Beenmergtransplantatieprocedures bij muizen om clonal hematopoiese te bestuderen

Summary

We beschrijven drie methoden van beenmergtransplantatie (BMT): BMT met total-body bestraling, BMT met afgeschermde bestraling en BMT-methode zonder pre-conditionering (adoptieve BMT) voor de studie van klonale hematopoiese in muismodellen.

Abstract

Clonal hematopoiesis is een veel voorkomende leeftijdsgebonden aandoening die het gevolg is van de accumulatie van somatische mutaties in hematopoëtische stam- en voorlopercellen (HSPCs). Mutaties in drivergenen, die cellulaire fitheid verlenen, kunnen leiden tot de ontwikkeling van uitdijende HSPC-klonen die in toenemende mate aanleiding geven tot nakomelingen leukocyten die de somatische mutatie herbergen. Omdat klaonale hematopoiese is geassocieerd met hartaandoeningen, beroertes en mortaliteit, is de ontwikkeling van experimentele systemen die deze processen modelleren de sleutel tot het begrijpen van de mechanismen die deze nieuwe risicofactor onderbouwen. Beenmergtransplantatieprocedures waarbij myeloablatieve conditionering bij muizen betrokken is, zoals total-body bestraling (TBI), worden vaak gebruikt om de rol van immuuncellen bij hart- en vaatziekten te bestuderen. Gelijktijdige schade aan de beenmergniche en andere bezienswaardigheden, zoals het hart en de hersenen, is echter onvermijdelijk met deze procedures. Zo heeft ons lab twee alternatieve methoden ontwikkeld om mogelijke bijwerkingen veroorzaakt door TBI te minimaliseren of te voorkomen: 1) beenmergtransplantatie met bestralingsafscherming en 2) adoptieve BMT voor niet-geconditioneerde muizen. In afgeschermde organen wordt de lokale omgeving bewaard, waardoor de analyse van klonale hematopoiese mogelijk is, terwijl de functie van ingezeten immuuncellen niet wordt verstoord. De adoptieve BMT voor niet-geconditioneerde muizen heeft daarentegen het extra voordeel dat zowel de lokale omgevingen van de organen als de hematopoëtische niche behouden blijven. Hier vergelijken we drie verschillende hematopoëtische celreconstructiebenaderingen en bespreken we hun sterke punten en beperkingen voor studies naar klonale hematopoiese bij hart- en vaatziekten.

Introduction

Clonal hematopoiesis (CH) is een aandoening die vaak wordt waargenomen bij oudere personen en optreedt als gevolg van een uitgebreide hematopoëtische stam en voorlopercel (HSPC) kloon met een genetische^{mutatie 1}. Er is gesuggereerd dat tegen de leeftijd van 50, de meeste individuen gemiddeld vijf exonische mutaties in elke HSPC²zullen hebben verworven, maar de meeste van deze mutaties zullen resulteren in weinig of geen fenotypische gevolgen voor het individu. Als een van deze mutaties echter bij toeval een concurrentievoordeel oplevert voor de HSPC , bijvoorbeeld door de proliferatie, zelfvernieuwing, overleving of een ....

Protocol

Alle procedures met betrekking tot dieronderwerpen zijn goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Universiteit van Virginia.

1. Voorafgaand aan de voorconditionering

1. Plaats de ontvangende muizen op met antibiotica aangevuld water (5 mM sulfamethoxazol, 0,86 mM trimethoprim) ~24 uur voorafgaand aan de bestraling. Dit is nodig om infectie te voorkomen, omdat het immuunsysteem na bestraling wordt onderdrukt en gedurende 2 weken na bestraling wordt gehandhaafd. Vul muizen op dit punt aan met een voedings-/hydratatiegel om voeding aan te moedigen en gewichtsverlies en uitdroging na bestraling te vo....

Results

Om het effect van drie BMT/pre-conditioneringsmethoden op donorcelengraftment te vergelijken, werden de fracties van donorcellen in perifeer bloed en hartweefsel geanalyseerd door flowcytometrie na 1 maand post-BMT. Geïsoleerde cellen werden gekleurd voor specifieke leukocytenmarkers om de verschillende subsets van leukocyten te identificeren. In deze experimenten werden wild-type(WT) C57BL/6 (CD45.2) donor beenmergcellen geleverd aan WT B6. SJL-Ptprc^aPrpc^b.......

Discussion

Voor studies naar klonale hematopoiese hebben we drie methoden van BMT beschreven: BMT met totale lichaamsbestraling, BMT met bestraling met gedeeltelijke afscherming en een minder vaak gebruikte BMT-methode waarbij geen pre-conditionering (adoptie-BMT) nodig is. Deze methoden zijn gebruikt om de impact van klonale hematopoiese op hart- en vaatziekten te beoordelen. Onderzoekers kunnen deze methoden dienovereenkomstig aanpassen aan het specifieke doel van hun studie.

Clonal hematopoies.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5ml microcentrifuge	Fisher Scientific	05-408-121	general supply
1.5ml microcentrifuge	Fisher Scientific	05-408-129	general supply
1/2 cc LO-DOSE INSULIN SYRINGE	EXELINT	26028	general supply
Absolute Ethanol (200 prfof)	Fisher chemical	200559	general supply
BD 1mL Tuberculin Syringes 25G 5/8 Inch Needle	Becton Dickinson	309626	general supply
BD PrecisionGlide Needle 18G (1.22mm X 25mm)	Becton Dickinson	395195	general supply
Cesium-137 Irradiator	J. L. Shepherd	Mark IV	equipment
DietGel 76A	Clear H2O	70-01-5022	general supply
Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish	Life Sciences	353003	general supply
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	352098	general supply
Fisherbrand sterile cell strainers, 70 μm	Fisher Scientific	22363548	general supply
Graefe Forceps	Fine Science Tools	11051-10	general supply
Hardened Fine Scissors	Fine Science Tools	14090-09	general supply
Isothesia (Isoflurane) solution	Henry Schein	29404	Solution
Ketamine	Zoetis	043-304	injection
Kimwipes Delicate Task Wipers	Kimtech Science	KCC34155	general supply
PBS pH7.4 (1X)	Gibco	10010023	Solution
RadDisk – Rodent Irradiator Disk	Braintree Scientific	IRD-P M	general supply
RPMI Medium 1640 (1X)	Gibco	11875-093	Medium
Sulfamethoxazole and Trimethoprim	TEVA	0703-9526-01	injection
Xylazine	Akorn	139-236	injection
X-ray irradiator	Rad source	RS-2000	equipment