Methodenartikel

Celvrije productie van proteoliposomen voor functionele analyse en antilichaamontwikkeling gericht op membraaneiwitten

DOI:

10.3791/61871

⸱

22 september 2020

 , 
1Graduate School of Medicine, Ehime University, 2Proteo-Science Center, Ehime University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft een efficiënte celvrije methode voor de productie van hoogwaardig proteoliposoom door middel van een bilayer-dialysemethode met behulp van een tarwecelvrij systeem en liposomen. Deze methode biedt geschikte middelen voor functionele analyse van membraaneiwitten, screening van medicijndoelen en ontwikkeling van antilichamen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Membraaneiwitten spelen een essentiële rol in verschillende cellulaire processen en vervullen vitale functies. Membraaneiwitten zijn medisch belangrijk bij het ontdekken van geneesmiddelen omdat ze het doelwit zijn van meer dan de helft van alle geneesmiddelen. Een obstakel voor het uitvoeren van biochemische, biofysische en structurele studies van membraaneiwitten en de ontwikkeling van antilichamen is de moeilijkheid om grote hoeveelheden hoogwaardig membraaneiwit te produceren met de juiste conformatie en activiteit. Hier beschrijven we een "bilayer-dialysemethode" met behulp van een tarwekiemcelvrij systeem, liposomen en dialysebekers om efficiënt membraaneiwitten te synthetiseren en gezuiverde proteolisomen in korte tijd te bereiden met een hoog slagingspercentage. Membraaneiwitten kunnen zoveel worden geproduceerd als in enkele milligrammen, zoals GPCR's, ionkanalen, transporters en tetraspaninen. Deze celvrije methode draagt bij aan het verminderen van de tijd, kosten en moeite voor het bereiden van hoogwaardige proteoliposomen en biedt geschikte middelen voor functionele analyse van membraaneiwitten, screening van medicijndoelen en de ontwikkeling van antilichamen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Membraaneiwitten zijn een van de belangrijkste medicijndoelen bij diagnose en therapieën. Inderdaad, de helft van de kleine samengestelde geneesmiddelen zijn membraaneiwitten, zoals G-eiwit-gekoppelde receptoren (GPCR's) en ionkanalen1. In de loop der jaren hebben onderzoekers gewerkt aan biochemische, biofysische en structurele studies van membraaneiwitten om hun structuur en functie op te helderen 2,3. De ontwikkeling van monoklonale antilichamen tegen membraaneiwitten wordt ook actief uitgevoerd om functionele en structurele studies te versnellen en therapeutische en diagnostische toepassingen te ontwikkelen 4,5,6,7,8,9. Al deze studies vereisen een grote hoeveelheid hoogwaardige membraaneiwitten10. Er zijn bijvoorbeeld enkele milligrammen gezuiverde membraaneiwitten met natuurlijke conformatie nodig voor de ontwikkeling van antilichamen. Een veel grotere hoeveelheid sterk gezuiverde membraaneiwitten is nodig voor röntgenkristallografie. Massaproductie van membraaneiwitten blijft echter een knelpunt in membraaneiwitonderzoek11. Membraaneiwitten hebben gecompliceerde structuren met een of meer transmembraan helices en spelen een belangrijke rol bij celhomeostase. Heterologe overexpressie van membraaneiwitten leidt tot meerdere obstakels, zoals aggregatie van membraaneiwitten die zich ophopen bij hoge lokale concentraties of verstoring van cellulaire signaalroutes. Zelfs als de expressie succesvol is, ondervinden volgende stappen van monstervoorbereiding ook problemen. Bijvoorbeeld, de bereiding van proteoliposoom, vereist vaardigheden op hoog niveau en professionele ervaringen in oplosbaarheid, zuivering en stabilisatie van membraaneiwitten, en kost ook veel moeite en tijd12,13.

Aan de andere kant zijn er de afgelopen decennia enkele geavanceerde technologieën ontstaan om eiwitten te produceren zonder het gebruik van levende cellen 14,15,16,17,18. Celvrije eiwitsynthesetechnologie reconstitueert de translatiereactie in een reageerbuis. Omdat er geen beperkingen zijn die het cellulaire expressiesysteem heeft, hebben celvrije systemen het potentieel om een verscheidenheid aan eiwitten te synthetiseren die moeilijk tot expressie te brengen zijn of toxiciteit in cellen vertonen. Gezuiverd celextract of gereconstitueerde translationele machines worden gemengd met sjabloon mRNA's, aminozuren en energiebronnen, en recombinante eiwitten worden in korte tijd gesynthetiseerd. Wat de membraaneiwitsynthese betreft, worden sommige soorten steigers bestaande uit lipiden of amfifielen, zoals liposomen, bicellen, nanodiscs of copolymeren toegevoegd aan de celvrije reactie 19,20,21,22,23,24. Gesynthetiseerde membraaneiwitten interageren met de steigers en kunnen worden gestabiliseerd in water. Celvrije gesynthetiseerde membraaneiwitten worden veel gebruikt in functionele studies en antilichaamproductie 25,26,27,28,29,30,31.

In dit protocol beschrijven we een efficiënte celvrije methode van proteoliposoomproductie met behulp van tarwecelvrij systeem en liposomen. Tarwecelvrij eiwitsynthesesysteem is een krachtig in vitro vertaalsysteem met behulp van extract uit tarwekiemen 15,32,33. Tarwekiemen bevatten een grote hoeveelheid translationele machines en weinig vertaalremmers. De translationele machinerie in tarwe, een lid van eukaryoten, is geschikt voor het vertalen van eukaryote eiwitten en de translatie-efficiëntie ervan wordt nauwelijks beïnvloed door codongebruik van het sjabloon-mRNA. Met behulp van een tarwecelvrij systeem hebben we een verscheidenheid aan eiwitten gesynthetiseerd, waaronder eiwitkinasen34,35, ubiquitine-ligases36, transcriptiefactoren37 en membraaneiwitten met hoge slagingspercentages. Voor de productie van membraaneiwitten voegen we lipideblaaslipoom toe aan het translatiemengsel als steiger19,38. Hydrofobe domeinen van membraaneiwit interageren met lipide bilayer en worden spontaan geïntegreerd met liposoom. Dichtheidsgradiëntcentrifugatie wordt gebruikt om proteoliposoom strikt te scheiden van endogene tarwe-eiwitten, hoewel een gemeenschappelijke centrifugatie van het translatiereactiemengsel voldoende is voor een eenvoudige zuivering van proteoliposoom20. Vele soorten integrale membraaneiwitten zijn gesynthetiseerd met behulp van tarwecelvrij systeem en toegepast voor verschillende onderzoeken en ontwikkelingen 25,38,39,40,41,42,43,44. Bovendien ontwikkelden we de "bilayer-dialysemethode" voor grootschalige productie45,46. Bij deze methode wordt het dialyseapparaat van het cuptype ondergedompeld in de substraatvoedingsbuffer en worden twee lagen translatiereactiemengsel en substraatvoedingsbuffer in de beker gevormd, zoals weergegeven in figuur 1. Continue toevoer van substraten en verwijdering van het bijproduct kunnen gedurende lange tijd efficiënt worden uitgevoerd aan zowel de boven- als de onderkant van het reactiemengsel, wat leidt tot een uitstekende vertaaleffectiviteit (figuur 2A en figuur 2B)45.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Bereiding van pEU-expressieplasmide

OPMERKING: pEU-expressieplasmide moet startcodon, open leesframe van doelmembraaneiwit en stopcodon in het fragment omvatten (zie figuur 1). Voeg indien nodig detectie-/zuiveringstagreeks(en) toe op de juiste positie. Restrictie-enzymvertering of naadloos klonen is van toepassing voor subcloning. Hier beschrijven we een protocol met behulp van een naadloze kloonmethode.

  1. Bereid dna-fragment in.
    1. Versterk het gen van belang door PCR met behulp van de cDNA-sjabloon, primer 1 en primer 2. Primer 1 en primer 2 bevatten respectievelijk 15 bp overlappingen voor naadloos klonen (zie de tabel met materialen).
      OPMERKING: Neem geen sequenties op die moeten worden verwerkt en verwijderd uit volwassen eiwit in de cellen (bijv. signaalsequentie). Verwerking van gesynthetiseerd eiwit wordt niet uitgevoerd in een tarwecelvrij systeem. Voeg geen Kozak-reeks toe. pEU-E01-MCS vector heeft E01 vertaling enhancer.
    2. Voeg 1/25 volume DpnI restrictie-enzym toe aan het PCR-product om sjabloonplasmide-DNA te verwijderen. Incubeer gedurende 30 min bij 37 °C.
    3. Gebruik een PCR-zuiveringskit om het PCR-product te zuiveren en pas de concentratie aan op 20-50 ng/μL.
  2. Lineariseer de pEU-E01-MCS-vector.
    1. Voer inverse PCR uit met pEU-E01-MCS, primer 3 en primer 4.
    2. Voeg 1/25 volume Dpn Irestrictie-enzym toe aan het inverse PCR-product. Incubeer gedurende 30 min bij 37 °C.
    3. Gebruik een PCR-zuiveringskit om het PCR-product te zuiveren volgens de aanbeveling van de fabrikant. Stel de concentratie in op 20-50 ng/μL.
  3. Meng 2 μL insert DNA-fragment, 2 μL lineaire vector en 4 μL 2x naadloos kloonenzymmengsel.
  4. Transformeer Escherichia coli stam JM109 met het naadloze kloonproduct. Verspreid met behulp van een spreader de bacteriële suspensie op een LB-ampicilline agarplaat.
    OPMERKING: pEU-vector heeft een ampicillineweerstandsmarker.
  5. Bevestig de volgorde van de expressieplasmide geconstrueerd met primer 5 en primer 6 van respectievelijk 5' en 3' kant van MCS in pEU plasmide.
  6. Versterk en zuiver de uitdrukking plasmiden.
    1. Kweek de plasmide-getransformeerde E. coli stam JM109 in 150 ml LB-ampicilline medium bij 37 °C en 125 slagen per minuut 's nachts schudden.
    2. Extraheer en zuiver de plasmiden met behulp van in de handel verkrijgbare plasmide prep midi kit. Los plasmiden op in 500 μL TE-buffer.
      LET OP: Gebruik geen mini-voorbereidingskit voor plasmide-extractie. Het biedt niet voldoende kwaliteit en kwantiteit van plasmide.
    3. Voeg 500 μL fenol/chloroform/isoamylalcohol toe (25:24:1). Meng krachtig gedurende 5 minuten en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 17.800 x g en kamertemperatuur. Breng de bovenste plasmide-oplossing over in een nieuwe buis.
      LET OP: Draag wegwerphandschoenen om de huid te beschermen tegen fenol en chloroform.
      OPMERKING: Om verontreiniging van RNase uit plasmide-extractiekit te verwijderen, zuivert u de plasmiden met behulp van fenol-chloroformzuivering.
    4. Voeg 500 μL chloroform toe om fenol volledig te verwijderen. Meng krachtig gedurende 5 minuten en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 17.800 x g en kamertemperatuur. Breng de bovenste plasmide-oplossing over in een nieuwe buis.
    5. Voeg 2,5 volume ethanol en 1/8 volume ammoniumacetaat van 7,5 M toe en bewaar gedurende 1 uur bij -30 °C.
    6. Centrifugeer bij 17.800 x g bij 4 °C gedurende 10 min. Was de pellet met 500 μL 70% ethanol. Verwijder het supernatant voorzichtig en laat de pellet 5 minuten drogen.
    7. Los de expressieplasmiden volledig op in 100 μL ultrapuur water. Meet de concentratie van plasmiden met absorptie bij 260 nm. Stel de concentratie in op 1 mg/ml.

2. In vitro transcriptie

LET OP: Gebruik DNase- en nucleasevrije plastic buizen en tips in stappen van transcriptie en vertaling. Vermijd het autoclaveren van plastic waren om besmetting te voorkomen.

  1. Oogst ultrapuur water in een nieuwe plastic buis.
    LET OP: Gebruik geen DEPC-behandeld water omdat rest-DEPC de reactie sterk remt. Gebruik vers gezuiverd ultrapuur water voor transcriptie en vertaling.
  2. Bereid transcriptiereactiemix voor door 115,2 μL ultrapuur water, 40 μL transcriptiebuffer LM, 20 μL NTP-mengsel, 2,4 μL 80 U/μL RNase-remmer, 2,4 μL 80 U/μL SP6-polymerase en 20 μL pEU-expressieplasmiden te mengen. Meng de reagentia voorzichtig door om te keren. Voer een snelle draai uit.
  3. Incubeer de transcriptiereactie bij 37 °C gedurende 6 uur.
  4. Meng de reactie voorzichtig door om te keren en draai snel naar beneden. Gebruik het onmiddellijk voor vertaling, anders bevriezen en bewaren bij -80 °C.
  5. Bevestig het transcriptieproduct door elektroforese.
    1. Meng 100 ml 1x TAE buffer en 1 g agarose. Verwarm de suspensie in een magnetron om 1% agarose TAE-gel te bereiden.
    2. Neem 1 μL transcriptiereactie en meng met 3 μL water en 4 μL 2x ladende kleurstof.
      OPMERKING: Denaturering van RNA is niet vereist.
    3. Laad 4 μL van het mengsel en 2 μL DNA-laddermarker op de agarose TAE-gel.
    4. Elektroforese bij 100 V gedurende 20 min.
    5. Kleur de gel in ethidiumbromide gedurende 30 min. Controleer het ladderbandpatroon van mRNA met behulp van UV-transilluminator en gel imager.
      OPMERKING: Wanneer een uitgesmeerde band van minder dan 500 bp wordt waargenomen, wordt mRNA-afbraak vermoed.

3. Voorbereiding van vertaalmateriaal

  1. Bereid de vertaalbuffer voor.
    1. Meng 27 ml vers bereid ultrapuur water en 0,75 ml van elke 40x stockoplossing voor S1, S2, S3 en S4, respectievelijk in een buis van 50 ml.
      OPMERKING: Moduleer de hoeveelheden materialen volgens de uiteindelijke vereiste hoeveelheid 1x translatiebuffer.
      LET OP: Bewaar of vries de overtollige 1x translatiebuffer na gebruik niet opnieuw in.
  2. Bereid creatine kinase stock oplossing. Los gelyofiliseerd creatinekinase op in ultrapuur water tot een eindconcentratie van 20 mg / ml. Doseer de oplossing in kleine hoeveelheden (elk 10 tot 50 μL) in 0,2 ml 8-strip PCR-buizen. Vries de buizen in vloeibare stikstof in en bewaar bij -80 °C.
    LET OP: Vries creatinekinase-oplossing niet opnieuw in na het ontdooien.
  3. Was dialysebekers (0,1 ml) om glycerol uit het dialysemembraan te verwijderen.
    OPMERKING: Er zijn verschillende dialysebekers van verschillende grootte. Kleine bekers (0,1 ml) worden gebruikt voor kleinschalige tests (sectie 5.4) en grote bekers (2 ml) voor grootschalige productie (sectie 5.5). De wasstap van het dialysemembraan van grote kopjes is te vermijden.
    1. Doe 1 ml ultrapuur water in een nieuwe buis van 1,5 ml. Plaats een klein dialysebekertje (0,1 ml) in de buis. Voeg 0,5 ml ultrapuur water toe aan de beker.
    2. Incubeer gedurende meer dan 30 minuten bij kamertemperatuur.

4. Bereiding van liposomen

OPMERKING: Hier beschrijven we twee protocollen voor de bereiding van liposomen. De ene gebruikt gebruiksklare gelyofiliseerde liposomen (rubriek 4.1), terwijl de andere liposomen produceert door een dunne lipidenfilm te hydrateren (rubriek 4.2).

  1. Bereid liposomen voor met gelyofiliseerde liposomen.
    OPMERKING: Een gemakkelijkere manier om proteoliposoom te produceren is om in de handel verkrijgbare Asolectine liposoom te gebruiken. Asolectine is een soort natuurlijke lipide geëxtraheerd uit sojabonen.
    1. Open de injectieflacon met 10 mg gelyofiliseerde asolectine-liposomen (zie de tabel met materialen) en voeg 200 μL translatiebuffer (rubriek 3.1) toe aan de onderkant van de injectieflacon. Sluit de injectieflacon af en incubeer gedurende 10 minuten.
    2. Meng krachtig door de injectieflacon gedurende 1 min op de vortex-mixer te zetten.
    3. Steek de injectieflacon in een buis van 50 ml. Draai de buis af door centrifugeren op 500 x g gedurende 1 min.
    4. Breng met behulp van een pipet de Asolectine liposoom suspensie (50 mg lipide / ml) over naar een nieuwe buis van 1,5 ml. Gebruik liposoom onmiddellijk voor translatie, anders bevries in vloeibare stikstof en bewaar bij -80 °C.
  2. Bereid liposomen door een dunne lipidefilm te hydrateren.
    1. Als een lipide in poedervorm wordt verkocht, los dan op in chloroform of geschikt organisch oplosmiddel tot een concentratie van 10-100 mg / ml.
      OPMERKING: Een dunne lipidefilm kan worden bereid met behulp van gezuiverde en / of gesynthetiseerde amfifiele lipiden. De zuiveringsmethode van asolectine is eerder beschreven38. Functioneel gemodificeerde lipiden, zoals gebiotinyleerde lipiden, fluorescerende lipiden en adjuvante lipiden, kunnen worden toegevoegd aan de basale lipiden om functionele liposomen te produceren.
    2. Breng de lipideoplossing met 50 mg lipide(n) over in een verdampingskolf.
    3. Gebruik een roterende verdamper, verdamp het oplosmiddel en verspreid het lipide gelijkmatig over de wand van de kolfbodem om een dunne film van lipide te vormen.
    4. Plaats de kolf in een vacuümdesiccator en laat een nacht onder onderdruk staan om het oplosmiddel volledig te verwijderen.
    5. Voeg 1 ml translatiebuffer toe aan de verdampingskolf. Draai de kolf om de buffer over de dunne lipidenfilm te verspreiden. Incubeer gedurende 5 minuten om de film te hydrateren.
    6. Soniceer de kolf met een ultrasone homogenisator of ultrasone reiniger. Verander af en toe de hoek van de kolf zodat de oplossing de film grondig kan raken. Zorg ervoor dat de dunne lipidenfilm van de bodem wordt afgepeld en volledig en homogeen wordt geëmulgeerd.
      OPMERKING: Elektronenmicrografie van gebiotinyleerde lipiden die liposomen bevatten, is weergegeven in figuur 1.
    7. Breng de liposoomsuspensie (50 mg lipiden /ml) over naar een nieuwe buis van 1,5 ml. Als het niet onmiddellijk moet worden gebruikt, vriest u de liposomen in vloeibare stikstof in en bewaart u het bij -80 °C.

5. In vitro vertaling

  1. Ontdooi het tarwekiemextract snel door de buisjes een paar minuten op kamertemperatuur op water te laten drijven. Meng na het ontdooien onmiddellijk voorzichtig door de buizen om te keren, draai naar beneden en koel op ijs tot gebruik.
    OPMERKING: Vries tarwekiemextract na gebruik in vloeibare stikstof en bewaar bij -80 °C. Het is bestand tegen verschillende vries- / dooicycli.
  2. Ontdooi 20 mg/ml creatinekinase stockoplossing. Meng 5 μL stamoplossing en 45 μL translatiebuffer om 2 mg/ml creatinekinase werkoplossing te bereiden.
    LET OP: Het opnieuw invriezen van creatinekinase wordt niet aanbevolen.
  3. Ontdooi liposomen of mRNA's indien nodig.
  4. Voer een kleinschalige eiwitvertaling uit.
    1. Verwijder water uit zowel de buis als de dialysebeker (0,1 ml), zoals bereid in stap 3.3.2.
    2. Injecteer respectievelijk 1 ml en 300 μl translatiebuffer in de buis en de dialysebeker.
      LET OP: Als de bodem van de dialysebeker het oppervlak van de translatiebuffer in de buis van 1,5 ml niet bereikt, injecteert u een extra buffer van 50-100 μL in de buis.
    3. Bereid het translatiereactiemengsel voor door 15,6 μL translatiebuffer, 2,4 μL 2 mg/ml creatinekinase, 12 μL 50 mg/ml liposomen, 15 μL tarwekiemextract en 15 μL mRNA te mengen. Meng voorzichtig door de buizen om te keren en draai naar beneden.
    4. Zuig 60 μL van het translatiereactiemengsel aan met een pipet van 200 μL.
    5. Steek de pipetpunt in de ondergrond van de translatiebuffer in de dialysebeker. Pipetteer het reactiemengsel langzaam en voorzichtig. Bedek de dialysebeker met een deksel om verdamping te voorkomen.
      OPMERKING: Het reactiemengsel zinkt op natuurlijke wijze naar de bodem van de beker en vormt een dubbellaag. Verstoor de dubbellaag niet door de beker te mengen of te schudden.
  5. Voer een grootschalige vertaling uit (figuur 1).
    1. Giet 22 ml translatiebuffer in een buis van 25 ml. Steek een grote dialysebeker (2 ml) in de buis en voeg 2 ml translatiebuffer toe aan de beker.
    2. Bereid een translatiereactiemengsel door 130 μL translatiebuffer, 20 μL 2 mg/ml creatinekinase, 100 μL 50 mg/ml liposoom, 125 μL tarwekiemextract en 125 μL mRNA te mengen. Meng voorzichtig door te pipetteren.
    3. Zuig al het translatiereactiemengsel (500 μL) op met een pipet van 1.000 μL. Injecteer het translatiereactiemengsel in de dialysebeker op dezelfde wijze als beschreven in stap 5.4.5. Bedek de dialysebeker met een deksel om verdamping te voorkomen.
  6. Incubeer de reacties bij 15 °C gedurende 24 uur.
  7. Meng de reactie goed in de dialysebeker door te pipetteren. Breng de ruwe proteoliposoomsuspensie over in een nieuwe buis.
    OPMERKING: Een buis met platte bodem van 1,5 ml wordt aanbevolen om het proteoliposoom uit de kleinschalige vertaling te verzamelen. Na centrifugatie vormen liposomen compacte en gemakkelijk zichtbare pellets op de onderste hoek van de buis.

6. Zuivering van proteoliposomen

  1. Centrifugeer de buis met ruwe proteoliposoomsuspensie bij 17.800 x g bij 4 °C gedurende 10 minuten.
  2. Verwijder het supernatant. Suspensie de proteoliposoomkorrel in PBS (kleinschalig: 1 ml, grootschalig: 10 ml) door pipetteren.
  3. Herhaal de centrifugatie en het wassen van proteoliposomen voor nog eens twee cirkels.
  4. Voeg na het wassen een kleine hoeveelheid PBS toe en suspensie proteoliposoomkorrels goed door te pipetteren. Meet het volume van de suspensie met behulp van een micropipet. Voeg PBS toe om het volume aan te passen aan 60 μL (kleinschalig) of 500 μL (grootschalig). Breng de ophanging over op een nieuwe buis van 1,5 ml.
  5. Breng 10 μL proteoliposoomsuspensie over naar een nieuwe PCR-buis voor SDS-PAGE. Verdeel de rest van de monsters in kleinere porties voor gebruik indien nodig. Bevries in vloeibare stikstof en bewaar bij -80 °C.

7. SDS-PAGE en CBB kleuring

  1. Voeg 70 μL water en 40 μL 3x SDS-PAGE monsterbuffer toe aan 10 μL proteoliposoomsuspensie.
    LET OP: Kook het SDS-PAGE-monster niet, omdat membraaneiwitten aggregeren en nauwelijks doordringen in acrylamidegel bij elektroforese. Voeg ook voldoende reductiemiddel toe aan de SDS-PAGE-monsterbuffer (bijv. 2-mercaptoethanol bij een eindconcentratie van 3%) om oxidatie te voorkomen.
  2. Plaats een 5% -20% gradiënt SDS-PAGE gel in een elektroforese kamer. Laad 3 μL, 6 μL, 12 μL proteoliposoommonsters, 2 μL eiwitgroottemarker en BSA-standaardseries.
  3. Elektroforese bij 52 mA, 400 V gedurende 30 min.
  4. Kleur de gel 1 uur met CBB-kleurstof. Ontkleur in heet water en scan de gelafbeelding.
  5. Met behulp van NIH Image J-software (https://imagej.nih.gov/ij/) kwantificeert u de bandintensiteit van membraaneiwit in elke baan. Schat de hoeveelheid gesynthetiseerde membraaneiwitten met BSA-standaardseries.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Met behulp van dit protocol kunnen gedeeltelijk gezuiverde proteoliposomen in korte tijd worden verkregen. De representatieve resultaten zijn weergegeven in figuur 2A. Vijfentwintig GPCR's van klasse A, B en C werden met succes gesynthetiseerd met behulp van de bilayer-dialysemethode (kleinschalig) en gedeeltelijk gezuiverd door centrifugatie en bufferwas. Hoewel de hoeveelheid gesynthetiseerde eiwitten varieert afhankelijk van het type eiwit, kan meestal 50 tot 400 μg membraaneiwitten per r...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het gepresenteerde protocol biedt een methode om membraaneiwitten te produceren met een hoog slagingspercentage. Dit protocol is eenvoudig, zeer reproduceerbaar en gemakkelijk op te schalen. Het heeft ook het potentieel om de tijd en kosten van experimenten die een grote hoeveelheid membraaneiwitten verbruiken te verminderen. De bilayer-dialysemethode verbetert de productiviteit met 4-10 keer in vergelijking met de bilayer-methode of dialysemethode (figuur 2B)45. In e...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit onderzoek werd ondersteund door Platform Project for Supporting Drug Discovery en Life Science Research (Basis for Supporting Innovative Drug Discovery and Life Science Research (BINDS)) van AMED onder Grant Number JP20am0101077. Dit werk werd ook gedeeltelijk ondersteund door JSPS KAKENHI Grant Number 20K05709.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
×3 SDS-PAGE sample bufferBevat 10% 2-mercaptoethanol
5-20% gradient SDS-PAGE gelATTOE-D520L
70% ethanolVerdunde ethanol met ultrapuur water.
AgaroseTakara Bio
Ammonium acetateNakalai tesque02406-95Aangezien dit reagens deliquesceerd, los alles op in water na opening en bewaar het op -30°C.
Ampicillin SodiumNakalai tesque02739-74
Asolectin Liposome, gelyofiliseerdCellFree SciencesCFS-PLE-ASLEen phiole bevat 10 mg gelyofiliseerd liposomen.
BSA standaard1000 ng, 500 ng, 250 ng, 125 ng BSA / 10 µL ×1 SDS-PAGE sample buffer
CBB gel stain
cDNA clone van belangPlasmid met cDNA clone of synthetisch DNA-fragment
ChloroformNakalai tesque08402-84
Gekoelde incubatorTemperatuur variërend van 0 tot 40 °C of breder.
Creatine kinaseRoche Diagnostics04524977190
Dialysecup (0,1 mL)Thermo Fisher Scientific69570Slide-A-Lyzer MINI dialyseapparaat, 10K MWCO, 0,1 mL
Dialysecup (2 mL)Thermo Fisher Scientific88404Slide-A-Lyzer MINI dialyseapparaat, 10K MWCO, 2 mL
DNA ladder markerThermo Fisher ScientificSM0311GeneRuler 1 kb DNA Ladder
DpnIThermo Fisher ScientificFD1703FastDigest DpnI
E. coli stam JM109
Elektroforese kamerATTO
Ethanol (99,5%)Nakalai tesque14713-95
Ethidium bromide
Verdampingsfles, 100 mL
Gel imager
Gel scannerWe gebruiken een documentscanner en LED immuninator als vervanger.
LB bouillon
Lipiden van belangAvanti Polar Lipids
MicrocentrifugeTOMYMX-307
NTP mixCellFree SciencesCFS-TSC-NTPMengsel van ATP, GTP, CTP, UTP, elk 25 mM
Nuclease-vrij 25 mL buisjeIWAKI362-025-MYP
Nuclease-vrije plastic buisjesWatson bio labsNiet autoclaveren. Gebruik ze gescheiden van andere experimenten.
Nuclease-vrije tipsWatson bio labsNiet autoclaveren. Gebruik ze gescheiden van andere experimenten.
PBS buffer
PCR zuiveringskitMACHEREY-NAGEL740609NucleoSpin Gel en PCR Clean-up
pEU-E01-MCS vectorCellFree SciencesCFS-11
Fenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1)Nippon Gene311-90151
Plasmid prep Midi kitMACHEREY-NAGEL740410NucleoBond Xtra Midi
Primer 1Thermo Fisher ScientificCustom oligo synthese5’-CCAAGATATCACTAGnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn-3’
Genspecifieke primer, voorwaarts. Hoofdletters tonen overlapsequentie die moet worden toegevoegd voor naadloos klonen. Kleine letters nnnn…. (20-30 bp) toont genspecifieke sequentie.
Primer 2Thermo Fisher ScientificCustom oligo synthese5'-CCATGGGACGTCGACnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn-3’
Genspecifieke primer, achterwaarts. Hoofdletters tonen overlapsequentie die moet worden toegevoegd voor naadloos klonen. Kleine letters nnnn…. (20-30 bp) toont genspecifieke sequentie.
Primer 3Thermo Fisher ScientificCustom oligo synthese5'-GTCGACGTCCCATGGTTTTGTATAGAAT-3'
Voorwaartse primer voor vector linearisatie. Onderstreeping werkt als overlap bij naadloos klonen.
Primer 4Thermo Fisher ScientificCustom oligo synthese5'-CTAGTGATATCTTGGTGATGTAGATAGGTG-3'
Achterwaartse primer voor vector linearisatie. Onderstreeping werkt als overlap bij naadloos klonen.
Primer 5Thermo Fisher ScientificCustom oligo synthese5’-CAGTAAGCCAGATGCTACAC-3’
Sequencing primer, voorwaarts
Primer 6Thermo Fisher ScientificCustom oligo synthese5’- CCTGCGCTGGGAAGATAAAC-3’
Sequencing primer, achterwaarts
Eiwitgrootte markerBio-Rad1610394Precision Plus Protein Standard
Rotorverdamper
naadloos klonen enzym mengselNew England BioLabsE2611LGibson Assembly Master Mix
Andere naadloze klonering reagentia zijn ook verkrijgbaar.
SP6 RNA Polymerase & RNase InhibitorCellFree SciencesCFS-TSC-ENZ
Submarien elektroforese systeem
TAE buffer
Transcriptie Buffer LMCellFree SciencesCFS-TSC-5TB-LM
Translatie bufferCellFree SciencesCFS-SUB-SGCSUB-AMIX SGC (×40) stockoplossing (S1, S2, S3, S4).
Bereid ×1 translatie buffer voor gebruik door S1, S2, S3, S4 stockoplossing en ultrapuur water te mengen.
Ultrapuur waterWe raden aan om ultrapuur water te bereiden door elke keer dat u experimenteert, een ultrapuur waterproductiesysteem te gebruiken. Niet autoclaveren.
We bereidden ultrapuur water voor door de Milli-Q Reference en Elix10 system te gebruiken.
Commercieel verkrijgbaar nuclease-vrij water (niet

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Santos, R., et al. A comprehensive map of molecular drug targets. Nature Reviews. Drug Discovery. 16 (1), 19-34 (2017).
  2. Gusach, A., et al. Beyond structure: emerging approaches to study GPCR dynamics. Current Opinion in Structural Biology. 63, 18-25 (2020).
  3. Congreve, M., de Graaf, C., Swain, N. A., Tate, C. G. Impact of GPCR Structures on Drug Discovery. Cell. 181 (1), 81-91 (2020).
  4. Wilkinson, T. C. I. Discovery of functional monoclonal antibodies targeting G-protein-coupled receptors and ion channels. Biochemical Society Transactions. 44 (3), 831-837 (2016).
  5. Hino, T., Iwata, S., Murata, T. Generation of functional antibodies for mammalian membrane protein crystallography. Current Opinion in Structural Biology. 23 (4), 563-568 (2013).
  6. Webb, D. R., Handel, T. M., Kretz-Rommel, A., Stevens, R. C. Opportunities for functional selectivity in GPCR antibodies. Biochemical Pharmacology. 85 (2), 147-152 (2013).
  7. Douthwaite, J. A., Finch, D. K., Mustelin, T., Wilkinson, T. C. I. Development of therapeutic antibodies to G-protein coupled receptors and ion channels: Opportunities, challenges and their therapeutic potential in respiratory diseases. Pharmacology and Therapeutics. 169, 113-123 (2016).
  8. Hashimoto, Y., Yagi, K., Kondoh, M. Current progress in a second-generation claudin binder, anti-claudin antibody, for clinical applications. Drug Discovery Today. 21 (10), 1711-1718 (2016).
  9. Hutchings, C. J., Colussi, P., Clark, T. G. Ion channels as therapeutic antibody targets. mAbs. 11 (2), 265-296 (2019).
  10. Errey, J. C., Fiez-Vandal, C. Production of membrane proteins in industry: The example of GPCRs. Protein Expression and Purification. 169, 105569(2020).
  11. Pandey, A., Shin, K., Patterson, R. E., Liu, X. Q., Rainey, J. K. Current strategies for protein production and purification enabling membrane protein structural biology. Biochemistry and Cell Biology. 94 (6), 507-527 (2016).
  12. Wiseman, D. N., et al. Expression and purification of recombinant G protein-coupled receptors: a review. Protein Expression and Purification. 167, 105524(2020).
  13. Jeffery, C. J. Expression, Solubilization, and Purification of Bacterial Membrane Proteins. Current Protocols in Protein Science. 83 (1), 1-15 (2016).
  14. Spirin, A. S., Baranov, V. I., Ryabova, L. A., Ovodov, S. Y., Alakhov, Y. B. A continuous cell-free translation system capable of producing polypeptides in high yield. Science. 242 (4882), 1162-1164 (1988).
  15. Takai, K., Sawasaki, T., Endo, Y. Practical cell-free protein synthesis system using purified wheat embryos. Nature Protocols. 5 (2), 227-238 (2010).
  16. Endo, Y., Sawasaki, T. Cell-free expression systems for eukaryotic protein production. Current Opinion in Biotechnology. 17 (4), 373-380 (2006).
  17. Shimizu, Y., Kuruma, Y., Ying, B. W., Umekage, S., Ueda, T. Cell-free translation systems for protein engineering. The FEBS Journal. 273 (18), 4133-4140 (2006).
  18. Klammt, C., et al. Cell-free expression as an emerging technique for the large scale production of integral membrane protein. The FEBS Journal. 273 (18), 4141-4153 (2006).
  19. Nozawa, A., et al. A cell-free translation and proteoliposome reconstitution system for functional analysis of plant solute transporters. Plant and Cell Physiology. 48 (12), 1815-1820 (2007).
  20. Nozawa, A., et al. Production and partial purification of membrane proteins using a liposome-supplemented wheat cell-free translation system. BMC Biotechnology. 11 (1), 35-45 (2011).
  21. Henrich, E., Hein, C., Dotsch, V., Bernhard, F. Membrane protein production in Escherichia coli cell-free lysates. FEBS Letters. 589 (15), 1713-1722 (2015).
  22. Henrich, E., Peetz, O., et al. Analyzing native membrane protein assembly in nanodiscs by combined non-covalent mass spectrometry and synthetic biology. eLife. 6, 243(2017).
  23. Shelby, M. L., He, W., Dang, A. T., Kuhl, T. L., Coleman, M. A. cell-free co-translational approaches for producing mammalian receptors: expanding the cell-free expression toolbox using nanolipoproteins. Frontiers in Pharmacology. 10, 744(2019).
  24. Jacobs, M. L., Boyd, M. A., Kamat, N. P. Diblock copolymers enhance folding of a mechanosensitive membrane protein during cell-free expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4031-4036 (2019).
  25. Sackin, H., Nanazashvili, M., Makino, S. I. Direct injection of cell-free Kir1.1 protein into Xenopus oocytes replicates single-channel currents derived from Kir1.1 mRNA. Channels. 9 (4), 196-199 (2015).
  26. Zemella, A., Richter, T., Thoring, L., Kubick, S. A combined cell-free protein synthesis and fluorescence-based approach to investigate GPCR binding properties. Methods in Molecular Biology. 1947 (10), 57-77 (2019).
  27. Vaish, A., Guo, S., Murray, R. M., Grandsard, P. J., Chen, Q. On-chip membrane protein cell-free expression enables development of a direct binding assay: A curious case of potassium channel KcsA-Kv1.3. Analytical Biochemistry. 556, 70-77 (2018).
  28. Suzuki, Y., et al. Functional G-Protein-Coupled Receptor (GPCR) synthesis: the pharmacological analysis of Human Histamine H1 Receptor (HRH1) synthesized by a wheat germ cell-free protein synthesis system combined with asolectin glycerosomes. Frontiers in Pharmacology. 9, 38(2018).
  29. Cortes, S., Barette, C., Beroud, R., De Waard, M., Schaack, B. Functional characterization of cell-free expressed Kv1.3 channel using a voltage-sensitive fluorescent dye. Protein Expression and Purification. 145, 94-99 (2018).
  30. Woznicka-Misaila, A., Juillan-Binard, C., Baud, D., Pebay-Peyroula, E., Ravaud, S. Cell-free production, purification and characterization of human mitochondrial ADP/ATP carriers. Protein Expression and Purification. 144, 46-54 (2018).
  31. Hashimoto, Y., et al. Engineered membrane protein antigens successfully induce antibodies against extracellular regions of claudin-5. Scientific Reports. 8 (1), 8383(2018).
  32. Sawasaki, T., et al. A bilayer cell-free protein synthesis system for high-throughput screening of gene products. FEBS Letters. 514 (1), 102-105 (2002).
  33. Goshima, N., et al. Human protein factory for converting the transcriptome into an in vitro-expressed proteome. Nature Methods. 5 (12), 1011-1017 (2008).
  34. Nemoto, K., Takemori, N., Seki, M., Shinozaki, K., Sawasaki, T. Members of the plant CRK superfamily are capable of trans- and autophosphorylation of tyrosine residues. The Journal of Biological Chemistry. 290 (27), 16665-16677 (2015).
  35. Takeda, H., et al. Comparative analysis of human src-family kinase substrate specificity in vitro. Journal of Proteome Research. 9 (11), 5982-5993 (2010).
  36. Takahashi, H., et al. Establishment of a wheat cell-free synthesized protein array containing 250 human and mouse E3 ubiquitin ligases to identify novel interaction between E3 ligases and substrate proteins. PLoS One. 11 (6), 0156718(2016).
  37. Nozawa, A., et al. Construction of a protein library of Arabidopsis transcription factors using a wheat cell-free protein production system and its application for DNA binding analysis. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 73 (7), 1661-1664 (2009).
  38. Goren, M. A., Nozawa, A., Makino, S. I., Wrobel, R. L., Fox, B. G. Cell-free translation of integral membrane proteins into unilamelar liposomes. Methods in Enzymology. 463, 647-673 (2009).
  39. Nozawa, A., et al. Production and partial purification of membrane proteins using a liposome-supplemented wheat cell-free translation system. BMC Biotechnology. 11 (1), 35(2011).
  40. Renauld, S., et al. Functional reconstitution of cell-free synthesized purified Kv channels. Biochimica Et Biophysica Acta. Biomembranes. 1859 (12), 2373-2380 (2017).
  41. Liu, S., et al. Efficiency and Safety of CRAC Inhibitors in Human Rheumatoid Arthritis Xenograft Models. Journal of Immunology. 199 (5), 1584-1595 (2017).
  42. Jarecki, B. W., Makino, S. I., Beebe, E. T., Fox, B. G., Chanda, B. Function of shaker potassium channels produced by cell-free translation upon injection into xenopus oocytes. Scientific Reports. 3, 1-7 (2013).
  43. David, G., et al. Phosphorylation and alternative translation on wheat germ cell-free protein synthesis of the DHBV large envelope protein. Frontiers in Molecular Biosciences. 6, 138(2019).
  44. Jirasko, V., et al. Proton-detected solid-state NMR of the cell-free synthesized α-helical transmembrane protein NS4B from hepatitis C virus. Chembiochem: A European Journal of Chemical Biology. 21 (10), 1453-1460 (2020).
  45. Takeda, H., et al. Production of monoclonal antibodies against GPCR using cell-free synthesized GPCR antigen and biotinylated liposome-based interaction assay. Scientific Reports. 5, 11333(2015).
  46. Zhou, W., Takeda, H. Production of immunizing antigen proteoliposome using cell-free protein synthesis system. Methods in Molecular Biology. 1868, Clifton, N.J. 49-67 (2018).
  47. Hutchings, C. J., Koglin, M., Marshall, F. H. Therapeutic antibodies directed at G protein-coupled receptors. mAbs. 2 (6), 594-606 (2010).
  48. Raetz, C. R. H., et al. Discovery of new biosynthetic pathways: the lipid A story. Journal of Lipid Research. 50, 103-108 (2009).
  49. Baldridge, J. R., Crane, R. T. Monophosphoryl lipid A (MPL) formulations for the next generation of vaccines. Methods. 19 (1), 103-107 (1999).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Celvrije eiwitsyntheseproductie van membraaneiwittenbereiding van proteoliposomenbilayer dialysemethodetarwekiem systeemliposoomvormingSDS PAGE analysezuivering door centrifugatie

Gerelateerde artikelen