We presenteren een in vitro model om olfactorisch verwarmend glia (OEG) neuroregeneratief vermogen te beoordelen, na neuraal letsel. Het is gebaseerd op een cocultuur van axotomized volwassen retinale ganglion neuronen (RGN) op OEG monolagen en daaropvolgende studie van axonale regeneratie, door het analyseren van RGN axonale en somatodendritische markers.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Cocultuur van Axotomized Rat Retinal Ganglion Neurons met Olfactory Ensheathing Glia, als een In Vitro Model van Volwassen Axonale Regeneratie
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Olfactorische ensheathing glia (OEG) cellen zijn gelokaliseerd helemaal van het reukslijmvlies tot en in de reukzenuwlaag (ONL) van de reukbol. Gedurende het hele volwassen leven zijn ze de sleutel tot de axonale groei van nieuw gegenereerde reukneuronen, van de lamina propria tot het ONL. Vanwege hun pro-regeneratieve eigenschappen zijn deze cellen gebruikt om axonale regeneratie in ruggenmerg- of oogzenuwletselmodellen te bevorderen.
We presenteren een in vitro model om OEG neuroregeneratieve capaciteit na neurale verwonding te testen en te meten. In dit model wordt reversibel vereeuwigd menselijk OEG (ihOEG) gekweekt als een monolaag, netvliezen worden geëxtraheerd uit volwassen ratten en retinale ganglionneuronen (RGN) worden samengecultiveerd op de OEG-monolaag. Na 96 uur worden axonale en somatodendritische markers in RGN's geanalyseerd door immunofluorescentie en wordt het aantal RGN's met axon en de gemiddelde axonlengte/neuron gekwantificeerd.
Dit protocol heeft het voordeel ten opzichte van andere in vitro tests die afhankelijk zijn van embryonale of postnatale neuronen, dat het OEG neuroregeneratieve eigenschappen in volwassen weefsel evalueert. Het is ook niet alleen nuttig voor het beoordelen van het neuroregeneratieve potentieel van ihOEG, maar kan worden uitgebreid naar verschillende bronnen van OEG of andere gliacellen.
Inleiding
Volwassen centrale zenuwstelsel (CZS) neuronen hebben beperkte regeneratieve capaciteit na letsel of ziekte. Een gemeenschappelijke strategie ter bevordering van CZS-regeneratie is transplantatie, op de plaats van verwonding, van celtypen die axonale groei induceren, zoals stamcellen, Schwann-cellen, astrocyten of reukverwarmende gliacellen (OEG)1,2,3,4,5.
OEG is afgeleid van de neurale top6 en bevindt zich in het reukslijmvlies en in de reukbol. ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
OPMERKING: Dierproeven werden goedgekeurd door nationale en institutionele bio-ethiekcomités.
1. ihOEG (Ts12 en Ts14) cultuur
OPMERKING: Deze procedure wordt uitgevoerd onder steriele omstandigheden in een bioveiligheidskast voor weefselkweek.
- Bereid 50 ml ME10 OEG-kweekmedium voor zoals vermeld in tabel 1.
- Bereid 5 ml DMEM/F12-FBS, zoals vermeld in tabel 1,in een conische buis van 15 ml.
- Verwarm beide media op 37 °C in een schoon waterbad, gedurende 15 minuten.
- Ontdooi Ts12- en Ts14-cellenflacons bij 37 °C in een schoonwaterbad.
- ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
In dit protocol presenteren we een in vitro model om het neuroregeneratieve vermogen van OEG na neuronaal letsel te testen. Zoals getoond in figuur 1, is de OEG-bron een omkeerbare vereeuwigde menselijke OEG clonale cellijn -Ts14 en Ts12-, die afkomstig is uit primaire culturen, bereid uit reukbollen verkregen in autopsies15,17,18. Retinale weefsel wordt geëxtraheerd uit volwassen ratten, verteerd, .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
OEG-transplantatie op CZS-letselplaatsen wordt beschouwd als een veelbelovende therapie voor CZS-letsel vanwege de constitutieve pro-neuroregeneratieve eigenschappen7,8,9. Afhankelijk van de weefselbron — reukslijmvlies (OM-OEG) versus reukbol (OB-OEG)— of de leeftijd van de donor bestaat er echter aanzienlijke variatie in dergelijke capaciteit26,31,
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd financieel ondersteund door project SAF2017-82736-C2-1-R van Ministerio de Ciencia e Innovación tot MTM-F en door Fundación Universidad Francisco de Vitoria aan JS.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| antibody 514 | Reference 34 | Konijn polyklonaal antiserum, dat MAP2A en B herkent. | |
| antibody SMI-31 | BioLegend | 801601 | Monoklonaal antilichaam tegen MAP1B en NF-H eiwitten |
| anti-muis Alexa Fluor 488 antilichaam | ThermoFisher | A-21202 | |
| anti-konijn Alexa Fluor 594 antilichaam | ThermoFisher | A-21207 | |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504044 | |
| D,L-2-amino-5-fosfonovalerinezuur | Sigma | 283967 | NMDA-receptorremmer |
| DAPI | Sigma | D9542 | Fluorescente kleuring van kernen |
| DMEM-F12 | Gibco | 11320033 | Celkweekmedium |
| FBS | Gibco | 11573397 | Foetaal runderserum |
| FBS-Hyclone | Fisher Scientific | 16291082 | Foetaal runderserum |
| Fluoromount | Southern Biotech | 0100-01 | Montagemedium |
| ImageJ | National Institutes of Health (NIH-USA) | Afbeeldingssoftware | |
| L-Glutamine | Lonza | BE17-605F | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | Neuronale celkweekmedium |
| Papaïne dissociatiesysteem | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | Voor gebruik bij neurale celisolatie |
| PBS | Huisgemaakt | ||
| PBS-EDTA | Lonza | H3BE02-017F | |
| Penicilline/Streptomycine/Amphotericin B | Lonza | 17-745E | Bacteriostatisch en bactericide |
| Hypofyse-extract | Gibco | 13028014 | Rund hypofyse-extract |
| Poly -L- lysine (PLL) | Sigma | A-003-M |
Referenties
- Kanno, H., Pearse, D. D., Ozawa, H., Itoi, E., Bunge, M. B. Schwann cell transplantation for spinal cord injury repair: Its significant therapeutic potential and prospectus. Reviews in the Neurosciences. 26 (2), 121-128 (2015).
- Assinck, P., Duncan, G. J., Hilton, B. J., Plemel, J. R., Tetzlaff, W.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
