Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Labelvrije beeldvorming van lipideopslagdynamiek bij Caenorhabditis elegans met behulp van gestimuleerde Raman-verstrooiingscopie

4.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/61870

⸱

28 mei 2021

 ,  ,  , 
1Huffington Center on Aging, Baylor College of Medicine, 2Department of Molecular and Human Genetics, Baylor College of Medicine, 3Howard Hughes Medical Institute, Baylor College of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

Gestimuleerde Raman scattering (SRS) microscopie maakt selectieve, labelvrije beeldvorming van specifieke chemische moieties mogelijk en het is effectief gebruikt om lipidemoleculen in vivo in beeld te brengen. Hier geven we een korte inleiding tot het principe van SRS-microscopie en beschrijven we methoden voor het gebruik ervan bij de opslag van beeldvormende lipiden in Caenorhabditis elegans.

Samenvatting

Lipidenmetabolisme is een fundamenteel fysiologisch proces dat nodig is voor de gezondheid van cellulaire en organismen. Dysregulatie van lipidenmetabolisme roept vaak obesitas en vele bijbehorende ziekten op, waaronder cardiovasculaire aandoeningen, diabetes type II en kanker. Om het huidige begrip van lipide metabole regulatie te bevorderen, zijn kwantitatieve methoden om in vivo lipidenopslagniveaus in tijd en ruimte nauwkeurig te meten steeds belangrijker en nuttiger geworden. Traditionele benaderingen voor het analyseren van lipidenopslag zijn semi-kwantitatief voor microscopische beoordeling of ontbreken spatio-temporele informatie voor biochemische meting. Stimulated Raman scattering (SRS) microscopie is een labelvrije chemische beeldvormingstechnologie die snelle en kwantitatieve detectie van lipiden in levende cellen met een subcellulaire resolutie mogelijk maakt. Omdat het contrast wordt benut door intrinsieke moleculaire trillingen, maakt SRS-microscopie ook vierdimensionale tracking van lipiden bij levende dieren mogelijk. In het afgelopen decennium is SRS-microscopie veel gebruikt voor beeldvorming van kleine moleculen in biomedisch onderzoek en overwint het de belangrijkste beperkingen van conventionele fluorescerende kleurings- en lipideextractiemethoden. In het laboratorium hebben we SRS-microscopie gecombineerd met de genetische en biochemische hulpmiddelen die beschikbaar zijn voor het krachtige modelorganisme Caenorhabditis elegans, om de verdeling en heterogeniteit van lipidedruppels over verschillende cellen en weefsels te onderzoeken en uiteindelijk nieuwe geconserveerde signaleringsroutes te ontdekken die het lipidenmetabolisme moduleren. Hier presenteren we de werkprincipes en de gedetailleerde opstelling van de SRS-microscoop en bieden we methoden voor het gebruik ervan bij het kwantificeren van lipidenopslag op verschillende ontwikkelingsmomenten van wild-type en insulinesignaleringsdeficiënte mutant C. elegans.

Inleiding

Obesitas is een wereldwijd gezondheidsprobleem geworden dat een derde van de bevolking over de hele wereld bedreigt, en het vormt een ernstige medische zorg, gezien de associatie met slechte geestelijke gezondheid1 en dodelijke ziekten, waaronder diabetes2,hart- en vaatziekten3 en sommige soorten kanker4. Studie van lipidenmetabolisme is essentieel om de biologische problemen achter obesitas beter te begrijpen. Snelle en specifieke kwantificering van lipidenopslag omvat de detectie van vetzuren en derivaten daarvan, evenals sterolhoudende metabolieten, met een hoge gevoeligheid en bij voorkeur met ruimtelijke informatie. Lipiden zijn uitdagende doelwitten om in beeld te brengen omdat ze intrinsieke fluorescentie missen en niet gemakkelijk fluorescerend kunnen worden getagd. De fluorescerende tags zijn vaak groter dan de lipidemoleculen en kunnen daarom chemisch invasief en onpraktisch zijn voor in vivo toepassingen. Labelvrije of minimale etiketteringsstrategie is noodzakelijk om de hydrofobe structuur van de lipidemoleculen te behouden5. Recente ontwikkelingen in beeldvormingstechnologieën hebben opwindende mogelijkheden gecreëerd voor labelvrije beeldvorming van lipiden in levende cellen, weefsels en organismen.

Traditionele benaderingen voor lipidenopslaganalyses in biologische monsters omvatten biochemische assays en kleuringsprotocollen met lipofiele kleurstoffen. Biochemische kwantificeringstesten met betrekking tot massaspectrometrie (MS) zijn ongeëvenaard in hun moleculaire oplosbaarheid, maar ze vereisen zeer grote monsterhoeveelheden en de monstervoorbereiding duurt meestal enkele uren, waardoor hun toepassing voor real-time beeldvorming van levende systemen wordt beperkt5. Een andere belangrijke beperking van deze assays is het gebrek aan ruimtelijke informatie. Aan de andere kant bieden lipofiele kleurstoffen zoals Oil Red O en Sudan Black weefsel- en cellulaire distributie van lipidenopslagorganellen en in vergelijking met MS-technieken zijn deze kleuringsmethoden ook goedkoop en gemakkelijk uit te voeren. Deze kleuringsprotocollen vereisen echter fixatie, wat de hydrofobe aard van de lipidedruppels kan beïnvloeden, kunstmatige veranderingen in hun structuur kan genereren en kan leiden tot inconsistenties tussen experimenten6. De technische problemen in verband met biochemische en kleuringstechnieken hebben geleid tot het zoeken naar labelvrije methoden om lipidemoleculen in beeld te brengen en tot de snelle toename van het gebruik van coherente Raman-verstrooiingsmicroscopie (CRS) in lipidebeeldvorming.

Het Raman-effect werd voor het eerst herkend door Raman en Krishnan, waar ze meldden dat bij interactie met een foton, een molecuul verspreid licht kan genereren zonder verandering in golflengte (rayleighverstrooiing genoemd) of zelden met een veranderde golflengte (raman-verstrooiing genoemd) en deze verandering in golflengte is kenmerkend voor de functionele chemische groepen binnen het molecuul7. Wanneer de chemische bindingen in een molecuul worden opgewekt tot een hoger trillingsenergieniveau door een incident foton, pompfoton genaamd, wordt de energie van het verspreide foton, het Stokes-foton, lager. Anders kunnen de chemische bindingen een lager trillingsenergieniveau bereiken als ze oorspronkelijk op een hoger niveau zijn, en het verspreide foton krijgt energie om het anti-Stokes-foton te zijn. Het frequentieverschil tussen het incident en verspreide fotonen staat bekend als de Raman-verschuiving. Elke chemische binding binnen een molecuul heeft een karakteristieke en kwantificeerbare Raman-verschuiving. De CH2-binding heeft bijvoorbeeld een Raman-verschuiving van 2.845 cm-1, die overvloedig aanwezig is in vetzuurketens8. Dit spontane Raman-signaal is over het algemeen erg zwak, wat de beeldsnelheid in conventionele spontane Raman-microscopie enorm heeft beperkt. In de loop der jaren zijn verschillende benaderingen ontwikkeld om de beeldsnelheid en gevoeligheid van spontane Raman-microscopie te verhogen. Coherente Raman scattering microscopie, waaronder Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) microscopie en Stimulated Raman Scattering (SRS) microscopie, is de meest recente vooruitgang. CARS en SRS hebben iets andere werkprincipes, maar beide zijn labelvrije technieken die live beeldvormingscapaciteit hebben, ruimtelijke en temporele informatie kunnen opleveren over lipideopslagdynamiek en slechts een kleine steekproefgrootte vereisen. CARS-microscopie lijdt aan een niet-resonante achtergrond, die afkomstig is van verschillende niet-lineaire processen, en CARS-signalen hebben ook een niet-lineaire relatie met de molecuulconcentratie, die samen het kwantificeringsproces bemoeilijken9. In tegenstelling tot CARS-microscopie genereert SRS-microscopie geen niet-resonante achtergrondsignalen en biedt lineaire afhankelijkheid van de concentratie van het molecuul van belang. Dus, momenteel SRS microscopie wordt op grotere schaal gebruikt voor lipide beeldvorming.

In SRS-microscopie kunnen de zwakke spontane Raman-signalen worden versterkt wanneer ze worden opgewekt door twee gesynchroniseerde laserstralen met hun frequentieverschil dat overeenkomt met de trillingsfrequentie van de chemische binding. Het molecuul zal een verbeterde overgang naar een opgewonden toestand ervaren als gevolg van coherente excitatie. Als gevolg hiervan wordt de snelheid van de fotonengeneratie van Stokes verhoogd. Bijgevolg neemt de intensiteit van de overgedragen "Stokes"-bundel toe (gestimuleerde Raman-versterking, SRG) en neemt de intensiteit van de overgedragen "pomp"-bundel af (gestimuleerd Raman-verlies, SRL). Detectie van SRG- of SRL-signalen ligt ten grondslag aan de basis voor Stimulated Raman Scattering (SRS) microscopiebeeldvorming van moleculen met specifieke chemische bindingen10. Als het frequentieverschil tussen de twee laserstralen niet overeenkomt met de trillingsfrequentie van de chemische binding binnen een molecuul van belang, worden er geen SRG- of SRL-signalen gegenereerd. De beeldsnelheid van SRS-microscopie is ongeveer 2 μsec per pixel of 1 seconde per frame, wat veel sneller is dan spontane Raman-microscopie11. Typische laterale resolutie voor SRS-microscopie is diffractie beperkt en ongeveer 300 nm. Bovendien maken de optische processen met twee fotonen van SRS-microscopie volumetrische 3D-beeldvorming van relatief dikke weefselmonsters mogelijk en kan de beelddiepte 300-500 μm bereiken. Over het algemeen presenteert SRS-microscopie een efficiënte, labelvrije beeldvormingstechniek om specifieke biomoleculen, met name lipiden, te detecteren.

Lipidedruppels zijn organellen met één membraan, de belangrijkste cellulaire opslagplaats voor neutrale lipiden, waaronder de triacylglycerolen (TAGs) en cholesterolesters (CE's). CH2-bindingen in de vetzuurketens van deze lipidemoleculen genereren sterke SRS-signalen op 2.845 cm-1 wanneer zeopgewonden zijn 8, waardoor de opslaglipideniveaus in intacte cellen, weefselsecties en zelfs hele organismen12,13,14,15kunnen worden gedetecteerd en gekwantificeerd . In het bijzonder zijn C. elegans nuttig voor lipidebeeldvormingsstudies vanwege hun transparantie. Net als zoogdieren slaan C. elegans ook lipiden op in lipidedruppels en de synthese- en afbraakroutes van lipidemoleculen zijn sterk geconserveerd16. In dit protocol zullen we het werkingsprincipe van SRS-microscopie, de fundamentele opstelling ervan, bieden en de methoden beschrijven voor het gebruik ervan in lipidebeeldvorming in C. elegans.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Instrumentale opstelling voor Stimulated Raman Scattering Microscopy

OPMERKING: Het SRS-microscopiesysteem is gebouwd op een picoseconde laser met geïntegreerde optische parametrische oscillator en een confocale laserscanmicroscoop. De oscillator levert twee picoseconde pulstreinen, waaronder een Stokes-straal bij 1.064 nm en een pompstraal met een afstembare pompstraal tussen 700-990 nm. Tijdelijke en ruimtelijke overlapping van de twee stralen worden bereikt in de laser. Een ingebouwde elektro-optische modulator (EOM) is speciaal ontworpen voor SRS-microscopie. Dit protocol zal zich richten op het koppelen van de laser aan de microscoop en de dagelijkse werking van dit systeem (Figuur 1). De configuratie van een SRS microscoopsysteem evolueert in het laatste decennium. Opgemerkt moet worden dat de volgende beschrijving slechts een van de verschillende configuraties vertegenwoordigt.

  1. Laserstralen in de microscoop voeren
    1. Stel de periscoop in om de straal op te tillen van de uitgang van de picoseconde lichtbron naar de IR-laseringangspoort op de scanner van de microscoop.
      LET OP: Lees voor gebruik de handleiding van het lasersysteem en neem alle nodige voorzorgsmaatregelen, want in de buurt van infraroodstraling die door dit klasse IV-lasersysteem wordt gegenereerd, kan ernstige schade aan de ogen en de huid worden veroorzaakt. Voltooi de trainingen die vereist zijn door de institutionele milieuveiligheidsafdelingen. Draag een veiligheidsbril en een labjas met geboeide mouwen.
    2. Stel eerst de pompstraal in op 750 nm en verlaag het laservermogen tot 50 mW, dat visueel kan worden geïnspecteerd, waardoor de uitlijning wordt affilieerd. Gebruik vervolgens een straaluitzeter(figuur 1,L1 en L2) om de straaldiameter aan te passen aan de achtergrondopening van microscoopdoelen. Gebruik twee relaisspiegels(afbeelding 1,M1 en M2) om de laserstraal naar de periscoop te leiden(figuur 1,P1 en P2). De periscoop tilt de straal naar de hoogte van de scanneropening en dient ook als stuurspiegel voor uitlijning.
    3. Stel de knoppen op de periscoop in het midden van het stembereik in en kies de beginpositie en hoek van elke spiegel, zodat de laserstraal ongeveer het midden van de spiegel raakt.
    4. Voer de grove uitlijning uit met behulp van een lege poort op de objectieve geschutskoepel en plaats de vermogensmetersonde om het vermogen van het verzonden licht te meten. Stel de scanner van de microscoop in op de hoogste zoom (50x) en meet vervolgens de kracht van het verzonden licht met de scherpgelichte laserstraalspot. Optimaliseer de knoppen op elke spiegel, M1 en M2, iteratief om het hoogste overgedragen laservermogen te bereiken.
    5. Voer de fijne uitlijning uit met het uitlijningsgereedschap. Plaats de uitlijndop van het fluorescentiedoel op de lege objectieve stoel en stel de knoppen van M1 in om de plek te centreren. Introduceer vervolgens de verlengbuis voor het doel en stem de knoppen van M2 af om de plek te centreren.
    6. Herhaal stap 1.1.4 en 1.1.5 totdat de balk het doel op beide posities centreert.
  2. Detectie en elektronica aansluiten
    1. Stel de SRS-detectiemodule in. Plaats een beam splitter cuber achter de condensor om de overgedragen laser naar de fotodiodemodule te sturen. De module bevat een telescoop om de straalgrootte door te geven en te wijzigen om in het actieve gebied van het fotodiode te passen, evenals een optisch filter om de gemoduleerde Stokes-straal te verwijderen en de pompstraal door te laten voor demodulatie.
    2. De elektronicaverbinding instellen (Afbeelding 1). De intensiteit van de Stokes-straal wordt gemoduleerd door een ingebouwde EOM op 20 MHz in de picoseconde afstembare laser. De modulatiefrequentie-uitgang van de laser wordt ingevoerd in de lock-in versterker als referentiefrequentie voor demodulatie. Voer het uitgangssignaal van het fotodiode in de lock-in versterker voor het demoduleren van de SRL.
      OPMERKING: De one-box lasersystemen kunnen worden geüpgraded en dus kunnen hun specificaties variëren als gevolg van verschillende productiedatums. De vorige versie van picosecond tunable lasersysteem, gebruikt in dit protocol, heeft een Stokes-straal van 1.064 nm, maar de recente versie heeft een Stokes-straal van 1.031 nm. De modulatiefrequentie van EOM die in dit protocol wordt gebruikt, is aangepast aan 8 MHz, maar de standaard modulatiefrequentie voor het recente systeem kan 10 of 20 MHz zijn.
    3. Voer ten slotte de lock-in versterkeruitgang in de analoge doos van de microscoop om elektrisch analoog signaal om te zetten in digitaal signaal. Het systeem moet klaar zijn om het SRS-signaal te verwerken.
  3. Optimaliseer beeldvormingsomstandigheden
    1. Maak een chemisch monster voor systeemuitlijning. Gebruik bijvoorbeeld dodecane om de microscoop te optimaliseren, omdat dodecane een zeer sterk SRS-signaal heeft van de C-H-bindingen. Gebruik een veilige afdichting om een minikamer te maken; doe 5 μL dodecane en bedek het met een coverlip.
      OPMERKING: Vervang het doderietmonster zodra het er onduidelijk uitziet of vuil bevat, door een nieuw monster dat gedurende 2-3 maanden kan worden gebruikt voor uitlijning.
    2. Plaats het monster op het microscoopstadium. Concentreer je goed op de vloeistofdruppel. Het kan sneller worden gedaan door te zoeken naar de rand van het dodecane pad. Stel de condensor in voor kohlerverlichting.
    3. Stel de beeldparameters in. Controleer of de vertragingsfase op de juiste nummers staat. Stel de golflengte van de pompstraal in op 795,8 nm. Controleer met behulp van een IR-sensorkaart en IR-viewer of het pompstraalpad nog steeds correct is.
    4. Stel het vermogen van de pompstraal in op 200 mW en de Stokes-balk op 400 mW op het picoseconde systeembedieningspaneel.
      OPMERKING: De laserdoorvoeren van laseruitgang naar postdoelstelling van de twee stralen zijn ongeveer 25% voor de pomp en 14% voor Stokes voor deze systeemopstelling. Daarom is een post objectief vermogen van pompstraal ongeveer 50 mW en voor Stokes-balk ongeveer 56 mW. De pulsbreedte van het recente picoseconde lasersysteem is veranderd van 6 ps naar 2 ps, daarom moet het toegepaste laservermogen nog lager zijn.
    5. Stel de versterking van de lock-in versterker in op maximaal. Open de sluiter voor zowel de stralen als het hoofdluik van de laser.
    6. Scan het voorbeeld en controleer de afbeelding op het computerscherm. Verander de weergavemodus in Hi-Lo in de beeldvormingssoftware. Pas het bereik aan om een verzadiging van ~ 50% te zien. Controleer of de verzadiging in de afbeelding is gecentreerd. Zo niet, pas dan de stuurspiegels, M1 en M2, zorgvuldig aan om de beeldintensiteit te maximaliseren en de piekintensiteit te centreren.
    7. Verfijn de vertragingsfase en zoek de maximale SRS-signaalintensiteit van het dodecanemonster. Het systeem is dan klaar voor gebruik.

2. Voorbereiding van C. elegans monsters voor SRS microscopie beeldvorming

OPMERKING: Als modelorganismen is bewezen dat Caenorhabditis elegans zeer nuttig zijn voor meerdere beeldvormingstechnieken. Ze zijn transparant voor het hele lichaam, daarom kunnen verschillende weefsels in het intacte dier worden afgebeeld zonder dat er dissectie nodig is. In C. elegans worden neutrale lipiden opgeslagen in lipidedruppels in de darm, die bestaat uit 20 epitheelcellen die zich bisymmetrisch rond het darmlumenbevinden 16. Hypodermale cellen en oöcyten slaan ook lipiden op. De belangrijkste vorm van opslaglipiden in C. elegans lipidedruppels zijn de triacylglycerolen (TAGs)17, die sterke SRS-signalen genereren vanwege de overvloed aan CH2-bindingen die aanwezig zijn in hun vetzuurketens. Deze sectie zal zich richten op het voorbereiden van C. elegans monsters voor SRS microscopie beeldvorming en kwantificering van hun totale intestinale lipide opslag niveaus.

  1. Voorbereiding van de beeldvormende dia's
    1. Bereid eerst 2% agarose-oplossing in gedestilleerde H2O en zorg ervoor dat alle agarose smelt voordat u de agarose pads bereidt.
    2. Voeg een druppel warme 2% agarose toe aan een lege dia (ongeveer 100 μL) die tussen steundia's met twee lagen laboratoriumtape wordt geplaatst en plaats snel een tweede dia bovenop de eerste dia. Druk voorzichtig om een dun, zelfs agarose pad te maken.
    3. Zet deze dia's in gesloten positie opzij en scheid ze niet totdat de wormen klaar zijn om te worden gemonteerd. Bereid nieuwe dia's voor elke beeldvormingssessie, omdat de pads na 1 dag drogen.
      OPMERKING: Gebruik multi-well imaging kamers, als beeldvorming meerdere wormen in high-throughput genetische schermen18. Gebruik live imaging opstellingen om spatio-temporele dynamiek van lipidenmetabolisme door ontwikkeling en veroudering in beeld tebrengen 19.
  2. Montage van de wormen
    1. Bereid het verdovingsmiddel voor door natrium azide of levamisole in M9-buffer toe te voegen aan de uiteindelijke concentratie van respectievelijk 100 mM of 1 mM.
      OPMERKING: Gebruik levamisole als de wormen moeten worden hersteld na beeldvorming voor genotypering na genetische schermen.
      LET OP: Verschillende verdovende middelen, waaronder natrium azide en levamisole, zijn schadelijk bij inademing. Draag beschermende handschoenen en kleding en gebruik een chemische zuurkast bij het voorbereiden van die werkoplossingen.
    2. Plaats een druppel verdovingsmiddel op een afdeklip (ongeveer 4–5 μL voor 10–20 wormen).
      OPMERKING: Pas de hoeveelheid van het verdovingsmiddel aan op basis van het wormnummer om de wormen zo dicht mogelijk bij elkaar te houden. Het gebruik van te veel vloeistof voor weinig wormen kan ervoor zorgen dat de wormen zich verspreiden op het agarosepad.
    3. Kies de wormen die moeten worden afgebeeld onder de dissectiemicroscopie en breng ze over naar de druppel van het verdovingsmiddel. Nadat alle wormen aan de druppel zijn toegevoegd, verplaatst u ze met behulp van de wormkiezer en zorgt u ervoor dat ze niet met elkaar overlappen.
    4. Scheid de glazen dia's (van stap 2.1) zonder het agarosepad te storen.
    5. Bedek de wormdruppel met de glazen glijbaan met het agarosepad. Zorg ervoor dat de agarose pad is gericht op de wormen. Als alternatief kan de verdovende verouderingsdruppel ook aan het agarosepad worden toegevoegd en kunnen wormen worden bedekt met de coverslip.
    6. Markeer ten slotte de locatie van de wormen met behulp van een permanente markering op de glazen glijbaan.

3. Beeldverwerving en -analyse

  1. Het verkrijgen van de beelden met behulp van het SRS microscoopsysteem.
    1. Voordat u een monster in beeld brengen, moet u de beeldparameters bepalen en SRS-signalen verifiëren (zoals uitgelegd in Protocol 1).
    2. Monteer de glijbaan met de afdeklip naar de objectieve lens gericht. Schakel de heldere veldlichtbron in en richt deze naar het oculair om de wormen te lokaliseren.
      OPMERKING: Gebruik een 20x objectieve lens om de lipidenopslag in de hele darm in beeld te houden. Overweeg het gebruik van een 60x objectieve lens om hypodermale vetopslag in beeld te brengen of om lipidedruppelgrootte / -getal te kwantificeren.
    3. Breng de wormen scherp en pas de condensorpositie dienovereenkomstig aan.
    4. Schakel de lichtbron voor helder veld uit en schakel over naar de laserscaneenheid. Begin met het scannen van de eerste worm met een snelle scansnelheid (bijv. 512 x 512 pixels) en pas de fijne focus aan om het interessegebied te vinden. Als u het eerste monster wilt laten zien, past u de laservermogens aan op het niveau waarop SRS-signalen niet verzadigd zijn.
    5. Schakel over naar een langzamere scansnelheid (bijv. 2 μs/pixel) en een hogere resolutie (bijv. 1024 x 1024 pixels) om de SRS-afbeelding te verkrijgen.
      OPMERKING: Houd de laservermogens constant voor elk monster dat tijdens de beeldvormingssessie in beeld moet worden genomen.
    6. Sla de SRS-afbeelding op in de gewenste indeling die een hoge resolutie mogelijk maakt (zoals een .tiff bestand). Afhankelijk van de gebruikte imaging-software en -installatie, slaat u de locatie van de eerste worm op voordat u naar de volgende worm gaat.
    7. Volledige beeldvorming van alle wormen die op de glijbaan zijn gemonteerd. Schakel de sluiter uit om de laserstralen te blokkeren. Schakel de laserbron pas uit als alle monsters in beeld zijn.
    8. Verwijder de dia voordat u de volgende voorbeelddia plaatst. Herhaal stap 3.1.2–3.1.7.
    9. Zodra alle monsters in beeld zijn gebracht, zet u de laserbron op stand-by en schakelt u de bijbehorende apparatuur uit, inclusief de versterker, de detector, de microscoop en de computer.
  2. Analyse van afbeeldingen met ImageJ
    1. Open de afbeeldingsbestanden (meestal .tiff) die in ImageJ moeten worden gekwantificeerd door de bestanden te selecteren en ze naar het ImageJ-venster te slepen en neer te zetten. Download de juiste ImageJ-plug-ins als u specifieke Olympus-microscoopformaten gebruikt (zoals .oib-bestanden).
    2. Selecteer de eigenschappen die moeten worden geanalyseerd (Analyseren > Metingen instellen). Selecteer Area, Min en Max Gray Value en Mean Gray value voor de totale kwantificering van lipidenopslag.
    3. Gebruik het gereedschap polygoonselectie en schets het gebied van de wormdarm dat moet worden gekwantificeerd. Als u de parameters wilt meten die zijn geselecteerd in stap 3.2.2, klikt u op Analyseren > meten. Er verschijnt een nieuw venster met de meetresultaten. Herhaal deze stap voor alle geopende afbeeldingen.
    4. Selecteer de metingen voor alle wormen in een bepaald genotype en kopieer/plak de resultaten in een nieuw werkblad. Herhaal de stappen 3.2.1–3.2.4 voor alle genotypen in dezelfde beeldvormingssessie.
    5. Selecteer een gebied in de buurt van de worm dat geen SRS-signaal heeft, om als achtergrond te kwantificeren. Zorg ervoor dat het gebied dat is geselecteerd voor achtergrondmeting geen bacteriën of vuil bevat dat ook een SRS-signaal kan geven.
    6. Trek de gemiddelde grijswaarde van de achtergrond af van de metingen van elke afzonderlijke worm. Bereken de gemiddelde en standaardafwijking van de achtergrond afgetrokken gemiddelde grijswaarden van alle wormen in een bepaald genotype/testgroep. Normaliseer deze waarde tot het gemiddelde van de besturingsgroep.
    7. Voer ten slotte de juiste statistische analyse uit met behulp van de gemiddelde grijswaarde als maat voor lipideniveaus in elke worm. Gebruik meestal de t-testvan de student voor twee groepen en gebruik ANOVA in één keer met een geschikte meervoudige vergelijkingstest voor meer dan twee groepen.
      OPMERKING: Wanneer u afbeeldingen selecteert voor figuurpresentatie, moet u ervoor zorgen dat die geselecteerde afbeeldingen dezelfde pixelintensiteitsverdeling hebben. Stel de helderheid en het contrast in op dezelfde waarden voor alle afbeeldingen in dezelfde afbeelding(Afbeelding > Pas > helderheid en contrast aan).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Insulinesignalering is een belangrijke endocriene route die van invloed is op ontwikkeling, reproductie, levensduur en metabolisme. Bij wormen bestaat insulinesignalering uit ongeveer 40 insuline-achtige peptide liganden, insuline-achtige groeifactor receptor ortholog DAF-2, downstream PI3K/AKT kinase cascade, en de FoxO transcriptie factor ortholog, DAF-1620. daf-2 mutanten, die de insulinereceptor missen, hebben meer lipidedruppels in hun darm, het wormlipideopslagweefsel

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Ter verdediging tegen obesitas en de bijbehorende metabole stoornissen zijn belangrijke onderzoeksinspanningen geïmplementeerd om de regulerende mechanismen van lipidehomeostase beter te begrijpen. Voor kwantitatieve detectie van lipidemoleculen in biologische monsters is bewezen dat labelvrije beeldvorming door SRS-microscopie een betrouwbaar alternatief is voor biochemische assays en andere kleuringsmethoden. Onze groep en anderen hebben nieuwe biologische mechanismen in lipide metabole regulatie onthuld door het gebru...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets bekend te maken.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door NIH-subsidies R01AG045183 (M.C.W.), R01AT009050 (M.C.W.), R01AG062257 (M.C.W.), DP1DK113644 (M.C.W.), March of Dimes Foundation (M.C.W.), Welch Foundation (M.C.W.), en door HH.C.W.). We danken het Caenorhabditis Genetics Center (CGC) voor C. elegans stammen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
A/D converterOlympusAnalog Unit
AgaroseGeneMate3119Voor het maken van agarose pads
Alignment tool - adapterThorlabsSM1A4Voor het monteren van het gereedschap op de scope
Alignment tool - targetThorlabsVRC2SM1Voor het bekijken van IR-laser
Alignment tool - tubeThorlabsSM1L40Lengte kan variëren
Autocorrelator (Optioneel)APEpulseCheck
Bandpass filterminicircuitsBBP-21.4+ als gemoduleerd op 20MHz of KR Electronics 2724 als gemoduleerd op 8 MHzVoor signaal met modulatiefrequentie filteren
BNC kabels
DissectiemicroscoopNikonSMZ800Voor het handelen en plukken van wormen voor beeldvorming
DodecaneSigma-Aldrich44010Gebaat voor kalibratie van het SRS signaal
FilterChroma Technology890/220 CARSVoor het verwijderen van de Stokes straal
Algemene laboratorium etiketteertapeVWR89097Voor het maken van agarose pads
Glazen dekglasjesVWR48393-106Voor het bedekken van wormen voor beeldvorming
Glazen microscoopglaasjeVWR16004-422Voor het maken van agarose pads
Laser scanning microscoopOlympusFV3000
LensThorlabsL1: AC254-050-B
L2: AC254-075-B		Voor bundeluitbreider
Lock-in versterkerZurichHF2LI
LaagdoorlaatfilterminicircuitsBLP-1.9+Voor stroomvoorziening ruisonderdrukking
SpiegelsThorlabsBB1-E03Voor relais en periscoop
ObjectiefOlympusUPlanSAPO 20x 0.75, UPlanSAPO 60XW 1.20
FotodiodeThorlabsFDS1010
Picoseconde laserbronAPEpicoEmerald
VoedingTEKPOWERTP1342UVoor fotodiode, omgekeerde 50V spanning
NatriumazidSigmaS2002Voor het anestheseren van de wormen
Worm pickerWormStuff59-AWP

Referenties

  1. Luppino, F. S., et al. Overweight, obesity, and depression: a systematic review and meta-analysis of longitudinal studies. Archives of General Psychiatry. 67 (3), 220-229 (2010).
  2. Eckel, R. H., et al. Obesity and type 2 diabetes: what can be unified and what needs to be individualized. Diabetes Care. 34 (6), 1424-1430 (2011).
  3. Poirier, P., et al. Obesity and cardiovascular disease: pathophysiology, evaluation, and effect of weight loss. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 26 (5), 968-976 (2006).
  4. Bhaskaran, K., et al. Body-mass index and risk of 22 specific cancers: a population-based cohort study of 5.24 million UK adults. Lancet. 384 (9945), 755-765 (2014).
  5. Shen, Y., Hu, F., Min, W. Raman imaging of small biomolecules. Annual Review of Biophysics. 48, 347-369 (2019).
  6. Daemen, S., van Zandvoort, M., Parekh, S. H., Hesselink, M. K. C. Microscopy tools for the investigation of intracellular lipid storage and dynamics. Molecular Metabolism. 5 (3), 153-163 (2016).
  7. Syed, A., Smith, E. A. Raman imaging in cell membranes, lipid-rich organelles, and lipid bilayers. Annual Review of Analytical Chemistry. 10 (1), Palo Alto, Calif. 271-291 (2017).
  8. Thomas, G. J. Raman spectroscopy of protein and nucleic acid assemblies. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 28, 1-27 (1999).
  9. Evans, C. L., Xie, X. S. Coherent anti-stokes Raman scattering microscopy: chemical imaging for biology and medicine. Annual Review of Analytical Chemistry. 1, Palo Alto, Calif. 883-909 (2008).
  10. Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
  11. Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
  12. Wang, M. C., Min, W., Freudiger, C. W., Ruvkun, G., Xie, X. S. RNAi screening for fat regulatory genes with SRS microscopy. Nature Methods. 8 (2), 135-138 (2011).
  13. Wei, L., Yu, Y., Shen, Y., Wang, M. C., Min, W. Vibrational imaging of newly synthesized proteins in live cells by stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (28), 11226-11231 (2013).
  14. Wei, L., et al. Live-cell imaging of alkyne-tagged small biomolecules by stimulated Raman scattering. Nature Methods. 11 (4), 410-412 (2014).
  15. Ramachandran, P. V., Mutlu, A. S., Wang, M. C. Label-free biomedical imaging of lipids by stimulated Raman scattering microscopy. Current Protocols in Molecular Biology. 109, 31(2015).
  16. Srinivasan, S. Regulation of body fat in Caenorhabditis elegans. Annual Review of Physiology. 77, 161-178 (2015).
  17. Vrablik, T. L., Petyuk, V. A., Larson, E. M., Smith, R. D., Watts, J. L. Lipidomic and proteomic analysis of Caenorhabditis elegans lipid droplets and identification of ACS-4 as a lipid droplet-associated protein. Biochimca Et Biophysica Acta. 1851 (10), 1337-1345 (2015).
  18. Yu, Y., Mutlu, A. S., Liu, H., Wang, M. C. High-throughput screens using photo-highlighting discover BMP signaling in mitochondrial lipid oxidation. Nature Communications. 8 (1), 865(2017).
  19. Kelley, L. C., et al. Live-cell confocal microscopy and quantitative 4D image analysis of anchor-cell invasion through the basement membrane in Caenorhabditis elegans. Nature Protocols. 12 (10), 2081-2096 (2017).
  20. Murphy, C. T., Hu, P. J. Insulin/insulin-like growth factor signaling in C. elegans. WormBook. , 1-43 (2013).
  21. Shi, X., et al. Regulation of lipid droplet size and phospholipid composition by stearoyl-CoA desaturase. Journal of Lipid Research. 54 (9), 2504-2514 (2013).
  22. Watts, J. L., Ristow, M. Lipid and carbohydrate metabolism in Caenorhabditis elegans. Genetics. 207 (2), 413-446 (2017).
  23. Kimura, K. D., Tissenbaum, H. A., Liu, Y., Ruvkun, G. daf-2, an insulin receptor-like gene that regulates longevity and diapause in Caenorhabditis elegans. Science. 277 (5328), 942-946 (1997).
  24. Kwon, E. S., Narasimhan, S. D., Yen, K., Tissenbaum, H. A. A new DAF-16 isoform regulates longevity. Nature. 466 (7305), 498-502 (2010).
  25. Chen, A. T., et al. Longevity genes revealed by integrative analysis of isoform-specific daf-16/FoxO mutants of Caenorhabditis elegans. Genetics. 201 (2), 613-629 (2015).
  26. Lee, R. Y., Hench, J., Ruvkun, G. Regulation of C. elegans DAF-16 and its human ortholog FKHRL1 by the daf-2 insulin-like signaling pathway. Current Biology. 11 (24), 1950-1957 (2001).
  27. Mutlu, A. S., Gao, S. M., Zhang, H., Wang, M. C. Olfactory specificity regulates lipid metabolism through neuroendocrine signaling in Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 11 (1), 1450(2020).
  28. Chen, A. J., et al. Fingerprint Stimulated Raman Scattering imaging reveals retinoid coupling lipid metabolism and survival. Chemphyschem: a European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 19 (19), 2500-2506 (2018).
  29. Li, X., et al. Quantitative imaging of lipid synthesis and lipolysis dynamics in Caenorhabditis elegans by Stimulated Raman Scattering microscopy. Analytical Chemistry. 91 (3), 2279-2287 (2019).
  30. Lin, C. J., Wang, M. C. Microbial metabolites regulate host lipid metabolism through NR5A-Hedgehog signalling. Nature Cell Biology. 19 (5), 550-557 (2017).
  31. Fu, D., et al. In vivo metabolic fingerprinting of neutral lipids with hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy. Journal of the American Chemical Society. 136 (24), 8820-8828 (2014).
  32. Perez, C. L., Van Gilst, M. R. A 13C isotope labeling strategy reveals the influence of insulin signaling on lipogenesis in C. elegans. Cell Metabolism. 8 (3), 266-274 (2008).
  33. Elle, I. C., Rodkaer, S. V., Fredens, J., Faergeman, N. J. A method for measuring fatty acid oxidation in C. elegans. Worm. 1 (1), 26-30 (2012).
  34. Ezcurra, M., et al. elegans eats its own intestine to make yolk leading to multiple senescent pathologies. Current Biology. 28 (16), 2544-2556 (2018).
  35. Lu, F. K., et al. Label-free DNA imaging in vivo with stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 11624-11629 (2015).
  36. Long, R., et al. Two-color vibrational imaging of glucose metabolism using stimulated Raman scattering. Chemical Communications. 54 (2), Cambridge, England. 152-155 (2018).
  37. Zhao, Z., Shen, Y., Hu, F., Min, W. Applications of vibrational tags in biological imaging by Raman microscopy. Analyst. 142 (21), 4018-4029 (2017).
  38. Liao, C. S., et al. In vivo and in situ spectroscopic imaging by a handheld Stimulated Raman Scattering Microscope. ACS Photonics. 5 (3), 947-954 (2018).
  39. Lee, H. J., et al. Assessing cholesterol storage in live cells and C. elegans by stimulated Raman scattering imaging of phenyl-Diyne cholesterol. Scientific Reports. 5, 7930(2015).
  40. Wang, P., et al. Imaging lipid metabolism in live Caenorhabditis elegans using fingerprint vibrations. Angewandte Chemie (International Edition in English). 53 (44), 11787-11792 (2014).
  41. Chen, W. W., et al. Spectroscopic coherent Raman imaging of Caenorhabditis elegans reveals lipid particle diversity. Nature Chemical Biology. 16 (10), 1087-1095 (2020).
  42. Freudiger, C. W., et al. Stimulated Raman Scattering microscopy with a robust fibre laser source. Nature Photonics. 8 (2), 153-159 (2014).
  43. Brinkmann, M., et al. Portable all-fiber dual-output widely tunable light source for coherent Raman imaging. Biomedical Optics Express. 10 (9), 4437-4449 (2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Kwantificering van lipidedruppelsSRS microscopie opstellinginsulinesignaleringsmutantenDaf 16 isovormanalyseregulatie van het lipidenmetabolismehyperspectrale SRS beeldvorming
Labelvrije beeldvorming van lipideopslagdynamiek bij Caenorhabditis elegans met behulp van gestimuleerde Raman-verstrooiingscopie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.