We beschrijven drie methoden van beenmergtransplantatie (BMT): BMT met total-body bestraling, BMT met afgeschermde bestraling en BMT-methode zonder pre-conditionering (adoptieve BMT) voor de studie van klonale hematopoiese in muismodellen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Beenmergtransplantatieprocedures bij muizen om clonal hematopoiese te bestuderen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Clonal hematopoiesis is een veel voorkomende leeftijdsgebonden aandoening die het gevolg is van de accumulatie van somatische mutaties in hematopoëtische stam- en voorlopercellen (HSPCs). Mutaties in drivergenen, die cellulaire fitheid verlenen, kunnen leiden tot de ontwikkeling van uitdijende HSPC-klonen die in toenemende mate aanleiding geven tot nakomelingen leukocyten die de somatische mutatie herbergen. Omdat klaonale hematopoiese is geassocieerd met hartaandoeningen, beroertes en mortaliteit, is de ontwikkeling van experimentele systemen die deze processen modelleren de sleutel tot het begrijpen van de mechanismen die deze nieuwe risicofactor onderbouwen. Beenmergtransplantatieprocedures waarbij myeloablatieve conditionering bij muizen betrokken is, zoals total-body bestraling (TBI), worden vaak gebruikt om de rol van immuuncellen bij hart- en vaatziekten te bestuderen. Gelijktijdige schade aan de beenmergniche en andere bezienswaardigheden, zoals het hart en de hersenen, is echter onvermijdelijk met deze procedures. Zo heeft ons lab twee alternatieve methoden ontwikkeld om mogelijke bijwerkingen veroorzaakt door TBI te minimaliseren of te voorkomen: 1) beenmergtransplantatie met bestralingsafscherming en 2) adoptieve BMT voor niet-geconditioneerde muizen. In afgeschermde organen wordt de lokale omgeving bewaard, waardoor de analyse van klonale hematopoiese mogelijk is, terwijl de functie van ingezeten immuuncellen niet wordt verstoord. De adoptieve BMT voor niet-geconditioneerde muizen heeft daarentegen het extra voordeel dat zowel de lokale omgevingen van de organen als de hematopoëtische niche behouden blijven. Hier vergelijken we drie verschillende hematopoëtische celreconstructiebenaderingen en bespreken we hun sterke punten en beperkingen voor studies naar klonale hematopoiese bij hart- en vaatziekten.
Inleiding
Clonal hematopoiesis (CH) is een aandoening die vaak wordt waargenomen bij oudere personen en optreedt als gevolg van een uitgebreide hematopoëtische stam en voorlopercel (HSPC) kloon met een genetischemutatie 1. Er is gesuggereerd dat tegen de leeftijd van 50, de meeste individuen gemiddeld vijf exonische mutaties in elke HSPC2zullen hebben verworven, maar de meeste van deze mutaties zullen resulteren in weinig of geen fenotypische gevolgen voor het individu. Als een van deze mutaties echter bij toeval een concurrentievoordeel oplevert voor de HSPC , bijvoorbeeld door de proliferatie, zelfvernieuwing, overleving of een ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle procedures met betrekking tot dieronderwerpen zijn goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Universiteit van Virginia.
1. Voorafgaand aan de voorconditionering
- Plaats de ontvangende muizen op met antibiotica aangevuld water (5 mM sulfamethoxazol, 0,86 mM trimethoprim) ~24 uur voorafgaand aan de bestraling. Dit is nodig om infectie te voorkomen, omdat het immuunsysteem na bestraling wordt onderdrukt en gedurende 2 weken na bestraling wordt gehandhaafd. Vul muizen op dit punt aan met een voedings-/hydratatiegel om voeding aan te moedigen en gewichtsverlies en uitdroging na bestraling te vo....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Om het effect van drie BMT/pre-conditioneringsmethoden op donorcelengraftment te vergelijken, werden de fracties van donorcellen in perifeer bloed en hartweefsel geanalyseerd door flowcytometrie na 1 maand post-BMT. Geïsoleerde cellen werden gekleurd voor specifieke leukocytenmarkers om de verschillende subsets van leukocyten te identificeren. In deze experimenten werden wild-type(WT) C57BL/6 (CD45.2) donor beenmergcellen geleverd aan WT B6. SJL-PtprcaPrpcb.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Voor studies naar klonale hematopoiese hebben we drie methoden van BMT beschreven: BMT met totale lichaamsbestraling, BMT met bestraling met gedeeltelijke afscherming en een minder vaak gebruikte BMT-methode waarbij geen pre-conditionering (adoptie-BMT) nodig is. Deze methoden zijn gebruikt om de impact van klonale hematopoiese op hart- en vaatziekten te beoordelen. Onderzoekers kunnen deze methoden dienovereenkomstig aanpassen aan het specifieke doel van hun studie.
Clonal hematopoies.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets bekend te maken.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door amerikaanse national institutes of health subsidies aan K. Walsh (HL131006, HL138014 en HL132564), aan S. Sano (HL152174), American Heart Association grant aan M. A. Evans (20POST35210098), en een Japan Heart Foundation grant aan H. Ogawa.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 0.5ml microcentrifuge | Fisher Scientific | 05-408-121 | algemeen materiaal |
| 1.5ml microcentrifuge | Fisher Scientific | 05-408-129 | algemeen materiaal |
| 1/2 cc LO-DOSE INSULIN SYRINGE | EXELINT | 26028 | algemeen materiaal |
| Absolute Ethanol (200 prfof) | Fisher chemical | 200559 | algemeen materiaal |
| BD 1mL Tuberculin Syringes 25G 5/8 Inch Needle | Becton Dickinson | 309626 | algemeen materiaal |
| BD PrecisionGlide Needle 18G (1.22mm X 25mm) | Becton Dickinson | 395195 | algemeen materiaal |
| Cesium-137 Irradiator | J. L. Shepherd | Mark IV | apparatuur |
| DietGel 76A | Clear H2O | 70-01-5022 | algemeen materiaal |
| Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Life Sciences | 353003 | algemeen materiaal |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 352098 | algemeen materiaal |
| Fisherbrand sterile cell strainers, 70 μm | Fisher Scientific | 22363548 | algemeen materiaal |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | algemeen materiaal |
| Hardened Fine Scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | algemeen materiaal |
| Isothesia (Isoflurane) solution | Henry Schein | 29404 | oplossing |
| Ketamine | Zoetis | 043-304 | injectie |
| Kimwipes Delicate Task Wipers | Kimtech Science | KCC34155 | algemeen materiaal |
| PBS pH7.4 (1X) | Gibco | 10010023 | oplossing |
| RadDisk – Rodent Irradiator Disk | Braintree Scientific | IRD-P M | algemeen materiaal |
| RPMI Medium 1640 (1X) | Gibco | 11875-093 | Medium |
| Sulfamethoxazole and Trimethoprim | TEVA | 0703-9526-01 | injectie |
| Xylazine | Akorn | 139-236 | injectie |
| X-ray irradiator | Rad source | RS-2000 | apparatuur |
Referenties
- Evans, M. A., Sano, S., Walsh, K. Cardiovascular disease, aging, and clonal hematopoiesis. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 15 (1), 419-438 (2020).
- Welch, J. S., et al. The origin and evolution of mutations in acute myeloid leukemia.....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
