hoog gehalte. Deze methode stelt ons in staat om de efficiëntie van cardiale herprogrammering op een geautomatiseerde manier te kwantificeren en iCM's direct te visualiseren.

Abstract

Het doel van dit protocol is het beschrijven van een methode voor het kwantificeren van geïnduceerde cardiomyocyt-achtige cellen (iCM's), die direct in vitro worden geherprogrammeerd door een herprogrammeringstechniek. Cardiale herprogrammering biedt een strategie om nieuwe cardiomyocyten te genereren. Door cardiogene transcriptiefactoren in de kern in fibroblasten te introduceren; fibroblasten kunnen worden omgezet in iCM's zonder overgang door de pluripotente stamceltoestand. De conversieratio van fibroblasten naar iCM's blijft echter nog steeds laag. Dienovereenkomstig zijn er tal van aanvullende benaderingen geweest om de efficiëntie van cardiale herprogrammering te verbeteren. De meeste van deze onderzoeken beoordeelden de efficiëntie van cardiale herprogrammering met behulp van flowcytometrie, terwijl ze tegelijkertijd immunocytochemie uitvoerden om iCM's te visualiseren. Er zijn dus ten minste twee afzonderlijke reeksen herprogrammeringsexperimenten nodig om het succes van iCM-herprogrammering aan te tonen. Geautomatiseerde beeldvormingsanalyse met een hoog gehalte daarentegen zal zowel kwantificering als kwalificatie van iCM-herprogrammering met een relatief klein aantal cellen opleveren. Met deze methode is het mogelijk om met een enkel herprogrammeringsexperiment direct de kwantiteit en kwaliteit van iCM's te beoordelen. Deze aanpak zal toekomstige onderzoeken naar cardiale herprogrammering kunnen vergemakkelijken die grootschalige herprogrammeringsexperimenten vereisen, zoals het screenen van genetische of farmacologische factoren om de herprogrammeringsefficiëntie te verbeteren. Bovendien is de toepassing van een beeldvormingsanalyseprotocol met hoge inhoud niet beperkt tot cardiale herprogrammering. Het kan worden toegepast op het herprogrammeren van andere cellijnen, evenals op immunokleuringsexperimenten die zowel kwantificering als visualisatie van immunogekleurde cellen nodig hebben.

Introduction

Cardiale herprogrammering is ontwikkeld als een alternatieve benadering van stamcelgemedieerde benaderingen om nieuwe cardiomyocyten te genereren. Aangezien het niet door de stamceltoestand gaat, heeft het een groot potentieel om enkele overgeërfde beperkingen in stamcelgemedieerde benaderingen te omzeilen. Het is aangetoond dat virale infectie van ten minste drie of vier cardiogene transcriptiefactoren in fibroblasten fibroblasten kan omzetten in een cardiaal lot door fibroblastgenprogramma's te elimineren en cardiogene transcriptienetwerken in fibroblasten opnieuw op te bouwen 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10<....

Protocol

Alle dierprocedures werden uitgevoerd met de goedkeuring van het Vanderbilt University Medical Center Institutional Animal Care and Use Committee.

1. Retrovirusgeneratie en in vitro cardiale herprogrammering

1. Kweek platina E-cellen in DMEM aangevuld met 10% FBS, 1% penicilline/streptomycine, 1 μg/ml puromycine en 10 μg/ml blasticidine totdat de platina E-celsamenvloeiing 70%-80% bereikt.
2. Op dag 1, zaad ~0,55 x 10⁶ cellen (eerste putje) en ~0,18 x 10⁶ cellen (tweede putje) in twee afzonderlijke putjes van 12-well plaat met 1 ml DMEM aangevuld met 10% FBS en 1% penic....

Results

Na herprogrammeringsexperimenten hebben we iCM's gekwantificeerd met behulp van beeldvormingsanalyse met een hoog gehalte, zoals hierboven beschreven. Samengestelde afbeeldingen van 36 beeldvormingslocaties die werden gebruikt voor beeldvormingsanalyse met een hoog gehalte werden getoond in figuur 1. iCM's worden in deze experimenten gedefinieerd als dubbel-positieve cellen (α-actinine⁺Titine-eGFP⁺). Beeldvormingsanalyse met een hoog ge.......

Discussion

De vorige herprogrammeringsstudies beoordeelden de efficiëntie van herprogrammering met behulp van flowcytometrie en toonden de structurele kwaliteit van iCM's aan met behulp van immunocytochemie in twee afzonderlijke experimenten. Flowcytometrie-analyse vereist een veel groter aantal startcellen, waardoor de schaal van experimenten toeneemt. Daarentegen kan beeldvormingsanalyse met een hoog gehalte zowel de kwaliteit als de kwantiteit van iCM-herprogrammering evalueren door een enkel ex.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
A83-01	Tocris	2939
anti-chicken Alexa 488	Thermofisher	A11039
anti-GFP antibody	Invitrogen	A10262
anti-mouse Alexa 555	Thermofisher	A21422
anti-α-actinin antibody	Sigma	A7811
DAPI solution	Vector labs	H1200
Fugene 6	Promega	E2691
Insulin-Transferrin-SeleniumG supplement	Invitrogen	41400-045
Medium 199	Invitrogen	11150059
MEM vitamin solution	Invitrogen	11120-052
MetaXpress software	Molecular device
Micro XL automated cell imagining system	Molecular device
Minimal essential amino acid solution	Sigma	M7145
Opti-MEM	Gibco	31905-070
PES filter (0.45 µm)	Thomas scientific	1159T84
Platninum E cells	Cell Biolabs	RV-101
Polybrene	Sigma	H9268
SB431542	Sigma	S4317
Universal blocking buffer	BiogeneX	HK083-50K