Fecale (micro) RNA-isolatie

Summary

Dit protocol isoleert totaal RNA van hoge kwaliteit uit fecale monsters van dierlijke en menselijke proefpersonen. Een commerciële miRNA-isolatiekit wordt gebruikt met aanzienlijke aanpassing om zuiver RNA te isoleren met geoptimaliseerde kwantiteit en kwaliteit. De RNA-isolaten zijn goed voor de meeste downstream RNA-assays zoals sequencing, micro-array en RT-PCR.

Abstract

Het wordt duidelijk dat RNA voorkomt in het darmlumen en uitwerpselen bij dieren en mensen. Het hieronder beschreven protocol isoleert totaal RNA inclusief microRNA's uit fecale monsters van dierlijke en menselijke proefpersonen. Het doel is om totaal RNA met een hoge zuiverheid en hoeveelheid te isoleren voor downstream analyses zoals RNA-sequencing, RT-PCR en micro-array. De voordelen van dit geoptimaliseerde protocol in de miRNA-isolatie zijn mogelijkheden om sterk gezuiverde RNA-producten te isoleren met extra wasstappen beschreven, verhoogde hoeveelheid RNA verkregen met een verbeterde methode in de resuspensie van monster en belangrijke tips voor decontaminatie. Een beperking is het onvermogen om grotere monsters van meer dan 200 mg te verwerken en te zuiveren, omdat deze steekproefgroottes een probleem zouden veroorzaken bij de duidelijke vorming van de interfase. Bijgevolg kan de grote monstergrootte de te extraheren waterige fase zoals beschreven in het protocol verontreinigen met organische stoffen die uiteindelijk de kwaliteit van het geïsoleerde RNA beïnvloeden. RNA-isolaten uit een monster van maximaal 200 mg zijn echter voldoende voor de meeste downstream-analyses.

Introduction

Extracellulair RNA wordt erkend als een belangrijke factor die veel biologische processen bemiddelt¹. Extracellulair RNA in de ontlasting werd voor het eerst gemeld in 2008 als een marker voor darmkanker en actieve colitis ulcerosa², en het werd onlangs onthuld als een normaal onderdeel van het darmlumen en de ontlasting en bemiddelt gastheer-microbe communicatie ^3,4,5. Het doel van dit RNA-isolatieprotocol is om extracellulair RNA van hoge kwaliteit te extraheren uit fecale monsters die zijn verzameld van dierlijke en menselijk....

Protocol

Alle methoden met onderzoeksdieren die hier worden beschreven, zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School.

Alle methoden met menselijke proefpersonen die hier worden beschreven, zijn in overeenstemming met de richtlijnen die zijn vastgesteld door de Partners Human Research Committee.

1. Verzameling fecale monsters

1. Autoclaaf of bereid een steriele en nucleasevrije 2 ml microcentrifugebuis met een schroefdop voor elke proefpersoon in een experiment.
   1. Zorg voor menselijke proefpersonen voor een geschikt, nuclea....

Results

Representatieve RNA's werden geïsoleerd uit respectievelijk 50 mg muis fecale monsters (2 muis fecale pellets) en 100 mg menselijke ontlastingsmonsters en geëlueerd in 50 μL nucleasevrij water. Spectrofotometeranalyse van de concentratie suggereert dat een totale hoeveelheid van respectievelijk 49 μg en 16 μg RNA werd geïsoleerd (tabel 1). De RNA-zuiverheid was hoog zoals aangegeven door een A260/A280-verhouding van ~2,0 en een A260/A230-verhouding van ~1,8 (tabel 1). Zoals gemeld

Discussion

Het is belangrijk om RNase-vrije techniek te gebruiken om RNase-besmetting tijdens de isolatie te voorkomen⁷. Na centrifugatie en de vorming van een compacte interfase is het belangrijk om de interfase, de onderste fase en de deeltjesverontreiniging die op de top van de waterige fase zweven te vermijden bij het herstellen van de waterige fase. Daarnaast worden twee wasstappen met 500 μL en 250 μL Wash Solution 2/3 toegevoegd om verontreinigingen in het filtermembraan te verwijderen voor een optima.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acid-Phenol: Chloroform, pH 4.5 (met IAA, 125:24:1)	Thermo Fischer Scientific	AM9720
DPBS, geen calcium, geen magnesium	Thermo Fischer Scientific	14190-144
Handschoenen
Microcentrifuge
mirVana miRNA Isolation Kit	Thermo Fischer Scientific	AM1561
Nuclease-Vrije microcentrifuge buisjes (1,5 mL, 2 mL)
Nuclease-Vrij Water (niet DEPC-behandeld)	Thermo Fischer Scientific	AM9937
Pipettor en Nuclease-Vrije Pipettips (met filter)
PowerLyzer 24 Homogenizer	QIAGEN	13155
RNaseZap RNase Decontaminatieoplossing	Thermo Fischer Scientific	AM9780
Vortex Shaker