Fecale (micro) RNA-isolatie

Summary

Dit protocol isoleert totaal RNA van hoge kwaliteit uit fecale monsters van dierlijke en menselijke proefpersonen. Een commerciële miRNA-isolatiekit wordt gebruikt met aanzienlijke aanpassing om zuiver RNA te isoleren met geoptimaliseerde kwantiteit en kwaliteit. De RNA-isolaten zijn goed voor de meeste downstream RNA-assays zoals sequencing, micro-array en RT-PCR.

Abstract

Het wordt duidelijk dat RNA voorkomt in het darmlumen en uitwerpselen bij dieren en mensen. Het hieronder beschreven protocol isoleert totaal RNA inclusief microRNA's uit fecale monsters van dierlijke en menselijke proefpersonen. Het doel is om totaal RNA met een hoge zuiverheid en hoeveelheid te isoleren voor downstream analyses zoals RNA-sequencing, RT-PCR en micro-array. De voordelen van dit geoptimaliseerde protocol in de miRNA-isolatie zijn mogelijkheden om sterk gezuiverde RNA-producten te isoleren met extra wasstappen beschreven, verhoogde hoeveelheid RNA verkregen met een verbeterde methode in de resuspensie van monster en belangrijke tips voor decontaminatie. Een beperking is het onvermogen om grotere monsters van meer dan 200 mg te verwerken en te zuiveren, omdat deze steekproefgroottes een probleem zouden veroorzaken bij de duidelijke vorming van de interfase. Bijgevolg kan de grote monstergrootte de te extraheren waterige fase zoals beschreven in het protocol verontreinigen met organische stoffen die uiteindelijk de kwaliteit van het geïsoleerde RNA beïnvloeden. RNA-isolaten uit een monster van maximaal 200 mg zijn echter voldoende voor de meeste downstream-analyses.

Introduction

Extracellulair RNA wordt erkend als een belangrijke factor die veel biologische processen bemiddelt¹. Extracellulair RNA in de ontlasting werd voor het eerst gemeld in 2008 als een marker voor darmkanker en actieve colitis ulcerosa², en het werd onlangs onthuld als een normaal onderdeel van het darmlumen en de ontlasting en bemiddelt gastheer-microbe communicatie ^3,4,5. Het doel van dit RNA-isolatieprotocol is om extracellulair RNA van hoge kwaliteit te extraheren uit fecale monsters die zijn verzameld van dierlijke en menselijke proefpersonen. Het protocol is aangepast van een commerciële miRNA Isolation Kit. Het verkregen RNA wordt gebruikt voor downstream-analyses zoals RNA-sequencing, RT-PCR en micro-array. Het protocol bevat verschillende belangrijke en nuttige tips om de kwantiteit en kwaliteit van RNA in de ontlasting van dieren en mensen te maximaliseren. De reden om deze methode van RNA (inclusief microRNA) isolatie te ontwikkelen en te optimaliseren, is om microbieel RNA in de ontlasting te verminderen, de variabelen in de onderzoeksstudies te beperken en de RNA-samenstelling in de darm te analyseren zonder rekening te houden met verschillende verstorende factoren en bronnen van besmetting. Van belang is dat deze RNA-isolatie de afgifte van RNA uit levende cellen en levende microben (cellulair RNA) minimaliseert. Het richt zich op extracellulaire RNA's die zijn vrijgegeven door darmcellen of zijn verkregen via voedselinname. In principe is deze methode niet geschikt voor studies waarbij het microbiële transcriptoom wordt onderzocht.

Protocol

Alle methoden met onderzoeksdieren die hier worden beschreven, zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School.

Alle methoden met menselijke proefpersonen die hier worden beschreven, zijn in overeenstemming met de richtlijnen die zijn vastgesteld door de Partners Human Research Committee.

1. Verzameling fecale monsters

1. Autoclaaf of bereid een steriele en nucleasevrije 2 ml microcentrifugebuis met een schroefdop voor elke proefpersoon in een experiment.
   1. Zorg voor menselijke proefpersonen voor een geschikt, nucleasevrij en steriel ontlastingsmonsterverzamelapparaat voor elk onderwerp.
2. Verzamel 25-100 mg (ongeveer 1-4 fecale pellets voor fecale monsters van muizen) fecale monsters van elke proefpersoon in een steriele omgeving.
   OPMERKING: Twee of meer fecale pellets (~ 50 mg of zwaarder) hebben de voorkeur voor het verkrijgen van RNA van de hoogste zuiverheid.
   1. Gebruik alle benodigde persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM' s) en materialen, bijvoorbeeld: een paar laboratoriumhandschoenen, een desinfecterende spray en een steriel papieren handdoekje, om het werkgebied te steriliseren, waar het proefdier op wordt geplaatst, om besmetting met fecale monsters te voorkomen.
      1. Voor menselijke proefpersonen, instrueer elke proefpersoon / verzamelaar om 100-200 mg ontlastingsmonsters te verzamelen in een omgeving die zo steriel mogelijk is. Gebruik standaard steriele werking en vermijd besmetting van ontlastingsmonsters.
3. Verzamel fecale monsters van elk dier rechtstreeks in een microcentrifugebuis van 2 ml met een schroefdop zonder andere oppervlakken aan te raken om besmetting te voorkomen.
   1. Voor menselijke proefpersonen, instrueer elke proefpersoon om rechtstreeks te poepen in een toepasbaar verzamelapparaat (bijvoorbeeld een steriele verzamelkit voor ontlastingsmonsters) om besmetting te voorkomen.
      OPMERKING: Instrueer de patiënt om besmetting door toiletoppervlakken, water, urine of andere niet-steriele oppervlakken/voorwerpen te voorkomen.
4. Vries fecale monsters die zijn verzameld in 2 ml microcentrifugebuizen onmiddellijk bij -80 °C of plaats in een emmer droogijs voor de betere hoeveelheid en kwaliteit van RNA voordat de ontlasting resuspensie zoals beschreven in de onderstaande stappen.
   1. Voor menselijke ontlastingsmonsters aliquot elk vers monster van 200 mg in 2 ml microcentrifugebuizen met schroefdoppen en vriest deze in bij -80 °C vóór de resuspensie van de ontlasting, zoals hieronder beschreven.
      1. Voor de opslag van ontlastingsmonsters die niet in 2 ml microcentrifugebuizen met schroefdoppen zijn, weegt en brengt u 100-200 mg bevroren monsters over in afzonderlijke microcentrifugebuizen van 2 ml met schroefdoppen vóór reuspensie van uitwerpselen zoals hieronder beschreven.
         OPMERKING: Vermijd voor menselijke ontlastingsmonsters het nemen van meer dan 200 mg ontlastingsmonsters voor RNA-isolatie, omdat dit problemen kan veroorzaken bij de volgende stappen. Bij een overbelast monster in een microcentrifugebuis van 2 ml zijn de waterige fase, de organische fase en de interfase mogelijk niet duidelijk gevormd en gescheiden. De procedure kan hier worden gepauzeerd.

2. Bereidingen van wasoplossingen

1. Voeg 21 ml 100% ethanol van de American Chemical Society (ACS) toe aan de wash solution 1 in de miRNA-isolatiekit (zie materiaaltafel) om het uiteindelijke volume van 30 ml te bereiken, zoals aangegeven op de fles. Vortex totdat alles oplost in de fles.
2. Voeg 40 ml ACS-ethanol van ACS-kwaliteit 100% toe aan de bijgeleverde wasoplossing 2/3 om het uiteindelijke volume van 50 ml te bereiken, zoals aangegeven op de fles. Vortex gedurende 5 s of totdat het uiteindelijke mengsel goed gemengd is.

3. Voorbereidingen van apparatuur en materialen

1. Spuit het werkgebied en de apparatuur, bijvoorbeeld: de laboratoriumbank, het werkgebied in de chemische zuurkast en de microcentrifugebuisrekken, met een Ribonuclease (RNase) decontaminatieoplossing (bijv. In de handel verkrijgbare RNase-ontsmettingsoplossing). Om besmetting te voorkomen, brengt u met de RNase-decontaminatieoplossing aan op de oppervlakken waar en wanneer dat nodig wordt geacht.
2. Trek een schone laboratoriumjas aan, zet een gezichtsmasker op en draag geschikte laboratoriumhandschoenen om het RNA in de fecale monsters te beschermen tegen nucleasen die op de menselijke huid aanwezig zijn. Spuit handschoenen met een RNase-decontaminatieoplossing en wissel regelmatig van handschoenen om besmetting te voorkomen.
3. Bereid een emmer droogijs voor fecale monsters opgeslagen bij -80 °C om ontdooien te voorkomen voordat de ontlasting resuspensie en een emmer ijs voor materialen, bijvoorbeeld: Zuur-Fenol: Chloroform, om de houdbaarheid te verlengen.
   OPMERKING: Zorg ervoor dat materialen, inclusief de media die in het protocol worden gebruikt, steriel zijn zonder besmetting van nucleasen.

4. Uitwerpselen resuspensie

1. Resuspendeer 25-100 mg fecale monsters in 600 μL steriele 1x Dulbecco's Fosfaat-Gebufferde Zoutoplossing (DPBS).
   LET OP: Fecale monsters moeten onmiddellijk worden verwerkt wanneer ze worden ontdooid vanaf -80 ° C zonder zelfs maar gedeeltelijk te ontdooien om de afgifte van RN's en cellulair RNA te minimaliseren, omdat ijskristallen zowel de binnenste als de buitenste cellulaire compartimenten scheuren wanneer cellen in het monster ontdooien.
   1. Voeg 600 μL 1x DPBS toe aan de microcentrifugebuis van 2 ml met een schroefdop met fecale monsters bij kamertemperatuur (RT).
   2. Incubeer het mengsel van fecale monsters ondergedompeld in 600 μL 1x DPBS in de 2 ml microcentrifugebuis die gedurende 30 minuten bij RT is afgedekt.
   3. Resuspendeer het mengsel door te pureren met 1 ml pipetpunt en vortex goed met de 2 ml microcentrifugebuis afgedekt. Om de hoeveelheid en kwaliteit van RNA te optimaliseren en te verhogen, resuspenseer het mengsel met een homogenisator met de instelling voor één cyclus bij S4000 (of 4000 rpm) en 45 s.

5. Biologische extractie

LET OP: Gebruik de gevaarlijke chemische zuurkast voor de volgende stappen tot stap 6 met het gebruik van zuurfenol: chloroform en ACS-kwaliteit 100% ethanol vanwege hun toxiciteit en ontvlambaarheid. Vervang PBM's indien nodig en volg de juiste standaard voorzorgsmaatregelen bij het omgaan met gevaarlijk materiaal.

1. Extract RNA met 600 μL zuurfenol: chloroform (het volume zuur-fenol: chloroform vereist is gelijk aan het initiële volume van toegevoegde 1x DPBS in stap 4.1).
   1. Voeg 600 μL zuurfenol: chloroform toe aan de suspensie uit stap 4.1.
      OPMERKING: Trek zuurfenol op: chloroform uit de onderste fase in de fles terwijl de bovenste fase wordt gemengd met een waterige buffer. Als de interfase tussen deze twee fasen wordt verstoord, wacht dan en trek zuur-fenol op: chloroform alleen wanneer de interfase zich opnieuw vestigt om besmetting te voorkomen.
2. Vortex het mengsel gedurende 60 s om grondig te mengen. Als alternatief, om de hoeveelheid RNA in de opbrengst te optimaliseren en te verhogen, mengt u met behulp van een homogenisator met de instelling voor één cyclus op S4000 en 45 s.
3. Centrifugeer gedurende 15 minuten bij 10.000 x g bij RT om de waterige en organische fasen te scheiden met een microcentrifuge. Na centrifugatie moet de interfase compact zijn. Zo niet, herhaal dan de centrifugatie.
   OPMERKING: Als de interfase niet zo compact kon zijn als gewenst, mogelijk als gevolg van een ongelijke verhouding van het beginvolume tot het volume toegevoegd zuur-fenol: chloroform na verschillende herhalingen van centrifugatie, ga dan verder met het herstellen van de waterige fase met een grotere zorg om besmetting te voorkomen.
4. Herstel de waterige fase en breng deze over naar een nieuwe 2 ml microcentrifugebuis met een scharnierdop (niet geleverd door de miRNA-isolatiekit).
   1. Verwijder de waterige (of bovenste) fase voorzichtig zonder de onderste fase te verstoren en breng deze over naar een nieuwe 2 ml microcentrifugebuis met een scharnierdop. Noteer het overgedragen volume (bijv. ~500 μL).
      OPMERKING: Wanneer de interfase compact is en de bovenste fase duidelijk gescheiden is, zweven er mogelijk een paar kleine restdeeltjes op de top van de waterige fase. Pipetteer zorgvuldig om deze residuen te vermijden en herstel alleen zichtbaar en duidelijk gescheiden waterige fase om een kwaliteitsvolle RNA-opbrengst te garanderen, zelfs als u slechts een klein volume van de waterige fase kunt verkrijgen.

6. Definitieve RNA-isolatie

1. Voeg 1,25 volumes RT ACS-ethanol van kwaliteit 100% toe aan de waterige fase in de microcentrifugebuis van 2 ml (voeg bijvoorbeeld 625 μL 100% ethanol toe als 500 μL waterige fase wordt teruggewonnen uit stap 5.4.). Vortex 3 s.
2. Laad het waterige fase/ethanolmengsel door het filterpatroon in de miRNA-isolatiekit.
   1. Plaats voor elk monster het filterpatroon in een van de verzamelbuizen die door de kit worden geleverd.
      1. Pipetteer en laad 600 μL van het waterige fase/ethanolmengsel in het filterpatroon.
         OPMERKING: Vortex het mengsel kort om de ethanol grondig te mengen met de waterige fase voordat u pipetteert. Niet meer dan 700 μL van het waterige fase/ethanolmengsel kan per keer worden geladen.
   2. Centrifugeer bij 10.000 x g gedurende 90 s om door het mengsel te filteren. Draaien met een hogere snelheid kan het filter beschadigen.
   3. Gooi het filtraat weg en herhaal stap 6.2.1 tot en met 6.2.2 totdat het mengsel in opeenvolgende toepassingen door hetzelfde filtermembraan is gefilterd. Bewaar en hergebruik dezelfde opvangbuis voor de onderstaande wasstappen.
   4. Was het filter met 700 μL miRNA Wash Solution 1.
      LET OP: miRNA Wash Solution 1 bevat guanidinethiocyanaat dat huidirritatie en ernstig oogletsel kan veroorzaken. Draag noodzakelijke PBM's, bijvoorbeeld: handschoenen, gezichtsscherm, beschermende laboratoriumjas. Wissel indien nodig regelmatig van handschoenen.
      1. Breng 700 μL miRNA Wash Solution 1, de werkoplossing bereid met de ACS-klasse 100% ethanol, aan in het filterpatroon.
      2. Centrifugeer gedurende 60 s om de miRNA Wash Solution 1 door het filterpatroon te filteren.
      3. Gooi het filtraat uit de opvangbuis en plaats dezelfde filterpatroon in dezelfde opvangbuis.
   5. Was het filter met Wash Solution 2/3 één keer met volumes van achtereenvolgens 700 μL, 500 μL en 250 μL.
      1. Breng 700 μL Wash Solution 2/3, de werkoplossing bereid met de ACS-kwaliteit 100% ethanol, aan in het filterpatroon.
         1. Centrifugeer bij 10.000 x g gedurende 1 min.
         2. Gooi het filtraat uit de opvangbuis en plaats dezelfde filterpatroon in dezelfde opvangbuis.
      2. Breng 500 μL Wash Solution 2/3 aan in het filterpatroon.
         1. Centrifugeer bij 10.000 x g gedurende 1 min.
         2. Gooi het filtraat uit de opvangbuis en plaats dezelfde filterpatroon in dezelfde opvangbuis.
      3. Breng 250 μL Wash Solution 2/3 aan in het filterpatroon.
         1. Centrifugeer bij 10.000 x g gedurende 1 min.
         2. Gooi het filtraat uit de opvangbuis.
      4. Breng de filterpatroon over in een nieuwe opvangbuis en draai de assemblage gedurende 5 minuten om restvloeistof uit het filter te verwijderen.

7. Elute RNA met 50 μL nucleasevrij water

1. Breng de filterpatroon over in een nieuwe opvangbuis. Pipetteer 50 μL nucleasevrij water naar het midden van het filter en sluit de opvangbuis af.
   1. Incubeer bij RT gedurende 10 min.
   2. Draai gedurende 5 minuten op 8.000 x g om RNA terug te winnen in de nieuwe verzamelbuis.
   3. Bepaal de concentratie en zuiverheid van teruggewonnen fecaal RNA met behulp van een fluorometer. Teruggewonnen fecaal RNA kan worden bewaard bij -80 °C.

Results

Representatieve RNA's werden geïsoleerd uit respectievelijk 50 mg muis fecale monsters (2 muis fecale pellets) en 100 mg menselijke ontlastingsmonsters en geëlueerd in 50 μL nucleasevrij water. Spectrofotometeranalyse van de concentratie suggereert dat een totale hoeveelheid van respectievelijk 49 μg en 16 μg RNA werd geïsoleerd (tabel 1). De RNA-zuiverheid was hoog zoals aangegeven door een A260/A280-verhouding van ~2,0 en een A260/A230-verhouding van ~1,8 (tabel 1). Zoals gemeld

Discussion

Het is belangrijk om RNase-vrije techniek te gebruiken om RNase-besmetting tijdens de isolatie te voorkomen⁷. Na centrifugatie en de vorming van een compacte interfase is het belangrijk om de interfase, de onderste fase en de deeltjesverontreiniging die op de top van de waterige fase zweven te vermijden bij het herstellen van de waterige fase. Daarnaast worden twee wasstappen met 500 μL en 250 μL Wash Solution 2/3 toegevoegd om verontreinigingen in het filtermembraan te verwijderen voor een optima...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acid-Phenol: Chloroform, pH 4.5 (met IAA, 125:24:1)	Thermo Fischer Scientific	AM9720
DPBS, geen calcium, geen magnesium	Thermo Fischer Scientific	14190-144
Handschoenen
Microcentrifuge
mirVana miRNA Isolation Kit	Thermo Fischer Scientific	AM1561
Nuclease-Vrije microcentrifuge buisjes (1,5 mL, 2 mL)
Nuclease-Vrij Water (niet DEPC-behandeld)	Thermo Fischer Scientific	AM9937
Pipettor en Nuclease-Vrije Pipettips (met filter)
PowerLyzer 24 Homogenizer	QIAGEN	13155
RNaseZap RNase Decontaminatieoplossing	Thermo Fischer Scientific	AM9780
Vortex Shaker