Ei micro-injectie en efficiënte paring voor genoombewerking in de Firebrat Thermobia domestica

Summary

We bieden een gedetailleerd protocol voor het fokken, micro-injectie van eieren en voor een efficiënte paring van de firebrat Thermobia domestica om mutante stammen te genereren en te onderhouden na genoombewerking.

Abstract

De vuurstilte Thermobia domestica is een ametabolische, vleugelloze soort die geschikt is voor het bestuderen van de ontwikkelingsmechanismen van insecten die hebben geleid tot hun succesvolle evolutionaire straling op aarde. De toepassing van genetische instrumenten zoals genoombewerking is de sleutel tot het begrijpen van genetische veranderingen die verantwoordelijk zijn voor evolutionaire transities in een Evo-Devo-benadering. In dit artikel beschrijven we ons huidige protocol voor het genereren en onderhouden van mutante stammen van T. domestica. We rapporteren een droge injectiemethode, als alternatief voor de gerapporteerde natte injectiemethode, waarmee we stabiel hoge overlevingspercentages in geïnjecteerde embryo's kunnen verkrijgen. We rapporteren ook een geoptimaliseerde omgevingsinstelling om volwassenen te paren en volgende generaties met een hoog rendement te verkrijgen. Onze methode onderstreept het belang om rekening te houden met de unieke biologie van elke soort voor de succesvolle toepassing van genoombewerkingsmethoden op niet-traditionele modelorganismen. We voorspellen dat deze genoombewerkingsprotocollen zullen helpen bij de implementatie van T. domestica als laboratoriummodel en om de ontwikkeling en toepassing van nuttige genetische hulpmiddelen bij deze soort verder te versnellen.

Introduction

Thermobia domestica behoort tot een van de meest basale insectenorden, Zygentoma, die een voorouderlijke ametaboleuze en vleugelloze levenscyclus behoudt. Een dergelijke basale fylogenetische positie en voorouderlijke kenmerken stellen deze soort als een aantrekkelijk model voor het bestuderen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan het succes van insecten op aarde, die meer dan 70% van de beschreven diersoorten bestrijken¹. T. domestica wordt al lang voornamelijk gebruikt om voorouderlijke kenmerken van insectenfysiologie te bestuderen vanwege de geschikte kenmerken als laboratoriummodel, zoals een relatief korte levenscyclus (2,5-3,0 maanden van embryo tot reproductieve volwassene; Figuur 1A) en een gemakkelijke fokkerij. In de afgelopen drie decennia is het gebruik ervan uitgebreid om voorouderlijke kenmerken van verschillende eigenschappen zoals lichaamsplan, neurale differentiatie en circadiane ritmes^2,3,4te onderzoeken.

De toepassing van geavanceerde genetische instrumenten in T. domestica zou dergelijke bijdragen op een breed onderzoeksgebied verder kunnen versnellen. Succesvolle RNA interferentie (RNAi)-gemedieerde gen knockdown in embryo's, nimfen en volwassenen is gemeld in T. domestica^4,5,6. De efficiëntie van systemische RNAi is nog steeds sterk afhankelijk van soorten - het is bijvoorbeeld over het algemeen hoog in coleoptera, terwijl het laag is in de lepidoptera-orde⁷. De efficiëntie en duur van de RNAi knockdown in T. domestica moet nog worden beoordeeld. Naast RNAi, hebben we eerder gemeld een succesvolle CRISPR / Cas9-gemedieerde gen knock-out in T. domestica⁸. Het CRISPR/Cas-systeem is op grote schaal toegepast voor genoombewerking bij insecten, met name voor gerichte gen knock-out. Het gebruik ervan kan worden uitgebreid voor andere toepassingen, zoals genverslaggevertest, cellijntracking en manipulatie van transcriptieactiviteit door exogene constructies in te kloppen na de vaststelling van een protocol voor het leveren van componenten van het CRISPR/Cas-systeem in^{kernen 9}. In combinatie met de gepubliceerde genoomassemblage¹⁰zou het brede gebruik en de verdere ontwikkeling van de CRISPR/Cas-gebaseerde genoombewerking in T. domestica studies vergemakkelijken die zich richten op de evolutionaire mechanismen achter het uitstekende adaptieve succes van insecten. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor embryomicro-injectie en voor het paren van volwassen T. domestica om een mutante stam te genereren met CRISPR/Cas9. Gezien deze nieuwe methode bespreken we het belang van het overwegen van de unieke biologie van niet-traditionele modelsoorten voor succesvolle toepassingen van deze technieken.

Protocol

1. Onderhoud van laboratoriumkolonies

1. Gebruik voor het onderhoud van wildtype- en mutantpopulaties een grote plastic container (460 mm x 360 mm x 170 mm) met regelmatig kunstmatig visvoer, water in plastic bekers met een ventilatiegat aan de bovenkant, een gevouwen papier om de insecten te verbergen en gelaagd katoen voor het leggen van eieren (figuur 2A). Houd alle T. domestica culturen binnen 37 °C incubators en stel de relatieve luchtvochtigheid (RH) in elke container in op 60%–80%.
   OPMERKING: Omdat T. domestica waterdamp uit de atmosfeer^{absorbeert 11}, is een directe watervoorziening niet nodig. De juiste RH wordt gehandhaafd vanwege de aanwezigheid van waterdamp uit plastic bekers met een ventilatiegat aan de bovenkant of van dekselloze kopjes in elke container. Het is niet nodig om te bevochtigen in een hele incubator die culturen bevat. De geschatte duur van elke ontwikkelingsfase onder de in dit protocol beschreven voorwaarde wordt weergegeven in figuur 1. De ontwikkelingssnelheid kon worden aangepast door de temperatuur en/of RH¹²te wijzigen .
2. Voeg periodiek voedsel toe. Voeg water toe voordat het opdroogt.
3. Breng de populaties ten minste om de 3 maanden over naar een nieuwe schone container, aangezien volwassenen stoppen met het leggen van eieren in een vuile omgeving en/of dichte populatie (zie Discussie).

2. Eiverzameling en micro-injectie

1. Ontwerp een gids RNA (gRNA)
   1. Ontwerp een gRNA-sequentie voor elk vereist doel en BLAST de gRNA-sequenties tegen de genoomassemblage om mogelijke off-target herkenningslocaties te controleren.
   2. Synthetiseer en zuiver de gRNA's volgens de instructies van de fabrikant⁸.
      OPMERKING: Als voorbeeld, in het geval van het richten op het ATP-bindende cassettetransporter witte gen, werd een doelsequentie van 20 bp ontworpen en werden twee gesynthetiseerde DNA-oligonucleotiden 5'-TAATACGACTCACTATAGTAAGTGTTGTGGGAC-3' en 5'-TTCTAGCTCTAAAACATCGGTCCCACAACACTTA-3' besteld. Het DNA-sjabloon werd voorbereid door deze twee oligonucleotiden te gloeien, gevolgd door PCR-versterking en het gRNA wordt vervolgens in vitro getranscribeerd uit de sjabloon met een T7 RNA-polymerase.
2. Eierverzamelingskolonies voorbereiden
   1. Breng ongeveer 20 mannelijke en 20 vrouwelijke volwassenen over in een middelgrote container (200 mm x 150 mm x 90 mm) met voedsel, watervoorziening, een gevouwen papier en een klein stukje gelaagd katoen voor het leggen van eieren(figuur 2B).
   2. Stel verschillende kolonies in om in korte tijd een groot aantal geënsceneerde embryo's te verkrijgen die moeten worden gebruikt voor genoombewerking.
      OPMERKING: Naar verwachting worden na 8 uur bij 37 °C ongeveer 20-40 eieren uit een kolonie verzameld. Het duurt meestal een paar dagen voordat overgedragen volwassenen beginnen met het leggen van eieren, mogelijk als gevolg van aanpassing aan een nieuwe omgeving.
3. Vervang op de dag van injectie het katoen in de containers door nieuwe.
4. Plaats een dubbelzijdige tape van 76 mm x 5 mm op een gewone glazen schuif van 76 mm x 26 mm.
5. Verzamel acht uur later de eieren van het gelaagde katoen door de lagen met een tang te scheiden.
6. Lijn de eieren uit op de dubbelzijdige tape met een natte verfborstel en houd een afstand van 2 mm tussen de eieren. Alle eieren moeten zo worden georiënteerd dat de lengteas van een ei naar de injectiezijde kijkt (figuur 3A). Druk de eieren voorzichtig naar beneden met een verfborstel voor stevig vasthouden tijdens de injectie.
   OPMERKING: In dit protocol groeit schimmel snel in beschadigde geïnjecteerde eieren onder natte en warme toestand. Het is belangrijk om de afstand tussen de eieren te houden om kruisbesmetting en uitzetting van schimmel te voorkomen.
7. Meng het gRNA- en Cas9-eiwit tot een uiteindelijke concentratie van respectievelijk 100 ng/μL en 500 ng/μL. Gebruik gedestilleerd water voor verdunning. Incubeer de mix gedurende 10 minuten op kamertemperatuur om de vorming van ribonucleoproteïnecomplex te bevorderen en houd de mix vervolgens op ijs.
   OPMERKING: Neutraal rood bij een eindconcentratie van 1% kan aan de injectieoplossing worden toegevoegd om de geïnjecteerde hoeveelheid te controleren.
8. Laad 2 μL van de gRNA/Cas9-oplossing in een glazen injectiecapillair met een microloader. Zorg ervoor dat er vóór de injectie geen luchtbellen in de oplossing zitten. Tik indien nodig op de naald om de bellen te verwijderen.
   OPMERKING: In dit experiment wordt een kant-en-klare naald gebruikt om een fijne naaldpunt te verkrijgen (figuur 3B). In plaats daarvan zou een zelfgemaakte naald met een vergelijkbare vorm kunnen worden gebruikt.
9. Bevestig de glazen injectiecapillair, eerder geladen met de gRNA/Cas9-oplossing, aan een houder uitgerust met een manipulator en sluit de houder aan op een elektronische micro-injector.
10. Optimaliseer de vorm van de naaldpunt door deze lichtjes te breken met een tang om verstopping te voorkomen en een betere duurzaamheid te krijgen tijdens een reeks injecties (een voorbeeld van een geschikte naald wordt weergegeven in figuur 3C).
    OPMERKING: Het wordt aanbevolen om een naald te verwisselen wanneer deze verstopt is. Het is mogelijk om met dezelfde naald te blijven injecteren als deze opnieuw wordt gebroken met een tang, maar een bredere punt leidt tot meer eischade en verlaagt hun overlevingskans. Omdat T. domestica-eieren zacht en breekbaar zijn, is het houden van een fijne naaldpunt de sleutel voor een hoge overlevingskans na injectie.
11. Steek de naald in het midden van de lengteas van een ei en injecteer een kleine hoeveelheid van de oplossing (zie figuur 3D–H ter referentie over de hoeveelheid injectie). Pas de configuratie van de elektronische micro-injector aan tijdens de injectie, afhankelijk van de vorm van de naaldpunt.
    OPMERKING: Het wordt aanbevolen om tijdens de injectie een constante druk uit te oefenen, anders kan de inhoud van plakkerige eieren gemakkelijk in de glazen naald stromen en deze verstoppen. De oplossing kan zijn om te injecteren met een korte drukpuls of met een constante druk, afhankelijk van de hoeveelheid geïnjecteerde vloeistof. Houd er rekening mee dat wanneer een naaldpunt een brede opening heeft, er te veel oplossing in een ei wordt geïnjecteerd, wat dodelijkheid veroorzaakt (figuur 3F–H). Houd in dat geval een constante vloeistofstroom door constante druk, steek de naald vervolgens in een ei en trek het er onmiddellijk uit. Als het te veel overloop veroorzaakt of het ei barst, verander dan de naald.
12. Bewaar de geïnjecteerde eieren in een recipiënt met de juiste grootte voor het aantal geïnjecteerde eieren (<20 eieren: kleine schaal; >20 eieren: middelgrote recipiënt) met 60%–80% RH en 37 °C.

3. Paring

1. Controleer de geïnjecteerde eieren regelmatig en gooi beschadigde eieren weg met een tang om schimmelgroei te voorkomen(figuur 3I, J). Als er te veel schimmel op een ei groeit, ruim dan het oppervlak van het ei op met 70% EtOH.
2. Voordat u uitkomt (ongeveer 10 dagen bij 37 °C na het leggen van eieren), dompelt u de glazen glijbaan met de geïnjecteerde eieren in talkpoeder om het oppervlak van de dubbelzijdige tape te bedekken. Dit voorkomt het stapelen van uitgebroede nimfen. Breng de gepoedercoate glazen dia's over in een middelgrote container met voedsel, water en een gevouwen papier om de insecten te verbergen.
3. Verwijder de glazen dia's nadat de nimfen zijn uitgebroed. Lever periodiek voedsel tot ze volwassen zijn.
   OPMERKING: Het duurt ongeveer 2,0-2,5 maanden voordat individuen volwassen zijn geworden nadat ze zijn uitgekomen (figuur 1A). Het volwassen stadium wordt beoordeeld op basis van een goed ontwikkelde legboor bij vrouwen (figuur 1B).
4. Om de individuen te paren, breng je zoveel als nodig vrouwelijke volwassenen van een laboratoriumkolonie over naar de middelgrote container en incubeer je ze gedurende ten minste 14 dagen bij 37 °C om er zeker van te zijn dat ze maagd zijn.
   OPMERKING: Het is niet nodig om maagdelijke vrouwtjes uit een laboratoriumkolonie te verzamelen, omdat volwassen T. domestica een herhaalde cyclus van rui en paring hebben die "reproductieve en ruicyclus" wordt genoemd, waarbij vrouwtjes sperma met elke vervelling weggooien en opnieuw paren in de volgende bevruchtingscyclus¹³.
5. Breng een mannelijke of vrouwelijke G0-volwassene die zich heeft ontwikkeld van een geïnjecteerd ei en wildtype volwassene(n) over in een kleine plastic schaal (Ø 100 mm x 40 mm) met voedsel, een gevouwen papier en een klein stukje katoen voor het leggen van G1-eieren(figuur 2C'; paringsschaal). Bewaar de paringsschalen in een grotere bak met 60%–80% RV (Figuur 2C).
   OPMERKING: Meerdere wildtype volwassenen kunnen worden opgenomen in een gerecht om de kans op succesvolle paring te vergroten, hoewel hoge slagingspercentages zijn bereikt met een-op-een-koppeling.

4. Genotyperen

1. Ontwerp PCR-primerparen voor elk gRNA om een 100-200 bp-product te versterken dat de site bevat waarop het gRNA zich richt. BLAST elke primersequentie tegen de genoomassemblage om de specificiteit ervan te controleren (een voorbeeld wordt getoond voor de targeting van het witte gen in figuur 4A).
2. Controleer de kiembaantransformatie van G0-volwassenen.
   1. Verzamel vijf dagen nadat de eieren zijn gelegd individuele G1-eieren van elk G0-volwassen paar in tubes van 0,2 ml (één ei per buis; bewaar verzamelde monsters bij -20 °C voor een langdurige opslag). Scheid de katoenen lagen om de eieren te verzamelen.
      OPMERKING: Het wordt aanbevolen om ten minste 12 G1-nimfen van elk paar te genotyperen om het succes van de kiembaantransmissie te evalueren (zie Representatieve resultaten).
   2. Voeg 15 μL van een 0,25 mg/ml Proteinase K-oplossing (opgelost in Tris-EDTA-buffer) toe aan elke buis, homogeniseer monsters kort met tandenstokers en incubeer gedurende 3 tot 16 uur bij 55 °C.
   3. Activeer de Proteinase K door de monsters gedurende 10 minuten op 95 °C te plaatsen.
   4. Voeg 90 μL gedestilleerd water toe aan elke buis en meng goed. Gebruik 2 μL supernatant in een PCR-reactiemix van 10 μL met de primers die zijn ontworpen in stap 4.1.
      OPMERKING: Het gebruik van een DNA-polymerase geoptimaliseerd voor ruwe sjablonen wordt aanbevolen om voldoende PCR-versterking te bereiken.
   5. Om de PCR-producten te analyseren, voert u een heteroduplex mobility assay (HMA) uit met een microchip-elektroforesesysteem (figuur 3B; zie Ohde et al., 2018)⁸.
      OPMERKING: Mutaties kunnen worden beoordeeld met twee alternatieve methoden: (1) HMA met standaardgelpolymeren, zoals 8% polyacrylamide¹⁴; (2) vertering van PCR-producten met T7-endonuclease gevolgd door agarosegelelektroforese¹⁵.
   6. Bewaar alleen de G1-nimfen als gevolg van G0-volwassenen die mutaties in hun kiembaan bevatten en gooi de anderen weg.
3. Individuele genotypering van G1 nimfen/volwassenen
   1. Isoleer G1 nimfen in 24-put platen met een aspirator of een verfborstel. Plaats de 24-putplaten in een grotere container (bijv. de middelgrote container die in dit protocol wordt gebruikt) met watervoorziening zoals hierboven beschreven om een RH van 60%-80% te houden (figuur 1D). Behoud de aanvoer van kunstmatig regulier visvoer(figuur 1D').
      OPMERKING: Hoewel deze stap op elk punt van nymfale en volwassen stadia kan worden uitgevoerd, wordt aanbevolen om deze uit te voeren na het bereiken van de volwassenheid en vlak voor het koppelen (>2,5 maanden na injectie; Figuur 1B) omdat het gemakkelijker is om brandbrats in een grote container te onderhouden. Individuele opfok is vereist om het genotype van elke G1-nimf op de volgende stappen te volgen. G1 nimfen van dezelfde G0 volwassene kunnen verschillende mutaties hebben.
   2. Knijp en trek cerci en het caudale filament van een nimf/volwassene met behulp van een tang en verzamel ze in een buis van 0,2 ml met 50 μL EtOH (bewaar de verzamelde monsters bij -20 °C voor een langdurige opslag).
      OPMERKING: Weefselmonsters worden verzameld in EtOH omdat het het verlies van deze kleine monsters als gevolg van statische elektriciteit voorkomt. Als men de beweging van insecten moet stoppen, verdoof nimf / volwassene op ijs bij het nemen van weefselmonsters. Omdat T. domestica niet kan overleven na langdurige koeling op ijs, verdoof ze niet langer dan een minuut en verplaats ze onmiddellijk terug naar kamertemperatuur. Ablatie van cerci en de caudale gloeidraad veroorzaakt geen toename van de mortaliteit.
   3. Plaats monsterbuizen met de deksels open op een thermisch blok gedurende 15 minuten bij 70 °C om de EtOH te verdampen.
   4. Herhaal stap 4.2.2–4.2.5 voor genotypering.
   5. Dien de PCR-producten waarin een mutant bandpatroon wordt nageleefd in bij een standaard Sanger-sequencingservice.
   6. Bewaar de G1 nimfen/volwassenen met de gewenste mutaties en gooi de andere weg (zie figuur 4C voor een representatief sequencingresultaat).
4. Kruis de volwassenen met de gewenste mutaties in een paringsschaal en verkrijg de volgende generaties om een homozygote mutante stam op te zetten.

Results

In onze handen kunnen ongeveer 100 eieren goed worden geïnjecteerd met een enkele injectie capillair wanneer het de juiste punt heeft(figuur 3C). Injectie van gRNA/Cas9 ribonucleoproteïne complex in embryo's binnen de eerste 8 uur na het leggen van eieren resulteert in indels op de gRNA gerichte site. Dit veroorzaakt biallelic mutaties in sommige cellen van de geïnjecteerde generatie (G0) en dus mutant mozaïek fenotypes worden meestal verkregen in G0. Wanneer dit protocol bijvoorbeeld werd g...

Discussion

Voor de succesvolle generatie van de gewenste T. domestica mutant met CRISPR/Cas9 is het eerst belangrijk om een voldoende aantal geënsceneerde embryo's te verzamelen voor injectie. Voor een constante verzameling van een voldoende aantal T. domestica-eieren, is de sleutel om een geschikte grootte van de container te selecteren om een lagere populatiedichtheid te hebben, omdat het zou helpen bij het succesvol voltooien van een reeks complex paringsgedrag, dat wordt herhaald na elke vervelling voor volwas...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well plate	Corning	83-3738
Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3, 100 µg	Integrated DNA Technologies	1081060
Anti-static cleaner	Hozan	Z-292	voor het verwijderen van statische elektriciteit van een 24-well plate
Barrier Box 20.7L	AS ONE	4-5606-01	Grote container
FemtoJet 4i	Eppendorf	5252000013	Elektronische micro-injector
Femtotip II, injectiecapillair	Eppendorf	5242957000	Glas injectiecapillair
High Pack 2440mL	AS ONE	5-068-25	Middelgrote container
Incubator	Panasonic	MIR-554-PJ	voor incubatie bij 37 °C. Het is niet nodig om de binnenkant van de incubator te bevochtigen.
KOD Fx Neo	Toyobo	KFX-101	PCR enzym voor genotypering. Geoptimaliseerd voor een versterking van ruwe templates.
Magnetische standaard	Narishige	GJ-8	voor het vasthouden van de micromanipulator
Microloader	Eppendorf	5242956003
Micromanipulator	Narishige	MM-3
Microscoop	Olympus	SZX12	voor micro-injectie. Meer dan 35X vergroting is voldoende voor de micro-injectie
MultiNA	Shimadzu	MCE-202	Microchip elektroforese systeem
NiceTac	Nichiban	NW-5	Dubbelzijdig plakband om eieren op een glazen plaatje te plaatsen
Verfkwast (paardenhaar)	Pentel	ZBS1-0
Planten kweekschaal	SPL Life Sciences	310100	Paringsschaal en watervoorzieningen voor grote en middelgrote containers
Proteinase K, recombinant, PCR Grade Lyofilisaat van Pichia pastoris	Roche	3115836001
SZX 12 microscoop	Olympus	SZX 12	Meer dan 35X vergroting is voldoende voor de micro-injectie
Talkpoeder	Maruishi	877113
Tetra Goldfish Gold Growth	Spectrum Brands		Kunstmatig vissenvoer