Echografie met hoge resolutie kan helpen bij het stroomlijnen van experimenten die getijde zwangere muizen vereisen door de staat van zwangerschap, zwangerschapsduur en zwangerschapsverliezen te bepalen. Hier wordt een protocol gepresenteerd om methoden te illustreren om muiszwangerschappen te beoordelen, evenals mogelijke valkuilen (beeldartefacten) die zwangerschap kunnen nabootsen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Is mijn muis zwanger? Hoogfrequente echografie
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De muis is het diermodel bij uitstek voor veel menselijke ziekten en biologische processen. Ontwikkelingsbiologie vereist vaak geënsceneerde zwangere muizen om evoluerende processen op verschillende tijdstippen te bepalen. Bovendien vereist een optimale en efficiënte fokkerij van modelmuizen een beoordeling van getijde zwangerschappen. Meestal worden muizen 's nachts gepaard en wordt de aanwezigheid van een vaginale plug bepaald; de positieve voorspellende waarde van deze techniek is echter suboptimaal en men moet wachten om te weten of de muis echt zwanger is. Hoge resolutie echografie biomicroscopie is een effectief en efficiënt hulpmiddel voor beeldvorming: 1) Of een muis zwanger is; 2) Welk zwangerschapsfase de muis heeft bereikt; en 3) Of er intra-uteriene verliezen zijn. Naast de embryo's en foetussen moet de onderzoeker ook veel voorkomende artefacten in de buikholte herkennen om deze niet te verwarren met een gravid baarmoeder. Dit artikel bevat een protocol voor beeldvorming, samen met illustratieve voorbeelden.
Inleiding
De muis is het voorkeursmodel voor zoogdieren voor veel menselijke ziekten en biologische processen1,2,3,4. Onderzoek in ontwikkelingsbiologie vereist vaak geënsceneerde zwangere muizen om evoluerende processen te bepalen op verschillende tijdstippen5,6,7,8. Bovendien vereist een optimale en effectieve fokkerij van modelmuizen een beoordeling van getijde zwangerschappen, vooral wanneer onderzoekers de effecten van een genmutatie op de ontwikkeling bestuderen. Meestal paren onderzoekers 's nachts heterozygote muizen, zoeken ze de volgende ochtend vroeg naar een vaginale plug en hopen ze dat er een zwangerschap volgt9. Het bepalen van intra-uterien verlies begint meestal met het controleren van een pasgeboren nest op Mendelian-verhoudingen van genotypen, vervolgens achteruit werken door zwangere muizen in verschillende zwangerschapsfasen op te offeren en de embryo's te herstellen. Onderzoekers kunnen gewichtstoename bepalen als metriek van een positieve zwangerschap10,11; echter, vooral bij genetisch gemanipuleerde muizen, kunnen de nesten erg klein zijn en vervolgens worden geresorbeerd wanneer er intra-uterien verlies is waardoor de gewichtstoename mogelijk niet duidelijk is (vooral vroeg in de zwangerschap, ~E6,5–8,5). Een muis kan vals zwanger lijken als gevolg van bijvoorbeeld een goedaardige buiktumor. In wezen werkt men "blind".
Hoge resolutie echografie biomicroscopie maakt directe visualisatie van de gravid baarmoeder en het ontwikkelen van muis embryo's12,13,14,15,16. Hoewel we aanvankelijk methoden hadden ontwikkeld om embryonale muis cardiovasculaire fysiologie16,17te beoordelen, erkenden we het nut van deze beeldvormingsmodaliteit om onze muizenfokkerij te stroomlijnen. In het bijzonder hoefden we niet langer te wachten om te "zien" of een muis zwanger was, op basis van de duidelijke gewichtstoename of levering van een nest; we konden de gravid-toestand bepalen en muizen snel opnieuw paren als de moeder niet zwanger was. Bovendien kunnen intra-uteriene verliezen ook gemakkelijk in beeld worden gebeeld voorgebeeld en kan een tijdlijn van verlies worden bepaald zonder de muis op te offeren (zie figuur 1 voor een schema). Tijd, waardevolle modelmuizen en fondsen kunnen dus worden bespaard.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle stappen in dit protocol volgen de Gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren gepubliceerd door de National Institutes of Health en zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van de New York University Grossman School of Medicine.
1. Paring van muizen voor getijde zwangerschappen
- Koppel de geschikte vrouwelijke muis (meestal een heterozygoot) in een kooi met de geschikte mannelijke muis (meestal een heterozygoot) voor nachtelijke paring.
- Scheid de muizen de volgende ochtend. Als alternatief, continu paren de vrouwelijke en mannelijke muizen, waardoor de kans op zwangerschap toeneemt.
OPMERKING: Een nauwkeurig getijde zwangerschap kan echter niet worden gegarandeerd met het alternatief, en het ensceneren van muisembryo's door echografie is niet duidelijk, vooral wanneer het ziekteproces resulteert in intra-uteriene groeivertraging. Als wordt aangenomen dat de embryo's die de genvariant dragen klein zijn, zoek dan naar de grotere nestgenoten van het wilde type om de zwangerschapsduur te meten.- Optioneel: Zoek naar de vaginale plug. Als er geen vaginale plug is, is de vrouwelijke muis niet gedekt. Als er een vaginale plug is, is het nog steeds waarschijnlijk dat de vrouwelijke muis niet zwanger wordt.
- Tijd de dag na de nachtelijke paring als E0.5.
- Voer beeldvorming uit bij E6.5–E.8.5 om de zwangerschap te bepalen en de muizen opnieuw te paren als de muis niet zwanger is (zie stap 1.1).
OPMERKING: In dit stadium is de vrouwelijke moeder niet duidelijk zwanger van het oog; daarom maakt de echografie vroege bepaling en her paring mogelijk.
2. Anesthesie en voorbereiding van de muis
- Plaats de zwangere muis in de verdovingsinductiekamer.
- Meng isofluraan met kamerlucht of medische zuurstof, in een concentratie van 2%-3% bij 1 L/min debiet om sedatie van de zwangere muis in de inductiekamer te induceren.
OPMERKING: Sedatie vindt meestal plaats binnen 1-2 minuten. De muis zal stil liggen en haar ademhaling zal vertraagd zijn. - Breng de muis snel over naar het beeldplatform. Het beeldvormingsplatform heeft meestal ook verwarmingselementen, die kunnen helpen de muis warm te houden.
- Plaats de neus van de muis in de verdovingsneus.
- Leid het isofluraan/zuurstofmengsel snel om naar de neuscone van het beeldplatform. Houd isofluraan op 2%-3% bij 1 L/min stroom.
- Bepaal het niveau van sedatie door pootsnuif, hoornvliesreflex, niveau van ademhaling en elke beweging.
OPMERKING: De hoornvliesreflex kan in eerste instantie worden bepaald door hydraterende zalf op de ogen aan te brengen om te voorkomen dat ze uitdrogen terwijl de muis wordt verdoofd (de muis sluit haar ogen niet). - Terwijl de muis ligt (op zijn rug), plakt u de poten op de elektrocardiogram (ECG) pads van het beeldvormingsplatform.
OPMERKING: Een ECG is echter niet nodig voor dit soort beeldvorming. - Verwijder de vacht als volgt uit de buik van de zwangere moeder:
- Maak de buikvacht grondig nat met 70% ethanol, ook tot aan de laterale randen. Niet zo veel toepassen dat er een run-off op het platform is.
OPMERKING: Ethanol werkt beter als scheersmeermiddel dan water. - Gebruik het scheermesje om de buik voorzichtig te scheren. Pas op dat u de tepels niet snijdt.
- Veeg de geschoren vacht van de buik af met gaas of wat doekjes.
- U kunt ook een ontharingscrème gebruiken na het gebruik van de bontknipper om het grootste deel van de vacht te verwijderen.
- Maak de buikvacht grondig nat met 70% ethanol, ook tot aan de laterale randen. Niet zo veel toepassen dat er een run-off op het platform is.
3. Transabdominale beeldvorming van de (vermoedelijke) zwangere muis
- Nadat de buik is geschoren, vermindert u de isofluraan tot 1%-1,5%, met behoud van een debiet van 1 L/min. Bewaak het niveau van sedatie door het niveau van ademhaling en eventuele bewegingen, evenals pootknijpen en / of hoornvliesreflex.
OPMERKING: De hartslag van de verdoofde muis is meestal 400-500/min, afhankelijk van de kerntemperatuur (rectaal). Verwarm de muis niet voor een snelle zwangerschapscontrole tot een fysiologische kerntemperatuur; de hartslag zal dichter bij 400-450/min zijn, maar kan verder dalen met een onregelmatig ritme als de muis koud wordt met langdurige beeldvorming.- Belangrijk is dat de ademhalingen matig zijn in diepte en regelmaat, niet grillig of agonal (snakken: diep, langzaam en grillig, met diepe intercostale en subcostale retracties).
OPMERKING: De ademhalingsfrequentie van de niet-geventileerde, verdoofde muis zal meestal 60-100/min zijn. Zie https://ahcs.ninds.nih.gov/ACUC_pages/pg_003_anesth_animals.html en https://az.research.umich.edu/animalcare/guidelines/guidelines-anesthesia-and-analgesia-mice.
- Belangrijk is dat de ademhalingen matig zijn in diepte en regelmaat, niet grillig of agonal (snakken: diep, langzaam en grillig, met diepe intercostale en subcostale retracties).
- Breng ultrageluid (akoestische koppeling) gel royaal aan op de buik.
- Plaats de beeldvormende transducer op de buik om deze in een horizontaal vlak te oriënteren: oriënteer de sonde om een links-rechts oriëntatie op het beeldvormingssysteem te verkrijgen; de "punt" of richel die aan de zijkant van de beeldvormingssonde is aangegeven, moet naar rechts worden gericht.
OPMERKING: Als u de beeldvormingssonde naar rechts van de muis schuift, moet het overeenkomstige beeld op het echografiesysteem naar rechts van de muis worden verplaatst (stel u voor dat u "omhoog" kijkt vanaf de staart van de muis - de rechterkant van de muis blijft op de monitor staan).- Gebruik meestal de transducerhouder en het railmanipulatorsysteem van het beeldvormingssysteem. Hier is "vrije hand" beeldvorming gebruikt waarbij de imaging transducer met de hand wordt vastgehouden (twee handen zijn stabieler dan één) en die snellere bewegingen rond de buik mogelijk maakt. Deze bewegingen, zoals hieronder zal worden beschreven, omvatten zowel rotatie- als translationele bewegingen. Dit vereist echter meer oefening.
- Identificeer de blaas op het scherm (Video 1).
- Caudale scan vanuit de blaas, identificeer de vagina. Scan vervolgens langzaam en soepel in een schedelrichting en identificeer de bifurcatie van de vagina in de linker- en rechter baarmoederhoorns (figuur 2; Video 1).
- Begin met het onderzoek van de baarmoeder (linker- en rechter baarmoederhoorns)13 (figuur 3; Video 2).
OPMERKING: Tot halverwege de dracht (E10.5 of E11.5) worden de muisembryo's langs de rechter- en linkerrand geplaatst. Naarmate ze groeien, zullen de meer distale delen van de baarmoeder en hun bijbehorende embryo's naar buiten en achterste keren. Naarmate de embryo's verder groeien (E15,5 en later, over het algemeen), zullen de foetussen van de muis bijna willekeurig in verschillende richtingen worden geplaatst en wordt het moeilijk om een baarmoeder van proximaal naar distaal te "volgen".- Scan snel om te controleren of een muis zwanger is of niet. Deze snelle methode vereist alleen herkenning van een gravid baarmoeder en muis embryo's.
- U kunt ook extra tijd nemen om de embryo's (levend, dood, geresorbeerd) in elke baarmoederhoorn op te sommen.
OPMERKING: Over het algemeen vertoont een levend embryo verschillende organen zoals een hart, ledematen, hoofd met ventrikels en ogen. Een dood embryo krijgt een homogeen, "papperig" uiterlijk, tenzij het gewoon dood is. Geresorbeerde embryo's hebben een puntige echogene vlek in het midden van een gravid-uitziende baarmoeder (Figuur 4, Figuur 5, Figuur 6, Figuur 7, Figuur 8). - Om te bepalen of een embryo echt leeft, moet u op zoek gaan naar de hartslag en/of bloedstroom.
OPMERKING: Color Doppler flow mapping kan helpen bij het bepalen van de aanwezigheid van de bloedstroom, zowel in het embryo als in de navelstreng. Over het algemeen kan dit worden toegepast op embryo's ouder dan E8.5. - Herken potentiële artefacten die een gravid baarmoeder kunnen nabootsen (Figuur 9, Figuur 10). Bovendien, aangezien darmgas en andere ultrasone "schaduw" artefacten segmenten van de baarmoederhoorn kunnen verduisteren, voert u de beeldvorming uit vanaf meerdere uitkijkpunten om een adequate visualisatie van de baarmoeder te garanderen.
- Nadat het onderzoek is voltooid, veegt u de gel van de buik af met gaas of doekjes. Probeer zoveel mogelijk te verwijderen, omdat de gel de neiging heeft om de muis af te koelen.
- Verwijder de poten en verwijder de muis van de verdovingsneus.
- Beweeg de muis voorzichtig terug in haar kooi. Ze moet wakker worden en binnen een minuut of zo beginnen te bewegen.
OPMERKING: Genetisch gemodificeerde muizen kunnen iets langer duren om te herstellen van anesthesie en moeten beter in de gaten worden gehouden.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Dit protocol stelt een onderzoeker in staat om vol vertrouwen te bepalen of een muis zwanger is, ook in de vroege stadia en om te bepalen of er duidelijke prenatale embryonale of foetale verliezen zijn zonder de zwangere moeder op te offeren. Dit protocol is vooral nuttig bij het fokken van genetisch gemanipuleerde muizen; typisch, heterozygote x heterozygote kruisen om homozygote nakomelingen op te leveren leidt tot mislukking van de juiste ontwikkeling, die prenatale letaliteit veroorzaakt. Figuur ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De belangrijkste eerste stap in de beeldvorming is om de vagina te identificeren en vervolgens de bifurcatie van de baarmoederhoorn naar links en rechts te bepalen. Door elke baarmoederhoorn te volgen, is de kans kleiner dat de imager lussen van de darm verkeerd identificeert als de baarmoeder. Bovendien is het begrijpen van de variaties in het uiterlijk van de darm (met / zonder fecale materie) belangrijk om deze van de baarmoeder te onderscheiden; af en toe kunnen fecale "ballen" in darmlussen een gravid (zwangere) baa...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets bekend te maken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Depilatoire crème | |||
| Ethanol, 70% | |||
| Haartjeskniptang | |||
| Gaas of KimWipes | |||
| Isofluraan | |||
| Medische zuurstof (optioneel) | |||
| Medische tape | |||
| Muisbeeldvormingssysteem (inclusief anesthesieset en beeldvormingsplatform) | Fujifilm Visual Sonics | Diverse | Elk systeem met 40 MHz centrumfrequentie ultrasone transducer sonde |
| Veiligheidsscheermesje (geen veiligheidsscheermesje) | |||
| Weegschaal (om muis te wegen) | |||
| Ultrasone gel |
Referenties
- Bogue, M. A., et al. Mouse Phenome Database: an integrative database and analysis suite for curated empirical phenotype data from laboratory mice. Nucleic Acids Research. 46, 843-850 (2018).
- Ito, R., Takahashi, T., Ito, M. Humanized mouse models: Application to human diseases. Journal of Cellular Physiology. 233 (5), 3723-3728 (2018).
- Law, M., Shaw, D. R. Mouse Genome Informatics (MGI) is the international resource for information on the laboratory mouse. Methods in Molecular Biology. 1757, 141-161 (2018).
- Rydell-Törmänen, K., Johnson, J. R. The applicability of mouse models to the study of human disease. Methods in Molecular Biology. 1940, 3-22 (2019).
- Hinton, R. B., Yutzey, K. E. Heart valve structure and function in development and disease. Annual Reviews of Physiology. 73, 29-46 (2011).
- Dickinson, M. E., et al. High-throughput discovery of novel developmental phenotypes. Nature. 537 (7621), 508-514 (2016).
- Tam, P. P. L., et al. Formation of the embryonic head in the mouse: attributes of a gene regulatory network. Current Topics in Developmental Biology. 117, 497-521 (2016).
- Palis, J. Hematopoietic stem cell-independent hematopoiesis: emergence of erythroid, megakaryocyte, and myeloid potential in the mammalian embryo. FEBS Letters. 590 (22), 3965-3974 (2016).
- Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. Selecting female mice in estrus and checking plugs. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (8), (2016).
- Heyne, G. W., et al. A simple and reliable method for early pregnancy detection in inbred mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (4), 368-371 (2015).
- Finlay, J. B., Liu, X., Ermel, R. W., Adamson, T. W. Maternal weight gain as a predictor of litter size in Swiss Webster, C57BL/6J, and BALB/cJ mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (6), 694-699 (2015).
- Zhou, Y. Q., et al. Applications for multifrequency ultrasound biomicroscopy in mice from implantation to adulthood. Physiological Genomics. 10 (2), 113-126 (2002).
- Ji, R. P., Phoon, C. K. L. Noninvasive localization of nuclear factor of activated T cells c1-/- mouse embryos by ultrasound biomicroscopy-Doppler allows genotype-phenotype correlation. Journal of the American Society of Echocardiography. 18 (12), 1415-1421 (2005).
- Kulandavelu, S., et al. Embryonic and neonatal phenotyping of genetically engineered mice. ILAR Journal. 47 (2), 103-117 (2006).
- Mu, J., Slevin, J. C., Qu, D., McCormick, S., Adamson, S. L. In vivo quantification of embryonic and placental growth during gestation in mice using micro-ultrasound. Reproductive Biology and Endocrinology. 6, 34(2008).
- Phoon, C. K. L., Turnbull, D. H. Cardiovascular imaging in mice. Current Protocols in Mouse Biology. 6 (1), 15-38 (2016).
- Phoon, C. K. L., Turnbull, D. H. Ultrasound biomicroscopy-Doppler in mouse cardiovascular development. Physiological Genomics. 14 (1), 3-15 (2003).
- Peavey, M. C., et al. A novel use of three-dimensional high-frequency ultrasonography for early pregnancy characterization in the mouse. Journal of Visualized Experiments. (128), e56207(2017).
- Greco, A., et al. High frequency ultrasound for in vivo pregnancy diagnosis and staging of placental and fetal development in mice. PLoS One. 8 (10), 77205(2013).
- Flores, L. E., Hildebrandt, T. B., Kühl, A. A., Drews, B. Early detection and staging of spontaneous embryo resorption by ultrasound biomicroscopy in murine pregnancy. Reproductive Biology and Endocrinology. 12, 38(2014).
- Norton, W. B., et al. Refinements for embryo implantation surgery in the mouse: comparison of injectable and inhalant anesthesias - tribromoethanol, ketamine and isoflurane - on pregnancy and pup survival. Laboratory Animal. 50 (5), 335-343 (2016).
- Thaete, L. G., Levin, S. I., Dudley, A. T. Impact of anaesthetics and analgesics on fetal growth in the mouse. Laboratory Animal. 47 (3), 175-183 (2013).
- Phoon, C. K. L., et al. Tafazzin knockdown in mice leads to a developmental cardiomyopathy with early diastolic dysfunction preceding myocardial noncompaction. Journal of the American Heart Association. 1 (2), (2012).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
