Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Isolatie van levensvatbare vetcellen en stromale vasculaire fractie uit menselijk visceraal vetweefsel geschikt voor RNA-analyse en macrofaagfenotypering

4.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/61884

⸱

27 oktober 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Research Division, Instituto Nacional de Perinatologia, 2Department of Immunobiochemistry, Instituto Nacional de Perinatologia, 3Department of Obstetrics, Instituto Nacional de Perinatologia, 4Department of Academic Programs and Continuing Education, Instituto Nacional de Perinatologia, 5Department of Infectology and Immunology, Instituto Nacional de Perinatologia, 6Clinical Research Branch, Instituto Nacional de Perinatologia, 7Department of Nutrition and Bioprogramming, Instituto Nacional de Perinatologia, 8Department of Human Genetics and Genomics, Instituto Nacional de Perinatologia, Mexico City, Mexico

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol biedt een efficiënte collagenase-verteringsmethode voor isolatie van levensvatbare adipocyten en stromale vasculaire fractie-SVF-cellen uit menselijk visceraal vet in één enkel proces, inclusief methodologie om hoogwaardig RNA uit adipocyten te verkrijgen en fenotypificatie van SVF-macrofagen door kleuring van meerdere membraangebonden markers voor analyse door middel van flowcytometrie.

Samenvatting

Visceraal vetweefsel (VAT) is een actief metabolisch orgaan dat voornamelijk bestaat uit rijpe adipocyten en stromale vasculaire fractie (SVF)-cellen, die verschillende bioactieve moleculen afgeven die metabole, hormonale en immuunprocessen regelen; Momenteel is het onduidelijk hoe deze processen in het vetweefsel worden gereguleerd. Daarom is de ontwikkeling van methoden die de bijdrage van elke celpopulatie aan de pathofysiologie van vetweefsel evalueren, cruciaal. Dit protocol beschrijft de isolatiestappen en biedt de nodige richtlijnen voor het oplossen van problemen voor een efficiënte isolatie van levensvatbare rijpe adipocyten en SVF uit menselijke VAT-biopsieën in één enkel proces, met behulp van een collagenase enzymatische verteringstechniek. Bovendien is het protocol ook geoptimaliseerd om macrofaagsubsets te identificeren en volwassen adipocyten-RNA-isolatie uit te voeren voor genexpressiestudies, waardoor studies kunnen worden uitgevoerd om de interactie tussen deze celpopulaties te ontleden. In het kort worden btw-biopsieën gewassen, mechanisch gehakt en verteerd om een eencellige suspensie te genereren. Na centrifugatie worden rijpe adipocyten geïsoleerd door flotatie uit de SVF-pellet. Het RNA-extractieprotocol zorgt voor een hoge opbrengst van totaal RNA (inclusief miRNA's) uit adipocyten voor stroomafwaartse expressietests. Tegelijkertijd worden SVF-cellen gebruikt om macrofaagsubsets (pro- en anti-inflammatoir fenotype) te karakteriseren door middel van flowcytometrie-analyse.

Inleiding

Wit vetweefsel bestaat niet alleen uit vetcellen of adipocyten, maar ook uit een niet-vette celfractie die bekend staat als stromale vasculaire fractie (SVF), die een heterogene celpopulatie bevat die bestaat uit macrofagen, andere immuuncellen als regulerende T-cellen (Tregs) en eosinofielen, preadipocyten en fibroblasten, omgeven door vasculair en bindweefsel 1,2. Vetweefsel (AT) wordt nu beschouwd als een orgaan dat fysiologische processen reguleert die verband houden met metabolisme en ontsteking door middel van adipokines, cytokines en microRNA's die door verschillende cellen worden geproduceerd en in het weefsel worden afgegeven, met autocriene, paracriene en endocriene effecten 3,4. Bij mensen omvat wit vetweefsel het onderhuidse vetweefsel (SAT) en het viscerale vetweefsel (VAT), met belangrijke anatomische, moleculaire, cellulaire en fysiologische verschillen tussen hen 2,5. SAT vertegenwoordigt tot 80% van de menselijke AT, terwijl VAT zich in de buikholte bevindt, voornamelijk in het mesenterium en het omentum, en metabolisch actiever is6. Bovendien is VAT een endocrien orgaan dat mediatoren afscheidt met een substantiële invloed op het lichaamsgewicht, de insulinegevoeligheid, het lipidenmetabolisme en ontstekingen. Bijgevolg leidt btw-accumulatie tot abdominale obesitas en aan obesitas gerelateerde ziekten zoals diabetes type 2, metabool syndroom, hypertensie en het risico op hart- en vaatziekten, wat een betere voorspeller is van obesitas-gerelateerde mortaliteit 6,7,8,9.

In homeostatische omstandigheden werken adipocyten, macrofagen en de andere immuuncellen samen om het VAT-metabolisme in stand te houden door de afscheiding van ontstekingsremmende mediatoren10. Buitensporige btw-verhoging bevordert echter de rekrutering van geactiveerde T-cellen, NK-cellen en macrofagen. In feite is de verhouding van de macrofagen bij magere btw 5%, terwijl deze verhouding oploopt tot 50% bij obesitas, waarbij macrofaagpolarisatie van ontstekingsremmend naar pro-inflammatoir fenotype ontstaat, waardoor een chronische ontstekingsomgeving ontstaat10,11.

Als gevolg van de obesitaspandemie is er een verbazingwekkend aantal rapporten verschenen over verschillende btw-onderzoeksonderwerpen, waaronder adipocytenbiologie, epigenetica, ontsteking, endocriene eigenschappen en opkomende gebieden zoals extracellulaire blaasjes, onder andere 8,10,12,13. Hoewel de btw-omgeving wordt bepaald door overspraak tussen adipocyten en de residente of aankomende macrofagen, hebben de meeste onderzoeken zich gericht op slechts één celpopulatie en is er weinig informatie over de interactie van deze cellen in btw en hun pathofysiologische gevolgen11,14. Bovendien werden waardevolle studies naar het adipocyt-macrofaag-samenspel in AT uitgevoerd met behulp van cellijnen, zonder de in vivo priming-omstandigheden 11,14,15. Een geschikte strategie om de interactie of de specifieke bijdrage van deze cellen in VAT te ontleden, vereist de isolatie van beide celtypen uit dezelfde vetbiopsie om in vitro assays uit te voeren die de in vivo eigenschappen die het VAT-metabolisme reguleren zo veel mogelijk weerspiegelen.

Hoewel de niet-enzymatische dissociatiemethoden op basis van mechanische krachten om de AT te breken minimale manipulatie garanderen, kunnen deze methoden niet worden gebruikt als het doel is om SVF-cellen te bestuderen, omdat ze een lagere efficiëntie hebben bij celherstel en een lage cellevensvatbaarheid in vergelijking met enzymatische methoden, en er een groter weefselvolume nodig is16,17. Enzymatische vertering met behulp van collagenase is een zachte methode die een adequate vertering van collageen en extracellulaire matrixeiwitten van vezelachtige weefsels zoals WAT18 mogelijk maakt en wordt vaak gebruikt wanneer trypsine niet effectief of schadelijk is19. Het protocol biedt fundamentele richtlijnen voor het oplossen van problemen voor efficiënte isolatie van levensvatbare rijpe adipocyten en SVF-cellen uit menselijke VAT-biopsieën in een enkel proces, met behulp van een collagenase-enzymatische verteringstechniek, en geeft informatie om hoge opbrengsten (hoeveelheid, zuiverheid en integriteit) van totaal RNA uit rijpe adipocyten, inclusief microRNA's, te garanderen voor stroomafwaartse expressietoepassingen. Tegelijkertijd is het protocol geoptimaliseerd om macrofaagsubsets van SVF-cellen te identificeren door middel van de kleuring van meerdere membraangebonden markers voor verdere analyse door middel van flowcytometrie20.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Dit protocol is goedgekeurd door de IRB van het Instituto Nacional de Perinatologia (212250-3210-21002-06-15). Deelname was vrijwillig en alle ingeschreven vrouwen ondertekenden het formulier voor geïnformeerde toestemming.

1. Verzameling van visceraal vetweefsel

  1. Verkrijg btw-biopsieën door middel van gedeeltelijke omentectomie tijdens een keizersnede van gezonde volwassen vrouwen met eenlingzwangerschappen op termijn zonder arbeid.
  2. Ga na de sluiting van de baarmoeder en hemostase verder met het identificeren van het grotere omentum en verleng het op een nat kompres. De blootgestelde AT is BTW.
  3. Lokaliseer het grootste bloedvat en volg een denkbeeldige lijn van 7 x 5 cm naar de grotere omentumbasis.
  4. Identificeer een avasculaire zone en gebruik een Kelly-pincet om de buitenkant van de btw te boren.
  5. Gebruik een Ochsner-pincet om de proximale en distale zijde vast te klemmen in de zone waar de btw werd geboord en gebruik een Metzenbaum-schaar om het weefsel te knippen.
  6. Bind groter omentum met zwarte zijde nummer 1.
  7. Verwijder de Ochsner-tang en evalueer de hemostase.
  8. Plaats de btw-biopsie in een steriele container en transporteer deze onmiddellijk naar het laboratorium.

2. Enzymatische vertering van visceraal vetweefsel en isolatie van rijpe adipocyten en stromale vasculaire fractiecellen

  1. Weeg de btw-biopsie en spoel af met 1x PBS pH 7.4.
  2. Knip 4 g BTW af en gebruik een schaar om het weefsel in kleine stukjes te hakken in een dissectiebak.
  3. Breng gehakte btw over naar een steriele centrifugebuis van 50 ml, voeg 20 ml PBS toe en schud voorzichtig om het teveel aan rode bloedcellen te verwijderen.
  4. Gooi PBS weg en herhaal de procedure twee keer.
  5. Verplaats de btw naar een nieuwe steriele centrifugebuis van 50 ml en voeg 25 ml digestieoplossing toe (0,25% collagenase type II, 5 mM glucose, 1,5% albumine in PBS).
  6. Incubeer bij 37 °C gedurende 60 minuten in een orbitale schudder bij 125 tpm.
  7. Filtreer het verteerde weefsel door drie lagen gaas in een nieuwe steriele centrifugebuis van 50 ml.
  8. Centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
  9. Er worden twee fasen verkregen, een bovenste fase die overeenkomt met rijpe adipocyten, terwijl SFV-cellen in de pellet blijven. Breng de rijpe adipocyten voorzichtig over in een nieuwe steriele centrifugebuis van 50 ml met behulp van een transferpipet.
  10. Voeg 20 ml koude PBS toe, schud voorzichtig en centrifugeer gedurende 5 minuten op 200 x g bij 4 °C.
  11. Gooi PBS weg en herhaal de procedure twee keer.
  12. Gebruik een transferpipet om de rijpe adipocyten voorzichtig over te brengen in een DNase-RNasevrije microcentrifugebuis van 1,5 ml.
  13. Centrifugeer op 200 x g gedurende 1 minuut bij 4 °C en verwijder het teveel aan PBS met behulp van een P200-micropipet. Herhaal deze stap indien nodig.
  14. Breng voorzichtig 300 μL rijpe adipocytensuspensie over in een 1,5 ml DNase-RNasevrije microcentrifugebuisjes. Bewaar rijpe adipocyten bij -80 °C tot RNA-extractie.
    OPMERKING: Adipocyten vormen geen pellet.
  15. Zodra de adipocyten zijn gescheiden (stap 2.9), zuigt u het grootste deel van de digestieoplossing op met een transferpipet, waarbij u de SVF-pellet op de bodem van de buis houdt.
  16. Breng de pellet met SVF-cellen over in een nieuwe centrifugebuis van 50 ml met behulp van een transferpipet.
  17. Was de celpellet voorzichtig en resuspendeer in 20 ml koude 1x PBS door op en neer te pipetteren.
  18. Centrifugeer bij 800 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C en gooi het supernatans snel weg door decanteren.
  19. Voer een tweede wasbeurt uit door stap 2.17 en 2.18 te herhalen.
  20. Voeg 5 ml lysebuffer voor rode bloedcellen in evenwicht met kamertemperatuur (RT) toe aan de SVF-pellet en suspendeer door herhaaldelijk pipetteren. Draai niet vortex.
  21. Incubeer gedurende 5 minuten bij RT en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 800 x g. Verwijder het supernatans voorzichtig met behulp van een transferpipet en gooi het op de juiste manier weg.
  22. Om de lysisbuffer te neutraliseren, voegt u 10 ml koude 1x PBS toe en mengt u voorzichtig totdat de celpellet uiteenvalt.
  23. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 800 x g om SVF-pellet te verkrijgen en gooi PBS weg. Aan de onderkant van de buis moet een witte korrel zichtbaar zijn.
  24. Resuspendeer de cellen in 5 ml 1x PBS bij RT door herhaaldelijk pipetteren en gefilterd door drie lagen gaas in een nieuwe conische buis van 50 ml. Vervolgens zullen deze cellen worden gebruikt voor de karakterisering van macrofaagsubpopulaties door middel van flowcytometrie.

3. RNA-extractie uit rijpe adipocyten

  1. Bereid een schone ruimte voor met behulp van RNase-ontsmettingsspray om RNA-afbraak te voorkomen. Gebruik een set pipetten die gereserveerd zijn voor RNA-procedures. Alle gebruikte buisjes en tips moeten RNasevrij zijn.
  2. Ontdooi de rijpe adipocytensuspensie (punt 2.14) bij 4 °C indien deze bij -80 °C is bewaard.
    NOTITIE: Vermijd meerdere vries-dooicycli.
  3. Lyseer cellen door 1.000 μL reagens op basis van zuur-guanidinium-fenol toe te voegen en meng grondig met een P1000-micropipet om te homogeniseren.
  4. Incubeer gedurende 5 minuten bij RT om de dissociatie van nucleoproteïnecomplexen te stimuleren.
  5. Centrifugeer het lysaat gedurende 5 minuten bij 12.000 x g bij RT. Er worden drie fasen verkregen: een bovenste fase (geel) die overeenkomt met adipocytlipiden, een middelste fase (roze) die overeenkomt met nucleïnezuren en een pellet (cellulair afval).
  6. Verwijder voorzichtig de lipidenlaag met behulp van een P200-micropipet.
  7. Breng de middelste fase over in een nieuwe buis van 2 ml, vermijd verstoring van lipideresten en pellets (ongeveer 700 μL).

4. Zuivering van totaal RNA, inclusief microRNA's

OPMERKING: Een op kolommen gebaseerde totale RNA-zuiveringsmethode wordt gebruikt om totaal RNA van hoge kwaliteit te verkrijgen.

  1. Voeg een gelijk volume ethanol (95%-100%) toe aan het monster uit rubriek 3.7, ongeveer 700 μl, en meng met de hand door de buis gedurende 10 s om te keren.
  2. Breng 700 μl van het mengsel over in een kolom die in een opvangbuis is geplaatst, centrifugeer en gooi de doorstroom weg.
  3. Laad de kolom opnieuw en herhaal stap 4.2.
  4. Breng de kolom over in een nieuwe opvangbuis.
  5. Voeg 400 μL voorwasbuffer toe aan de kolom en centrifugeer. Gooi de doorstroom weg en herhaal deze stap.
  6. Voeg 700 μL wasbuffer toe aan de kolom en centrifugeer gedurende 2 minuten.
  7. Breng de kolom voorzichtig over in een nucleasevrije buis.
  8. Voeg 50 μL nucleasevrij water rechtstreeks toe aan de kolommatrix en elueer het RNA door centrifugeren. Bereid aliquots van 10 μl met behulp van microfuge-buizen van 200 μl.
  9. Leg onmiddellijk aliquots op ijs en gebruik een van hen om de RNA-concentratie en zuiverheid te bepalen.
  10. Bereid een aliquot van 5 μL totaal RNA afgesteld op 100 ng/μL om de RNA-integriteit en de microRNA-concentratie te meten.
  11. Bewaren bij -80 °C tot gebruik.

5. Bepaling van de concentratie, zuiverheid en integriteit van volwassen adipocyten-RNA; microRNA-kwantificeringstest

OPMERKING: RNA-concentratie- en zuiverheidsbepalingen worden uitgevoerd met behulp van een UV-VIS spectrofotometer; RNA-integriteit en miRNA-kwantificering worden uitgevoerd met behulp van een RNA-kwaliteitscontroleanalysator.

  1. Was de monsterlezer met water van moleculaire kwaliteit en veeg deze af.
  2. Laad 2 μL elutiewater (blanco), verander de instelling in RNA en klik op de knop Blanco .
  3. Laad 2 μL monster en klik op de knop Meten .
  4. Noteer na het aflezen de verhoudingen A260/A280 en A260/A230 en de hoeveelheid RNA (ng/μL) (Figuur 1A).
    OPMERKING: RNA met een verhouding OD260/OD280 en OD260/OD230 rond de 2,0 wordt als zuiver beschouwd.
  5. Meet het RNA-integriteitsgetal (RIN) met behulp van een RNA-integriteitskit volgens de instructies van de fabrikant (Figuur 1B).
    OPMERKING: EEN RIN =10 komt overeen met intact RNA, terwijl een RIN ≤ 3.0 een sterk afgebroken RNA aangeeft. Gebruik voor expressiemicroarrays of RT-qPCR RNA met RIN ≥ 6.0.
  6. Gebruik een kleine RNA-kit om de concentratie en het percentage microRNA's te bepalen, volgens de instructies van de fabrikant (Figuur 1C).
    OPMERKING: Om overschatting van kleine en micro-RNA's te voorkomen, gebruikt u RNA-monsters met RIN ≥ 6.0.

6. Aantal en levensvatbaarheid van stromale vasculaire fractiecellen

  1. Verdun 10 μl SVF-celsuspensie (sectie 2.24) tot 90 μl 0,4% trypanblauwe oplossing (eindverdunning 1:10) en breng 10 μl aan op een standaard hemocytometer.
  2. Tel de levensvatbare cellen, met uitzondering van de dode cellen, zorgvuldig in vier vierkanten op de hoek van de telkamer.
  3. Bepaal de celconcentratie in de oorspronkelijke suspensie: Celconcentratie = Totaal celgetal/4 x verdunningsfactor (10) x 10.000 = Cellen/ml
  4. Om de verkregen celopbrengst (cellen per gram weefsel) te berekenen, vermenigvuldigt u de celconcentratie met het oorspronkelijke totale monstervolume (in ml) en deelt u dit door het gewicht van het verteerde weefsel (in grammen).
  5. Evalueer de levensvatbaarheid van de cel als het percentage levende cellen als volgt: % Levensvatbaarheid = (Aantal levensvatbare cellen / Totaal aantal cellen) x 100.

7. Karakterisering van macrofaagsubsets uit stromale vasculaire fractie

  1. Breng in totaal 1 x 106 SVF-cellen/ml over in een polypropyleen reageerbuis van 5 ml met ronde bodem voor flowcytometrie en pelletcellen door centrifugatie bij 800 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
  2. Draai voorzichtig om de pellet los te maken en de cellen opnieuw te suspenderen in 100 μL van 1x PBS bij RT.
  3. Voeg een vooraf getitreerde optimale concentratie toe van elk fluorochroom-geconjugeerd monoklonaal antilichaam dat specifiek is voor een celoppervlakantigeen; meng voorzichtig en incubeer gedurende 15 minuten in het donker bij RT.
  4. Voeg een overmaat koude 1x PBS (≈ 1 ml) toe en centrifugeer de SVF op 400 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
  5. Gooi supernatanten snel weg door te decanteren. Pas op dat u de pellet niet verstoort.
  6. Voeg 500 μL 1x lyseeroplossing toe en incubeer 15 minuten bij RT, waardoor de buizen worden beschermd tegen direct licht.
  7. Verwijder de oplossing na centrifuge bij 400 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C en bewaar bij 2-8 °C in het donker tot de gegevensverzameling.
  8. Draai de cellen grondig op lage snelheid om aggregatie te verminderen voordat u ze verwerft.
  9. Resuspendeer de SVF-pellet in 5 ml omhulsvloeistof bij RT en filtreer vervolgens door drie lagen gaas in een nieuwe polypropyleen reageerbuis van 5 ml met ronde bodem vóór analyse door middel van flowcytometrie, om verstopping van de celsorteerlijnen te verminderen.
  10. Draai elke buis kort voor de analyse.
  11. Verkrijg gegevens van de steekproeven die u interesseren. Tel voor stroomanalyse minimaal 10.000 gebeurtenissen.
    OPMERKING: Als u een flowcytometer voor celsortering gebruikt, scheid dan de macrofagen voor toepassing in volgende onderzoeken.

8. Poortstrategie

  1. Zet de hoogte of breedte af tegen het gebied voor Forward Scatter (FSC) om de singletpopulatie te bepalen (Figuur 2A).
  2. Selecteer cellen die het gebied voor Side Scatter (SSC) uitzetten tegen FSC en gooi het celafval weg (Figuur 2B).
  3. Identificeer uit geselecteerde cellen de populaties die CD45 tot expressie brengen als hematopoëtische cellen (Figuur 2C) en CD45/CD14 dubbelpositieve cellen als macrofagen (Figuur 2D).
  4. Detecteer van CD45+/CD14+ macrofagen negatieve en positieve HLA-DR-cellen (Figuur 2E).
    NOTITIE: Neem de compensatiecontroles voor het antilichaampaneel op en pas de spectrale overlap aan op een meerkleurige flowcytometer die geschikt is voor het paneel. We voeren flowcytometrie-analyse uit met behulp van een cytometer die is uitgerust met drie lasers (405 nm violette laser, 488 nm blauwe laser en 640 nm rode laser) en detectoren voor de aangegeven fluorochromen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Dit protocol beschrijft een enzymatische methode waarbij gebruik wordt gemaakt van collagenase-digestie gevolgd door differentiële centrifugatie om in één enkel proces levensvatbare rijpe adipocyten en SVF-cellen te isoleren uit VAT-biopsieën verkregen van gezonde zwangere vrouwen na gedeeltelijke omentectomie. In dit geval gebruiken we de adipocyten voor RNA-extractie en de SVF voor macrofaagfenotypering.

Het RNA-extractieprotocol maakte het mogelijk om RNA te verkrijgen met een voldoende zui...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

BTW speelt een cruciale rol bij metabole regulatie en ontstekingen. Toenemende belangstelling voor de rol van adipocyten en immuuncellen bij de chronische ontsteking die gepaard gaat met obesitas heeft geleid tot de ontwikkeling van verschillende technieken om de SVF en vetcellen die aanwezig zijn in AT te scheiden. De meeste technieken maken het echter niet mogelijk om deze twee verschillende sets cellen die levensvatbaar zijn voor stroomafwaartse toepassingen uit dezelfde btw-biopsie in één enkele procedure te verkrijg...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten om bekend te maken.

Dankbetuigingen

Deze studie werd ondersteund door het Instituto Nacional de Perinatologia (subsidienummers: 3300-11402-01-575-17 en 212250-3210-21002-06-15) en CONACyT, Fondo Sectorial de Investigación en Salud y Seguridad Social (FOSISS) (subsidienummer 2015-3-2-61661).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.2 mL PCR tubesAxygenPCR-02-CRNase, DNase free and nonpyrogenic
1.5 mL microcentrifuge tubesAxygenMCT-150-CRNase, DNase free and nonpyrogenic
10 mL serological pipettesCorningCLS4101-50EAIndividually plastic wrapped
10 µL universal pipet tipAxygenT-300-L-RRNase, DNase free and nonpyrogenic
10 µL universal pipet tipAxygenT-300-R-SRNase, DNase free and nonpyrogenic
1000 µL universal pipet tipAxygenT-1000-B-RRNase, DNase free and nonpyrogenic
2.0 mL microcentrifuge tubeAxygenMCT-200-CRNase, DNase free and nonpyrogenic
200 µL universal pipet tipAxygenT-200-Y-RRNase, DNase free and nonpyrogenic
2100 Bioanalyzer InstrumentAgilentG2939BA-
2101 Bioanalyzer PCAgilentG2953CA2100 Expert Software pre-installed in PC
5 ml Round Bottom Polystyrene Test TubeCorning352003 Snap cap, sterile
50 mL centrifuge tubesCorningCLS430828-100EAPolipropilene, conical bottom and sterile
Acid-guanidinium-phenol based reagentZymo ResearchR2050-1-200TRI Reagent or similar
Agilent RNA 6000 Nano KitAgilent5067-1511-
Agilent Small RNA KitAgilent5067-1548-
APC/Cy7 anti-human CD14 AntibodyBioLegend3256200.4 mg/106 cells, present on monocytes/macrophages, clone HCD14
Baker--250 ml, non sterieel
Bovine serum albuminSigma-AldrichA3912-100GHeat shock fraction, pH 5.2, ≥96%
Chip priming stationAgilent5065-9951-
Collagenase type IIGibco17101-015Powder
D-(+)-GlucoseSigma-AldrichG8270-100GPowder
Direct-zol RNA MiniprepZymo ResearchR2051Supplied with 50 mL TRI reagen
Dissecting forceps--Steel, serrated jaws and round ends
Dissection tray--Roestvrij staal
Ethyl alcoholSigma-AldrichE7023-500ML200 proof, for molecular biology
FACS Flow Sheath FluidBD Biosciences342003-
FACS Lysing SolutionBD Biosciences349202-
FACSAria III Flow Cytometer/Cell SorterBD Biosciences648282-
FASCDiva SoftwareBD Biosciences642868Software v6.0 pre-installed
HemacytometerSigmaZ359629-1EA-
Manual cell counter---
Mayo dissecting scisors--Roestvrij staal
Microcentrifuge--Adjustable temperature
Nanodrop spectrophotometerThermo ScientificND2000LAPTOP-
Orbital shaker--Adjustable temperature and speed
P10 variable volume micropipette Thermo Scientific-Finnpipette46420401 tot 10 μL
P1000 variable volume micropipette Thermo Scientific-Finnpipette4642090100 tot 1000 μL
P2 variable volume micropipette Thermo Scientific-Finnpipette46420100.2 tot 2 μL
P200 variable volume micropipette Thermo Scientific-Finnpipette464208020 tot 200 μL
PCR tube storage rackAxygenR96PCRFSP-
PE/Cy5 anti-human HLA-DR AntibodyBioLegend3076080.0625 mg/106 cells, present on macrophages, clone L243
PE/Cy7 anti-human CD45 AntibodyBioLegend3040160.1 mg/106 cells, present on leukocytes, clone H130
Phosphate buffered salineSigma-AldrichP3813-10PAKPowder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions
Pipette controller---
Red Blood Cells Lysis BufferRoche11 814 389 001For preferential lysis of red blood cells from human whole blood
Refrigerated centrifuge--Whit adapter for 50 mL conical tubes
Sterile Specimen container---
Transfer pipetteThermo Scientific-Samco204-1SSteriel
Trypan BlueGibco15250-0610.4% Solution
Tube racks--For different tube sizes
Vortex Mini ShakerCientifica SENNABV101-

Referenties

  1. Han, S., Sun, H. M., Hwang, K. C., Kim, S. W. Adipose-derived stromal vascular fraction cells: update on clinical utility and efficacy. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 25 (2), 145-152 (2015).
  2. Ibrahim, M. M. Subcutaneous and visceral adipose tissue: structural and functional differences. Obesity Reviews. 11 (1), 11-18 (2010).
  3. Barchetta, I., Cimini, F. A., Ciccarelli, G., Baroni, M. G., Cavallo, M. G. Sick fat: the good and the bad of old and new circulating markers of adipose tissue inflammation. Journal of Endocrinological Investigation. 42 (11), 1257-1272 (2019).
  4. Scheja, L., Heeren, J. The endocrine function of adipose tissues in health and cardiometabolic disease. Nature Reviews Endocrinology. 15 (9), 507-524 (2019).
  5. Ronquillo, M. D., et al. Different gene expression profiles in subcutaneous and visceral adipose tissues from Mexican patients with obesity. Indian Journal of Medical Research. 149 (5), 616-626 (2019).
  6. Mittal, B. Subcutaneous adipose tissue and visceral adipose tissue. Indian Journal of Medical Research. 149 (5), 571-573 (2019).
  7. West-Eberhard, M. J. Nutrition, the visceral immune system, and the evolutionary origins of pathogenic obesity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (3), 723-731 (2019).
  8. Kaminski, D. A., Randall, T. D. Adaptive immunity and adipose tissue biology. Trends in Immunology. 31 (10), 384-390 (2010).
  9. Elffers, T. W., et al. Body fat distribution, in particular visceral fat, is associated with cardiometabolic risk factors in obese women. PLoS One. 12 (9), 0185403(2017).
  10. Macdougall, C. E., et al. Visceral adipose tissue immune homeostasis is regulated by the crosstalk between adipocytes and dendritic cell subsets. Cell Metabolism. 27 (3), 588-601 (2018).
  11. Sarvari, A. K., et al. Interaction of differentiated human adipocytes with macrophages leads to trogocytosis and selective IL-6 secretion. Cell Death & Disease. 6 (1), 1613(2015).
  12. Gao, X., Salomon, C., Freeman, D. J. Extracellular vesicles from adipose tissue-A potential role in obesity and type 2 diabetes. Frontiers in Endocrinology. 8 (1), Lausanne. 202(2017).
  13. Crujeiras, A. B., et al. Genome-wide DNA methylation pattern in visceral adipose tissue differentiates insulin-resistant from insulin-sensitive obese subjects. Translational Research. 178 (1), 13-24 (2016).
  14. Surmi, B. K., Hasty, A. H. Macrophage infiltration into adipose tissue: initiation, propagation and remodeling. Future Lipidology. 3 (5), 545-556 (2008).
  15. Suganami, T., Nishida, J., Ogawa, Y. A paracrine loop between adipocytes and macrophages aggravates inflammatory changes: role of free fatty acids and tumor necrosis factor alpha. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 25 (10), 2062-2068 (2005).
  16. Bellei, B., Migliano, E., Tedesco, M., Caputo, S., Picardo, M. Maximizing non-enzymatic methods for harvesting adipose-derived stem from lipoaspirate: technical considerations and clinical implications for regenerative surgery. Scientific Reports. 7 (1), 10015(2017).
  17. Senesi, L., et al. Mechanical and enzymatic procedures to isolate the stromal vascular fraction from adipose tissue: preliminary results. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7 (1), 88(2019).
  18. Seaman, S. A., Tannan, S. C., Cao, Y., Peirce, S. M., Lin, K. Y. Differential effects of processing time and duration of collagenase digestion on human and murine fat grafts. Plastic and Reconstructive Surgery. 136 (2), 189-199 (2015).
  19. Duarte, A. S., Correia, A., Esteves, A. C. Bacterial collagenases - A review. Critical Reviews in Microbiology. 42 (1), 106-126 (2016).
  20. Bravo-Flores, E., et al. Macrophage populations in visceral adipose tissue from pregnant women: potential role of obesity in maternal inflammation. International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), 1074(2018).
  21. Conde-Green, A., et al. Shift toward mechanical isolation of adipose-derived stromal vascular fraction: review of upcoming techniques. Plastic and Reconstructive Surgery - Global Open. 4 (9), 1017(2016).
  22. Oberbauer, E., et al. Enzymatic and non-enzymatic isolation systems for adipose tissue-derived cells: current state of the art. Cell Regeneration. 4 (7), London, England. 1-14 (2015).
  23. van Dongen, J. A., et al. Comparison of intraoperative procedures for isolation of clinical grade stromal vascular fraction for regenerative purposes: a systematic review. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (1), 261-274 (2018).
  24. Winnier, G. E., et al. Isolation of adipose tissue derived regenerative cells from human subcutaneous tissue with or without the use of an enzymatic reagent. PLoS One. 14 (9), 0221457(2019).
  25. Gentile, P., Piccinno, M. S., Calabrese, C. Characteristics and potentiality of human adipose-derived stem cells (hASCs) obtained from enzymatic digestion of fat graft. Cells. 8 (3), 282(2019).
  26. Hagman, D. K., et al. Characterizing and quantifying leukocyte populations in human adipose tissue: impact of enzymatic tissue processing. Journal of Immunological Methods. 386 (1-2), 50-59 (2012).
  27. Lockhart, R., Hakakian, C., Aronowitz, J. Tissue dissociation enzymes for adipose stromal vascular fraction cell isolation: a review. Journal of Stem Cell Research & Therapy. 5 (12), 1000321(2015).
  28. Condé-Green, A., et al. Comparison between stromal vascular cells' isolation with enzymatic digestion and mechanical processing of aspirated adipose tissue. Plastic and Reconstructive Surgery. 134 (4), 54(2014).
  29. Markarian, C. F., et al. Isolation of adipose-derived stem cells: a comparison among different methods. Biotechnology Letters. 36 (4), 693-702 (2014).
  30. Aguena, M., et al. Optimization of parameters for a more efficient use of adipose-derived stem cells in regenerative medicine therapies. Stem cells international. 2012 (1), 303610(2012).
  31. Yang, X. F., et al. High efficient isolation and systematic identification of human adipose-derived mesenchymal stem cells. Journal of Biomedical Science. 18 (1), 59(2011).
  32. Conde-Green, A., et al. Effects of centrifugation on cell composition and viability of aspirated adipose tissue processed for transplantation. Aesthetic Surgery Journal. 30 (2), 249-255 (2010).
  33. Hoareau, L., et al. Effect of centrifugation and washing on adipose graft viability: a new method to improve graft efficiency. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 66 (5), 712-719 (2013).
  34. Xie, Y., et al. The effect of centrifugation on viability of fat grafts: an evaluation with the glucose transport test. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 63 (3), 482-487 (2010).
  35. Bourin, P., et al. Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and culture expanded adipose tissue-derived stromal/stem cells: a joint statement of the International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) and the International Society for Cellular Therapy (ISCT). Cytotherapy. 15 (6), 641-648 (2013).
  36. Kanneganti, T. D., Dixit, V. D. Immunological complications of obesity. Nature Immunology. 13 (8), 707-712 (2012).
  37. Lee, M. J., Wu, Y., Fried, S. K. Adipose tissue heterogeneity: implication of depot differences in adipose tissue for obesity complications. Molecular Aspects of Medicine. 34 (1), 1-11 (2013).
  38. Raajendiran, A., Tsiloulis, T., Watt, M. J. Adipose tissue development and the molecular regulation of lipid metabolism. Essays in Biochemistry. 60 (5), 437-450 (2016).
  39. Rostam, H. M., et al. The impact of surface chemistry modification on macrophage polarisation. Immunobiology. 221 (11), 1237-1246 (2016).
  40. Chamberlain, L. M., Holt-Casper, D., Gonzalez-Juarrero, M., Grainger, D. W. Extended culture of macrophages from different sources and maturation results in a common M2 phenotype. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103 (9), 2864-2874 (2015).
  41. Williams, M. R., Cauvi, D. M., Rivera, I., Hawisher, D., De Maio, A. Changes in macrophage function modulated by the lipid environment. Innate Immunity. 22 (3), 141-151 (2016).
  42. Baer, P. C., Geiger, H. Adipose-derived mesenchymal stromal/stem cells: tissue localization, characterization, and heterogeneity. Stem Cells International. 2012 (1), 812693(2012).
  43. Bajek, A., et al. Does the liposuction method influence the phenotypic characteristic of human adipose-derived stem cells. Bioscience Reports. 35 (3), 00212(2015).
  44. van Harmelen, V., et al. Effect of BMI and age on adipose tissue cellularity and differentiation capacity in women. International Journal of Obesity and Related Metabolic Disorders. 27 (8), 889-895 (2003).
  45. Hemmrich, K., Denecke, B., Paul, N. E., Hoffmeister, D., Pallua, N. RNA isolation from adipose tissue: an optimized procedure for high RNA yield and integrity. Laboratory Medicine. 41 (2), 104-106 (2010).
  46. Mendez, V., et al. A rapid protocol for purification of total RNA for tissues collected from pigs at a slaughterhouse. Genetics and Molecular Research. 10 (4), 3251-3255 (2011).
  47. Pena, R. N., Canovas, A., Estany, J. Technical note: Efficient protocol for isolation of total ribonucleic acid from lyophilized fat and muscle pig samples. Journal of Animal Science. 88 (2), 442-445 (2010).
  48. Pratt, S. L., Burns, T. A., Owens, M. D., Duckett, S. K. Isolation of total RNA and detection procedures for miRNA present in bovine-cultured adipocytes and adipose tissues. Methods in Molecular Biology. 936 (1), 181-194 (2013).
  49. Cirera, S. Highly efficient method for isolation of total RNA from adipose tissue. BMC Research Notes. 6 (1), 472(2013).
  50. Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Purification of RNA using TRIzol (TRI reagent). Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (6), (2010).
  51. Cho, K. W., Morris, D. L., Lumeng, C. N. Flow cytometry analyses of adipose tissue macrophages. Methods in Enzymology. 537 (1), 297-314 (2014).
  52. Berry, R., Rodeheffer, M. S. Characterization of the adipocyte cellular lineage in vivo. Nature Cell Biology. 15 (3), 302-308 (2013).
  53. Jang, Y., et al. Characterization of adipose tissue-derived stromal vascular fraction for clinical application to cartilage regeneration. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 51 (2), 142-150 (2015).
  54. Nicoletti, G. F., De Francesco, F., D'Andrea, F., Ferraro, G. A. Methods and procedures in adipose stem cells: state of the art and perspective for translation medicine. Journal of Cellular Physiology. 230 (3), 489-495 (2015).
  55. Palumbo, P., et al. Methods of isolation, characterization and expansion of human adipose-derived stem cells (ASCs): an overview. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 1897(2018).
  56. Raposio, E., Bertozzi, N. How to isolate a ready-to-use adipose-derived stem cells pellet for clinical application. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 21 (18), 4252-4260 (2017).
  57. Silva, K. R., et al. Characterization of stromal vascular fraction and adipose stem cells from subcutaneous, preperitoneal and visceral morbidly obese human adipose tissue depots. PLoS One. 12 (3), 0174115(2017).
  58. Wankhade, U. D., Shen, M., Kolhe, R., Fulzele, S. Advances in adipose-derived stem cells isolation, characterization, and application in regenerative tissue engineering. Stem Cells International. 2016 (1), 3206807(2016).
  59. Zavan, B., et al. Persistence of CD34 stem marker in human lipoma: searching for cancer stem cells. International Journal of Biological Sciences. 11 (10), 1127-1139 (2015).
  60. Dey, A., Allen, J., Hankey-Giblin, P. A. Ontogeny and polarization of macrophages in inflammation: blood monocytes versus tissue macrophages. Frontiers in Immunology. 5 (1), 683(2014).
  61. Liddiard, K., Taylor, P. R. Understanding local macrophage phenotypes in disease: shape-shifting macrophages. Nature Medicine. 21 (2), 119-120 (2015).
  62. Prieur, X., et al. Differential lipid partitioning between adipocytes and tissue macrophages modulates macrophage lipotoxicity and M2/M1 polarization in obese mice. Diabetes. 60 (3), 797-809 (2011).
  63. Wang, H., et al. CD68(+)HLA-DR(+) M1-like macrophages promote motility of HCC cells via NF-kappaB/FAK pathway. Cancer Letters. 345 (1), 91-99 (2014).
  64. Yamamoto, Y., et al. Decreased human leukocyte antigen-DR expression in the lipid raft by peritoneal macrophages from women with endometriosis. Fertility and Sterility. 89 (1), 52-59 (2008).
  65. Italiani, P., Boraschi, D. From monocytes to M1/M2 macrophages: phenotypical vs. functional differentiation. Frontiers in Immunology. 5 (1), 514(2014).
  66. Perdiguero, E. G., Geissmann, F. The development and maintenance of resident macrophages. Nature Immunology. 17 (1), 2-8 (2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Isolatie van vetweefselmature adipocytencollagenase digestieRNA extractieflowcytometriecelviabiliteitsassaycentrifugatieprotocolmenselijk visceraal vet
Isolatie van levensvatbare vetcellen en stromale vasculaire fractie uit menselijk visceraal vetweefsel geschikt voor RNA-analyse en macrofaagfenotypering
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.