Karakterisering en functionele voorspelling van bacteriën in eierstokweefsels

Samenvatting

Immunohistochemische kleuring en 16S ribosomale RNA-gen (16S rRNA-gen) sequencing werden uitgevoerd om bacteriën in kankerachtige en niet-kankerachtige eierstokweefsels in situ te ontdekken en te onderscheiden. De samenstellings- en functionele verschillen van de bacteriën werden voorspeld met behulp van BugBase en Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States (PICRUSt).

Samenvatting

De theorie van een "steriel" vrouwelijk bovenste voortplantingskanaal stuit op toenemende weerstand als gevolg van vooruitgang in bacteriële detectie. Of eierstokken bacteriën bevatten, is echter nog niet bevestigd. Hierin werd een experiment geïntroduceerd om bacteriën in eierstokweefsels te detecteren. We kozen eierstokkankerpatiënten in de kankergroep en niet-kankerachtige patiënten in de controlegroep. 16S rRNA-gensequencing werd gebruikt om bacteriën in eierstokweefsels te onderscheiden van de kanker- en controlegroepen. Verder voorspelden we de functionele samenstelling van de geïdentificeerde bacteriën met behulp van BugBase en PICRUSt. Deze methode kan ook worden gebruikt in andere ingewanden en weefsels, omdat de afgelopen jaren is bewezen dat veel organen bacteriën herbergen. De aanwezigheid van bacteriën in ingewanden en weefsels kan wetenschappers helpen bij het evalueren van kankerachtige en normale weefsels en kan helpen bij de behandeling van kanker.

Inleiding

Onlangs zijn er steeds meer artikelen gepubliceerd die het bestaan van bacteriën in abdominale vaste ingewanden bewijzen, zoals de nier, milt, lever en eierstok^1,2. Geller et al. vonden bacteriën in pancreastumoren en deze bacteriën waren resistent tegen gemcitabine, een chemotherapeutisch medicijn². S. Manfredo Vieira et al. concludeerden dat Enterococcus gallinarum draagbaar was naar de lymfeklieren, lever en milt, en het kon auto-immuniteit^{stimuleren 3}.

Omdat de baarmoederhals een rol speelt als verdediger, zijn bacteriën in het bovenste vrouwelijke voortplantingskanaal, dat de baarmoeder, eileiders en eierstokken bevat, minimaal onderzocht. De laatste jaren zijn er echter enkele nieuwe theorieën gevestigd. Bacteriën kunnen toegang hebben tot de baarmoederholte tijdens de menstruatiecyclus als gevolg van veranderingen in mucines^4,5. Bovendien bevestigden Zervomanolakis et al. dat de baarmoeder, samen met de eileiders, een peristaltische pomp is die wordt bestuurd door het endocriene systeem van de eierstokken, en deze opstelling stelt bacteriën in staat om het baarmoederslijmvlies, de eileiders en de eierstokken binnen te dringen⁶.

Het bovenste voortplantingskanaal is niet langer een mysterie meer dankzij de ontwikkeling van bacteriële detectiemethoden. Verstraelen et al. gebruikten een barcoded paired-end sequencing methode om baarmoederbacteriën te ontdekken door zich te richten op het V1-2 hypervariabele gebied van het 16S RNA gen⁷. Fang et al. gebruikten barcode-sequencing bij patiënten met endometriumpoliepen en onthulden de aanwezigheid van diverse intra-uteriene bacteriën⁸. Bovendien vonden Miles et al. en Chen et al. door het 16S RNA-gen te gebruiken bacteriën in het genitale systeem van vrouwen die salpingo-oöforectomie en hysterectomie hadden ondergaan, respectievelijk^5,9.

Bacteriën in tumorweefsels hebben de laatste jaren steeds meer aandacht gekregen. Banerjee et al. ontdekten dat de microbioomsignatuur verschilde tussen eierstokkankerpatiënten en controles¹⁰. Eennoxynatronum sibiricum was geassocieerd met tumorstadium en Methanosarcina vacuolata kan worden gebruikt om eierstokkanker te diagnosticeren¹¹. Naast eierstokkanker is bewezen dat andere kankers, zoals maag-, long-, prostaat-, borst-, baarmoederhals- en baarmoederslijmvlies, geassocieerd zijn met bacteriën^{12,13,14,15,16,17,18.} Poore et al. stelden een nieuwe klasse van microbiële oncologische diagnostiek voor, met een vroeg stadium van kankerscreening¹⁹. In dit protocol onderzochten we de verschillen tussen kankerachtige en normale eierstokweefsels door de samenstelling en functie van bacteriën in deze twee weefsels te vergelijken.

Immunohistochemische kleuring en 16S rRNA-gensequencing werden uitgevoerd om de aanwezigheid van bacteriën in de eierstokken te bevestigen. De verschillen en voorspelde functies van de eierstokbacteriën in kankerachtige en niet-kankerachtige eierstokweefsels werden bestudeerd. De resultaten toonden het bestaan van bacteriën in eierstokweefsels. Anoxynatronum sibiricum en Methanosarcina vacuolata waren gerelateerd aan respectievelijk het stadium en de diagnose van eierstokkanker. Zesenveertig significant verschillende KEGG-routes die in beide groepen aanwezig waren, werden vergeleken.

Protocol

Deze studie werd goedgekeurd door de Medisch Institutionele Ethische Commissie van het Eerste Aangesloten Ziekenhuis van Xi'an Jiaotong University (Nr. XJTUIAF2018LSK-139). Geïnformeerde toestemming werd verkregen van alle ingeschreven patiënten.

1. Criteria voor het invoeren van de kankergroep en de controlegroep

1. Voor de kankergroep, inschrijven patiënten die voornamelijk worden gediagnosticeerd met eierstokkanker, en na laparotomie is bewezen dat ze sereuze eierstokkanker hebben door pathologische bevindingen.
2. Neem voor de controlegroep patiënten op die voornamelijk zijn gediagnosticeerd met baarmoeder myoma of baarmoederadenoom, zonder enige ovariële aandoening te vertonen, en die hysterectomie en salpingo-oöforectomie hebben ondergaan.
   OPMERKING: Deze norm is niet definitief. Patiënten met ziekten die de eierstokken niet aantasten en die hysterectomie en salpingo-oöforectomie ondergaan, kunnen ook worden ingeschreven.
3. Sluit patiënten uit met een of meer van de volgende criteria:
   Zwangere vrouwen of vrouwen die borstvoeding geven.
   Het nemen van antibiotica 2 maanden voorafgaand aan de operatie.
   Het hebben van koorts of verhoogde ontstekingsmarkers.
   Het hebben van ontsteking van welke aard dan ook.
   Na neoadjuvante chemotherapie te hebben ondergaan.

2. Verzamel monsters

1. Plaats tijdens de operatie de gereseceerde eierstokken in een steriele buis en plaats de buis in vloeibare stikstof voor transport. Vermijd het aanraken van iets anders tijdens de hele procedure.
2. Scheid de eierstokken in ongeveer 1 cm dikke weefselmonsters met een nieuw steriel pincet onder een laminaire stroomkast. Bewaar de monsters na scheiding bij -80 °C.
   OPMERKING: Alle procedures voor het verzamelen van monsters zijn aseptisch, inclusief het scheiden van de eierstokken.

3. Sequentieer het 16S rRNA-gen

1. Extract DNA.
   1. Voeg 1,2 ml inhibit EX-buffer toe aan een centrifugebuis van 2 ml. Voeg vervolgens 180-220 mg monsters toe aan de buis. Laat het monster volledig mengen (70 °C waterbad gedurende 5 minuten en vervolgens vortex gedurende 15 s).
   2. Centrifugeer de buis gedurende 1 min bij 600 x g.
   3. Plaats 550 μL van het supernatant in een nieuwe buis van 1,5 ml en centrifugeer gedurende 1 minuut bij 600 x g.
   4. Breng 400 μL van het supernatant met 30 μL proteïnase K over in een andere buis van 1,5 ml.
   5. Voeg 400 μL buffer AL toe en gebruik een vortexmixer voor 15 s.
   6. Incubeer bij 70 °C gedurende 10 min.
   7. Voeg 400 μL 96-100% alcohol toe. Gebruik een vortex mixer voor 15 s.
   8. Breng 600 μL mengsel over in een absorptiekolom en centrifugeer gedurende 1 min bij 13700 g. Wissel de onderste buis om. Herhaal deze stap 11 keer.
   9. Voeg 500 μL buffer AW1 toe, centrifugeer gedurende 1 min bij 13.700 x g en vervang de onderste buis.
   10. Voeg 500 μL buffer AW2 toe, centrifugeer gedurende 3 minuten bij 13.700 x g en vervang de onderste buis.
   11. Centrifugeer gedurende 3 min bij 13.700 x g.
   12. Breng het mengsel over in een nieuwe buis van 1,5 ml, voeg 200 μL buffer-ATE toe, incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten en centrifugeer gedurende 1 min bij 13.700 x g.
2. Kwaliteitstesten. Gebruik 1% Sepharose gel elektroforese om de kwaliteit te testen. Voeg 400 ng monster, 120 V, 30 minuten toe. Ideaal resultaat: DNA-concentratie: ≥ 10 ng/μL, DNA-zuiverheid: A260/A280 = 1,8-2,0, bruto DNA: ≥ 300 ng.
3. Bereid de bibliotheken voor met behulp van een 16S metagenomische sequencingkit volgens het protocol van de fabrikant.
   1. Voer PCR uit. Kortom, elke PCR-reactie van 25 μL bevat 12,5 ng monster-DNA als input, 12,5 μL 2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix en 5 μL van elke primer bij 1 μM.
   2. Voer PCR uit met behulp van het volgende protocol: een eerste denaturatiestap uitgevoerd bij 95 °C gedurende 3 minuten, gevolgd door 25 cycli van denaturatie (95 °C, 30 s), gloeien (55 °C, 30 s) en extensie (72 °C, 30 s), en een laatste verlenging van 5 minuten bij 72 °C.
   3. Reinig het PCR-product van de reactiemix met magnetische kralen volgens de instructies van de fabrikant.
   4. Herhaal stap 3.3.1 en 3.3.2.
   5. Kwaliteitstesten. Raadpleeg stap 3.2.
   6. Herhaal stap 3.3.3.
   7. Kwaliteitstesten. Gebruik 1% Sepharose gel elektroforese om onzuiverheid te testen, een spectrofotometer om de zuiverheid te testen, een fluorometer om de concentratie te testen en een RNA-testkit om de integriteit te testen. Volg het protocol van de fabrikant. Normaliseren en poolen van de bibliotheken; vervolgens sequentie (2 x 300 bp paired-end leesinstelling) met behulp van 600 cyclus V3 standaard flowcellen, die ongeveer 100.000 paired-end 2 x 300 base reads produceren.
      OPMERKING: De primersequenties over de volledige lengte: 16S Amplicon polymerasekettingreactie (PCR) Voorwaartse primer: 5' TCGTCGGCAGCGTCAGATGTATAAGA GACAG-[CCTACGGGNGGCWGCAG] en 16S Amplicon PCR Reverse primer: 5' GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-[GACTACHVGGGTATCTAATCC].

4. Analyseer 16S rRNA-gensequencinggegevens

1. Filter de onbewerkte reads van elk monster op basis van sequencingkwaliteit met het softwarepakket QIIME 2-201802²⁰.
   1. Kopieer drie bestanden naar de map: emp-paired-end-sequences_01
      één forward.fastq.gz bestand dat de forward sequence leest,
      één reverse.fastq.gz bestand dat de omgekeerde volgorde bevat, leest,
      één barcodes.fastq.gz bestand dat de bijbehorende barcode leest
   2. Executeren
      qiime tools importeren \
      --type EMPPairedEndSequences \
      --input-path emp-paired-end-sequences_01 \--output-path emp-paired-end-sequences_02.qza
2. Verwijder de primer- en adaptersequenties.
   qiime cutadapt trim-paired \
   --i-demultiplexed-sequences demultiplexed-seqs_02.qza \
   --p-front-f GCTACGGGGGG \
   --p-front-r GCTACGGGGGG \
   --p-error-rate 0 \
   --kwaliteit-cutoff 25 \
   --o-trimmed-sequences trimmed-seqs_03.qza \
   --breedsprakig
3. Verkorte reeks leest waarin beide gepaarde eindkwaliteiten lager zijn dan 25. Zie hierboven --quality-cutoff 25
4. Analyseer de sequencinggegevens.
   1. Verzamel sequenties om operationele taxonomische eenheden (OO's) te vormen met een gelijkenis-cutoff bij 97%.
      qiime vsearch dereplicate-sequences \
      --i-sequences trimmed-seqs_03.qza \
      --o-dereplicated-table table_04.qza \
      --o-dereplicated-sequences rep-seqs_04.qza
      ​
      qiime vsearch cluster-features-closed-reference \
      --i-table table_04.qza \
      --i-sequences rep-seqs_04.qza \
      --i-reference-sequences 97_otus.qza \
      --p-perc-identiteit 0,97 \
      --o-clustered-table-cr-97.qza \
      --o-clustered-sequences rep-seqs-cr-97.qza \
      --o-unmatched-sequences unmatched-cr-97.qza
   2. Bereken voor de OOTA's de relatieve abundantie in elk monster. Overvloed informatie is in tabel-cr-97.qza
5. Gebruik een native Bayesiaanse classifier, die zich richt op de RDP-trainingsset (versie 9; http://sourceforge.net/projects/rdp-classifier/), om alle sequenties te sorteren. In kaart gebrachte taxoninformatie staat in table-cr-97.qza
6. Wijs binnen de gegeven OTU een classificatie toe die de belangrijkste samenhang van de sequenties aan OTU's weerspiegelt. Lijn vervolgens de OTA's uit. Zie table-cr-97.qza en rep-seqs-cr-97.qza
7. Voer op basis van de informatie van de steekproefgroep alfadiversiteit uit (inclusief de Chao 1-, ACE-, Shannon-, Simpson- en Evenness-indexen) en de uniFrac-gebaseerde hoofdcoördinatenanalyse (PCoA).
   qiime tools exporteren \
   --input-pad tabel-cr-97.qza \
   --output-pad geëxporteerd-feature-tabel
   exported-feature-tabel
   
   qiime diversiteit alfa \
   --i-table table-cr-97.qza \
   --p-metrische observed_otus \
   --o-alpha-diversiteit observed_otus_vector.qza
   
   qiime diversiteit beta \
   --i-table table-cr-97.qza \
   --p-metrische braycurtis \
   --o-afstand-matrix unweighted_unifrac_distance_matrix.qza

5. Voorspel de bacteriële functie

1. Om de gerelateerde representatie van de kenmerken van de bacteriën te voorspellen, gebruikt u BugBase²¹. De OTU-invoertabel voor BugBase wordt voorbereid met behulp van de volgende opdrachten.
   biom converteren -i otu_table.biom -o otu_table.txt --naar-tsv
   biom convert -i otu_table.txt -o otu_table_json.biom --table-type="OTU table" --to-json
   OPMERKING: De voorspelling is gebaseerd op zes fenotypecategorieën (Ward et al. ongepubliceerd) (https://bugbase.cs.umn.edu/): Gramkleuring, zuurstoftolerantie, vermogen om biofilms te vormen, inhoud van mobiele elementen, pathogeniciteit en oxidatieve stresstolerantie.
2. Voorspel de functionele samenstelling van een metagenoom door PICRUSt met het gebruik van markergengegevens en een database met referentiegenomen²².
   make_otu_table.py -i microbiome_97/uclust_ref_picked_otus/test_paired_otus.txt -t /mnt/nas_bioinfo/ref/qiime2_ref/97_otu_taxonomy.txt -o otu_table.biom &
   normalize_by_copy_number.py -i otu_table.biom -o normalized_otus.biom
   predict_metagenomes.py -i normalized_otus.biom -o metagenome_predictions.biom
   categorize_by_function.py -i metagenome_predictions.biom -c "KEGG_Pathways" -l 1 -o picrust_L1.biom
   categorize_by_function.py -f -i metagenome_predictions.biom -c KEGG_Pathways -l 1 -o metagenome_predictions. L1.txt
3. Analyseer de verschillen in functies tussen elke groep met behulp van STAMP^23,24. Raadpleeg de citaten om de software te bedienen.

6. Gegevens

1. Gebruik statistische software om de significantie van de bevindingen te berekenen. De indicatie van de statistische significantie moet worden vastgesteld op P < 0,05.
2. Beoordeel verschillen in leeftijd en pariteit door de t-test van student. Beoordeel verschillen in menopauzale status, geschiedenis van hypertensie en diabetes door de chi-kwadraattest. Beoordeel verschillen in het aantal ovariële bacteriële taxa door de Mann-Whitney U-test.

Resultaten

Patiënten
In totaal werden 16 gekwalificeerde patiënten geïncludeerd in de studie. De controlegroep omvatte 10 vrouwen met een diagnose van goedaardige baarmoedertumor (onder hen werden 3 patiënten gediagnosticeerd met baarmoeder myoma en 7 patiënten werden gediagnosticeerd met baarmoederadenoom). Ondertussen bevatte de kankergroep 6 vrouwen met een diagnose van sereuze eierstokkanker (onder hen werden 2 patiënten gediagnosticeerd met stadium II en 2 van hen werden gediagnosticeerd met stadium III). D...

Discussie

Eierstokkanker heeft een opmerkelijke invloed op de vruchtbaarheid van vrouwen²⁵. De meeste patiënten met eierstokkanker worden in een laat stadium gediagnosticeerd en de 5-jaarsoverleving is minder dan 30%¹⁸. Bevestiging van bacteriën in de abdominale vaste ingewanden, waaronder de lever, pancreas en milt, is gepubliceerd. Het bestaan van bacteriën in het bovenste vrouwelijke voortplantingskanaal treedt op omdat de baarmoederhals niet is ingesloten^2,

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
2200 TapeStation Software	Agilgent Verenigde Staten
AmpliSeq for Illumina Library Prep, Indexes, and Accessories	Illumina
Image-pro plus 7	Media Cybernetics
Leica ASP 300S	Leica Biosystems Division of Leica Microsystems
Leica EG 1150	Leica Biosystems Division of Leica Microsystems
Leica RM2235	Leica Biosystems Division of Leica Microsystems
LPS Core monoklonaal antilichaam, clone WN1 222-5	Hycult Biotech
Mag-Bind RxnPure Plus magnetische kralen	Omega Biotek	M1386-00
Mag-Bind Universal Pathogen 96 Kit	Omega Biotek	M4029-01
MiSeq	Illumina	SY-410-1003
Silva database	Max Planck Institute for Marine Microbiology and Jacobs University
the QuantiFluor dsDNA System	Promega	E2670
Trimmomatic	Björn Usadel
ZytoChem Plus (HRP) Anti-Rabbit (DAB) Kit	Zytomed Systems	HRP008DAB-RB