Method Article

High-Throughput Metabole Profilering voor Modelverfijningen van Microalgen

DOI:

10.3791/61913

⸱

December 4th, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Genomics and Systems Biology (CGSB), New York University Abu Dhabi Research Institute, 2Department of Biology, United Arab Emirates University, 3Laboratory of Algal, Systems, and Synthetic Biology (LASSB), Division of Science and Math, New York University Abu Dhabi, 4Department of Marine Science, Ocean College, Zhejiang University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol demonstreert het gebruik van een fenotype microarray (PM) technologieplatform om metabolische vereisten van Chlamydomonas reinhardtii, een groene microalg, te definiëren en een bestaand metabolisch netwerkmodel te verfijnen.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metabole modellen worden gereconstrueerd op basis van de beschikbare genoomannotatie van een organisme en bieden voorspellende hulpmiddelen om metabole processen op systeemniveau te bestuderen. Metabole modellen op genoomschaal kunnen hiaten bevatten, evenals reacties die niet experimenteel zijn geverifieerd. Gereconstrueerde modellen van nieuw geïsoleerde microalgensoorten zullen resulteren in zwakheden als gevolg van deze hiaten, omdat er meestal schaars biochemisch bewijs beschikbaar is voor het metabolisme van dergelijke isolaten. De fenotype microarray (PM) technologie is een effectieve, high-throughput methode die functioneel cellulaire metabole activiteiten bepaalt in reactie op een breed scala aan entry metabolieten. Door de fenotypische assays met hoge doorvoer te combineren met metabole modellering kunnen bestaande metabole netwerkmodellen snel worden gereconstrueerd of geoptimaliseerd door biochemisch bewijs te leveren om genomisch bewijs te ondersteunen en uit te breiden. Dit werk zal het gebruik van PM-assays voor de studie van microalgen laten zien door de groene microalgal-modelsoort Chlamydomonas reinhardtii als voorbeeld te gebruiken. Experimenteel bewijs voor meer dan 254 reacties verkregen door PM werd in deze studie gebruikt om een genoomschaal C. reinhardtii metabolisch netwerkmodel, iRC1080, met ongeveer 25 procent uit te breiden en te verfijnen. Het protocol dat hier is gemaakt, kan worden gebruikt als basis voor het functioneel profileren van het metabolisme van andere microalgen, waaronder bekende microalgenmutanten en nieuwe isolaten.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het optimaliseren van het algenmetabolisme voor een verbeterde en stabiele productie van gerichte metabolieten vereist de ontwikkeling van complexe metabole engineeringstrategieën door middel van analyses op systeemniveau van metabole netwerken. Metabole netwerkmodellen kunnen de rationele ontwerpen begeleiden voor de snelle ontwikkeling van optimalisatiestrategieën1,2,3,4. Hoewel ongeveer 160 microalgensoorten zijn gesequenced5,zijn er, voor onze weten, slechts 44 algen metabolische modellen beschikbaar4,6,7. Vanwege de moeilijkheid om metabole fenotypische gegevens met hoge doorvoer te verkrijgen voor experimentele validatie van genomische informatie, blijft de reconstructie van hoogwaardige netwerkmodellen achter bij de snelle ontwikkeling van algengenoomsequencing.

C. reinhardtii is een aantrekkelijk modelsysteem voor op algen gebaseerde studies. Deze soort kan fotoautotrofisch of heterotroof groeien en is veel gebruikt als modelorganisme in fundamenteel en toegepast onderzoek. De genoomsequentie werd gepubliceerd in 20078, met genoomschaal metabole modellen die vervolgens werden gereconstrueerd voor de soort9,10,11. Het genoomschaalmodel voor C. reinhardtii (iRC1080) werd gereconstrueerd door Chang et al. 10 gebaseerd op genomisch en literatuurkundig bewijs (met ~250 bronnen). Het heeft 1.706 metabolieten met 2.190 reacties10; de volledigheid van het model kon echter niet worden geverifieerd buiten het beschikbare gepubliceerde experimentele bewijsmateriaal op dat moment.

De fenotype microarrays (PM's) technologie is een high-throughput platform dat metabole profileringsinformatie kan leveren voor heterotrofe micro-organismen en weefselkweekcellen. In het bijzonder kan het worden gebruikt om de fenotype-tot-genotype kenniskloof in microalgen aan te pakken, zoals eerst gemeld voor Chlamydomonas reinhardtii12 en vervolgens voor een soort Chloroidium13 en Chlorella14. Door celresponsen op duizenden metabolieten, signaalmoleculen, osmolyten en effectormoleculen te bestuderen, kunnen de PM-assays functionele metabole profilering bieden en inzicht bieden in de functie, het metabolisme en de omgevingsgevoeligheid15,16,17. In het bijzonder detecteren PM-assays het gebruik van celmetabolieten in microplaten met 96-wells met verschillende voedingsstoffen, metabolieten of osmolyten in elke put. Bovendien is het ook mogelijk om bioactieve moleculen, zoals antibiotica en hormonen, te testen. Zoals bepaald door de intensiteit van de kleurproductie door de NADH-reductie van een op tetrazolium gebaseerde redoxkleurstof, wordt het metabolische gebruik van substraten geëvalueerd in termen van celademhaling15,16,17. De experimenten met 96-well microplaten kunnen in de loop van de tijd automatisch worden gemonitord en bepaald met het fenotype microarray instrument (PMI) platform. Twintig 96-well microplaten zijn ontworpen om de gemeenschappelijke set metabolieten te vertegenwoordigen om cellulaire fenotypen te bestuderen om koolstof-, stikstof-, zwavel- en fosforbronnen te gebruiken, samen met verschillende osmotische / ionen- en pH-effecten. De PM-technologie is met succes gebruikt voor het bijwerken en upgraden van een aantal bestaande metabolische modellen op genoomschaal voor micro-organismen15,16,17,18.

Het protocol en de gegevens die hier worden getoond, zijn gebaseerd op eerder gepubliceerd werk van Chaiboonchoe et al. 12 Het gepresenteerde werk beschrijft het gebruik van de PM-testmethode om de metabole fenotypen van microalgen te karakteriseren en een bestaand algenmetabool model van C. reinhardtii uit te breiden en de reconstructie van nieuwe metabole modellen te begeleiden.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Fenotype Microarray Experimenten

  1. Verkrijg C. reinhardtii stam CC-503 van het Chlamydomonas Resource Center aan de Universiteit van Minnesota, VS (https://www.chlamycollection.org).
  2. Kweek de cellen in verse Tris-Acetaat-Fosfaat (TAP) media19 met eindconcentraties van 400 μg/ml timentine, 50 μg/ml ampicilline en 100 μg/ml kanamycine (om de bacteriegroei te remmen) onder 400 micromol fotonen/m2s, bij 25 °C, gedurende twee dagen tot halverwege de logfase.
  3. Draai de cultuur gedurende 10 minuten bij 22 °C bij 2.000 x g en gooi het supernatant weg zonder de pellet te storen.
  4. Bereid verse TAP-media met 0,1% tetrazolium violette kleurstof "D".
    OPMERKING: Wijzig TAP-media in deze stap om sommige voedingsstoffen uit te sluiten, afhankelijk van de metabolietcategorie die in elke plaat is getest (bijvoorbeeld ammoniumchloride uitsluiten voor stikstofbronplaten).
  5. Resuspend de pellet in verse TAP-media bereid (vanaf stap 1.2) tot een eindconcentratie van 1 x 106 cellen/ml.
  6. Gebruik chemische samengestelde array-testplaten (koolstofbronnen, stikstofbronnen, fosfor- en zwavelbronnenplaten en de peptidestikstofbronnen).
  7. Ent een aliquot van 100 μL celbevattende media in elke put van de testplaten.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat u de testen dupliceert.
  8. Streep cellen op gistextract / peptonplaten en voer gramkleuring uit, zoals in Smith et al. 20 voor en na de test om bacteriële besmetting te controleren.
  9. Plaats de testplaten van de chemische samengestelde array in het microplaatlezersysteem.
  10. Incubeer alle platen bij 30 °C gedurende maximaal 7 dagen en programmeer het microplaatlezersysteem om elke 15 minuten de kleurstofverandering af te lezen.
    OPMERKING: Aangezien de meeste microplaatlezers geen bron van continu licht bieden tijdens de incubatie, moeten de algen heterotrofe ademhaling kunnen uitvoeren.

2. Data-analyse

  1. Exporteer de ruwe kinetische gegevens van de microplaatlezer als CSV-bestanden, die vervolgens worden gebruikt als invoer voor het Omnilog Phenotype Microarray (OPM) -pakket in R. Voeg de biologische informatie toe als metadata (bijv. Stamaanduiding, groeimedia, temperatuur, enz.).
    1. Met behulp van de PM Kinetic data converter software; laad de D5E-gegevensbestanden en converteer ze naar OKA-bestanden met behulp van de volgende opdrachtregels in de PM kinetic analysis software:
      Laad | Importeren (zoek de map van de OKA-bestanden) | Filters invullen | | importeren Alle platen toevoegen | Sluiten.
      | exporteren kies leesgegevens (Kinetic), kies formaat (CSV) (Tabulate Header)en kies platen (elke plaat (afzonderlijke bestanden)) | Gegevens exporteren | Redden.
    2. Om de Phenotype Microarray (PM) data-analyse uit te voeren, gebruikt u het OPM-softwarepakket21,22 dat binnen de R-softwareomgeving wordt uitgevoerd. Het pakket, de zelfstudie en de referentiedocumentatie zijn beschikbaar op: http://www.goeker.org/opm/. Installeer in RStudio, een grafische gebruikersinterface voor R, het opm-pakket en de bijbehorende afhankelijkheden met behulp van de volgende opdrachten:
      bron (http://www.goeker.org/opm/install_opm.R)
      bibliotheek (opm)
    3. Navigeer naar de map met de CSV-bestanden van de kinetische gegevens en importeer de gegevens met behulp van de read_opm-functie:
      x <- read_opm(".", convert="grp", include=list ("csv:"))
    4. Aggregeer en discretiseer de kinetische gegevens met behulp van curve-parameter schatting.
      Voor (i in 1 :length(x)) {
      x[[i]]
      x[[i]] <- do_disc(x[[i]], cutoff = FALSE)
      }
      #Collection van de metadata
      metadata <- collect_template(".")
      metadata$Stam <- c("BLANK","CC- 503")
      voor (I in 1 :length(x)) {x[[i]] <- include_metadata(x[[i]], md = metadata, replace = TRUE)}
    5. Gebruik de functie xy_plot om de ademhalings- (of groei)metingen (y-as) in kaart te brengen als functie van de tijd (x-as) voor de geteste 96-putplaten.
      print (xy_plot(x[[ 1 ]], include ="Strain", theor.max = FALSE))
    6. Visualiseer de gegevens als een heatmap met behulp van de functie level_plot om een snel vergelijkend overzicht van de kinetische gegevens mogelijk te maken.
      level_plot(x, main = list(), colors = opm_opt("color.borders"), panel.headers = metadata$Strain, cex = NULL, strip.fmt = list(), striptext.fmt = list(), legend.sep =" ", spatie ="Lab", bias = 0.7 , num.colors = 200 L)
    7. Haal belangrijke biologische informatie, de curveparameters, uit de ruwe kinetische curven en omvatten de vertragingsfase (λ), de groeisnelheid (μ), de maximale celademhaling (A) en het gebied onder de curve (AUC)21. Om positieve metabolieten te identificeren, gebruikt u de A-waarden van de negatieve controle, die de abiotische reactiviteit van de kleurstof met het medium vertegenwoordigt, naast de blanco van elke microwellplaat als achtergrondaftrekkingswaarden. De extractfunctie wordt gebruikt om de parameter A te verkrijgen.
      opm_opt("curve.param")
      param <-extract (x, as.labels = list("Stam")))

3. Identificatie van reacties en genen geassocieerd met nieuwe metabolieten

  1. Zoek KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) (http://www.genome.jp/kegg/) en MetaCyc (http://metacyc.org/) om enzymcommissienummers (EC's) te identificeren voor reacties met behulp van metabolieten gevonden uit chemische samengestelde arrays23,2423,24.
  2. Gebruik de geïdentificeerde EC-nummers als zoekbasis in meerdere beschikbare bronnen voor algenannotatie, zoals Joint Genome Institute (JGI), Phytozome (http://www.phytozome.net) en peer-reviewed publicaties23,25,26,27.
  3. Als een zoekopdracht geen genetisch bewijs levert voor een bepaald EC-nummer, identificeer dan de relevante geassocieerde eiwitten in andere organismen, te beginnen met soorten die het dichtst bij de C. reinhardtiiliggen, voer vervolgens een op profiel gebaseerde zoekopdracht uit met behulp van de NCBI PSI-BLAST-server met standaardinstellingen en gebruik niet-redundante eiwitten (nr) in C. reinhardtii (taxid:3055) om kandidaatgenen te identificeren die verband houden met de reactie12.
  4. Beheer PSI-BLAST-hits handmatig met E-waarden van < 0,05 voor relevantie voor het gezochte EC-nummer door die BLAST-hits op te vragen via EMBL-EBI Pfam (http://pfam.xfam.org/search) of InterPro (http://www.ebi.ac.uk/interpro/) eiwitdomeinvoorspellingsservers. Merk op dat de laatste twee scans kritieke stappen zijn om de identificatie van de juiste enzymatische activiteit voor het eiwit te garanderen.

4. Verfijning en evaluatie van modellen

  1. Gebruik de nieuwste COBRA Toolbox v.3.028in MATLAB29,30platform om de volgende stappen voor modelverfijning uit te voeren. De COBRA Toolbox kan worden geïnstalleerd door de stappen te volgen in: https://opencobra.github.io/cobratoolbox/stable/installation.html . U kunt er ook rekening mee houden dat de COBRA Toolbox ook wordt geïmplementeerd in andere open-source programmeertalen, zoals Python (COBRApy31) en is verkrijgbaar bij: https://opencobra.github.io/cobrapy/ .
    1. Na het installeren van de COBRA Toolbox v.3.0, opent u MATLAB en voert u de volgende opdracht uit om de toolbox te initialiseren:
      initCobraToolbox;
    2. Voeg de geïdentificeerde reacties met hun bijbehorende genen toe aan het metabole model, zoals iRC1080, met behulp van de COBRA Toolbox-functies addReaction en changeGeneAssociation. Navigeer naar de map met het iRC1080-model, gedownload van http://bigg.ucsd.edu/models/iRC1080 en voer de volgende opdrachten uit om het model te laden, te hernoemen en een nieuwe reactie en het bijbehorende gen toe te voegen.
      Belasting('iRC 1080 .mat')
      modelNieuw = iRC 1080;
      modelNieuw = addReactie(modelNieuw, 'D-ALA 2' , ...
      {'d-ala[c]" , "atp[c]" , ...
      "D-aladata[c]" , "adp[c]" , "pi[c]" , ...
      "h[c]" },[- 2 - 1 1 1 1 1 ],false);
      modelNIEUW = veranderingGeneAssociation(modelNieuw, ...
      "D-ALA 2","nl 14655 _t 1" );
    3. In sommige gevallen, wanneer de metaboliet niet intracellulair wordt geproduceerd maar uit het medium wordt opgenomen, voegt u transportreacties voor de nieuwe metabolieten toe aan het model. Deze transportreacties vertegenwoordigen passieve diffusie van een metaboliet van het extracellulaire medium naar het cytosol. Voeg bovendien een overeenkomstige kunstmatige uitwisselingsreactie toe met behulp van de addExchangeRxn-functie om de metaboliet in het extracellulaire medium in te voeren of uit te voeren.
      modelNieuw = addReactie(modelNieuw, 'CYCPt' , ...
      {'cycp[e]','cycp[c]' },[- 1 1 ],true)"
      modelNew = addExchangeRxn(modelNew, 'cycp[e]' ,- 1000 ,1000 );
    4. Test het gedrag van het nieuwe resulterende model, bijvoorbeeld iBD1106, door fluxbalansanalyse (FBA) uit te voeren met behulp van de functie optimizeCbModel onder lichte en donkere omstandigheden voor de maximalisatie van biomassa als objectieve functie. Stel voor lichtgroei de onder- en bovengrenzen van de PRISM-zonnelitho'-lichtreacties in op 646,07 (maximale snelheid). Stel voor donkere groei de grenzen van alle PRISM-lichtreacties op nul. Gebruik de biomassafunctie die eerder10 is gedefinieerd voor groei onder donkere en lichte omstandigheden. De FBA-oplossing zal twee vectoren produceren die overeenkomen met reactiefluxen (solution.v) en lagere kosten (solution.w), evenals één vector die overeenkomt met de schaduwprijzen van metabolieten (solution.y).
      %Simuleer groei onder lichtomstandigheden:
      modelNew = changeRxnBounds(modelNew,{ ...
      % "PRISM_solar_litho" , ...
      "PRISM_solar_exo" , ...
      "PRISM_incandescent_ 60 W" , ...
      "PRISM_fluorescent_cool_ 215 W" , ...
      "PRISM_metal_halide" , ...
      "PRISM_high_pressure_sodium" , ...
      "PRISM_growth_room" , ...
      "PRISM_white_LED" , ...
      "PRISM_red_LED_array_ 653 nm" , ...
      "PRISM_red_LED_ 674 nm" , ...
      "PRISM_fluorescent_warm_ 18 W" , ...
      "PRISM_design_growth" , ...
      }, 0, "b");
      modelNieuw = veranderingObjectief(modelNieuw, 'BIOMASS_Chlamy_mixo');
      FBAsolutionNew = optimizeCbModel(modelNieuw, 'max');
    5. Herhaal stap 4.1.4 voor iRC1080 om FBA-oplossingen verkregen voor iBD1106 te vergelijken met die verkregen voor iRC1080.
    6. Er is een reeks COBRA-methoden beschikbaar die kunnen worden gebruikt om modellen te vergelijken (bijv. Flux variability analysis, gene deletion studies, robustness analyses, flux split predictions, FBA, sampling, etc.). Gedetailleerde tutorials zijn te vinden op https://opencobra.github.io/cobratoolbox/stable/tutorials/index.html. Hier wordt een voorbeeld gegeven waarbij het iRC1080-model wordt vergeleken met zijn verfijnde versie, iBD1106, door de schaduwprijzen (gevoeligheid van de biomassa-objectieve functie voor veranderingen in systeemvariabelen) van de metabolieten te verkrijgen die in elk model worden verantwoord.
      Verkrijg de schaduwprijzen voor de metabolieten:
      shadowPrices = table(modelNew.mets, ...
      modelNew.metNames, FBAsolutionNew.y);

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fenotype Microarray screening van model alg Chlamydomonas reinhardtii
De PM-testen testen het vermogen van de alg om verschillende bronnen van koolstof, stikstof, zwavel en fosfor in een minimaal medium te gebruiken. In deze beschrijving van de methode hebben we aangetoond hoe PM-assays werden gebruikt om het koolstof- en stikstofmetabolisme te identificeren. De kinetiek van het koolstof- en stikstofgebruik werd gemeten met een microplaatlezer. Gegevens werden geanalyseerd met behulp van PMI-software. De samenvattingkinetiek van geselecteerde PM-testplaten (PM01 en PM03) is weergegeven in figuur 1. De "xy plots" geven de ademhalingsmetingen in de loop van de tijd weer die zijn uitgezet voor de testen van de 96-putplaten, waarbij de y-as en x-as respectievelijk de waarden van ruwe metingen en tijd vertegenwoordigen. De gegevens werden omgezet in een heatmappatroon om de assemblage van de kinetische gegevens relatief te analyseren.

De pijplijn van het verfijnen van het metabolische netwerk op genoomschaal met behulp van PM-gegevens(figuur 2)illustreert de integratie van de pm-assays met hoge doorvoer met experimenteel bewijs geleverd door genomische zoekopdrachten die een metabolisch netwerkmodel kunnen uitbreiden.

Om de reproduceerbaarheid van de PM-gegevens verkregen uit PM01 - 04- en PM10-platen te bepalen, werd een lineaire regressie geanalyseerd om de gegevens van twee onafhankelijke replicatie-experimenten tegen elkaar uit te zetten (figuur 3). Figuur 3 laat zien dat de meeste gegevens bijna vergelijkbaar waren omdat ze op de 45°-lijn vallen, met slechts enkele uitschieters aanwezig, en hun bepalingscoëfficiënt R2 was 0,9. De consistentie en reproduceerbaarheid van de experimenten voor de alg worden geverifieerd door deze plot.

Identificatie van nieuwe metabolieten
De PM-test identificeerde 662 metabolieten in zeven platen; PM01-PM04 en PM06-PM08, terwijl gaschromatografie Time-Of-Flight (GC-TOF) 77 metabolieten32 had geïdentificeerd(figuur 4). Bij het vergelijken van deze twee sets met de 1068 metabolieten die in de iRC1080 zijn verwerkt, overlapten slechts zes metabolieten tussen de drie sets en overlapten 149 tussen de iRC1080 en de PM. Dit resultaat toont aan dat het metabole profileringsplatform een belangrijke bron van nieuwe metabole informatie kan zijn.

Azijnzuur was de enige koolstofbron die in plaat PM01 werd gedetecteerd als een ondersteunende koolstof na aftrek van het achtergrondsignaal. Deze bevinding is in overeenstemming met de literatuur33 en toont de specificiteit van de PM-assays. De PM-testen onthulden nieuwe zwavel-, fosfor- en stikstofbronnen die C. reinhardtii kan gebruiken voor groei. De zwavelmetabolieten waren sulfaat, thiossulfaat, tetrathionaat en DL-lipoamide. De fosforbronnen waren thiofosfaat, dithiofosfaat, D-3-fosfo-glycerinezuur en cysteamine-S-fosfaat. De stikstofbronmetabolieten waren L-amino- en D-aminozuren, waaronder minder voorkomende aminozuren; L-homoserine, L-pyroglutimisch, methylamine, ethylamine, ethanolamine en D, L-α-amino-boterzuur en 108 dipeptiden en vijf tripeptiden(tabel 1). Alle 128 nieuw geïdentificeerde metabolieten werden in KEGG en MetaCyc gezocht op hun geassocieerde reacties, EC-nummers en routes.

De nieuwe 128 metabolieten werden geassocieerd met 49 unieke EC-nummers. Hiervan werden 15 EC's gekoppeld aan hun genomisch bewijs met behulp van vijf bronnen, waaronder; Phytozome Versie 10.0.234 JGI Versie 435, AUGUSTUS 5.0, en 5.210 annotaties van Manichaikul et al. 36 en KEGG13. Metabolieten zonder genomisch bewijs werden ingevoerd op de Universal Protein Resource-website (UniProt, http://www.uniprot.org/)37,38, waar hun gerelateerde sequenties werden gevonden in andere organismen. Homologe sequenties in C. reinhardtii werden geïdentificeerd door position-specific iterated BLAST (PSI-BLAST, https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) uit te voeren vanaf de NCBI-website, waarbij alleen rekening werd gehouden met sequenties die significante uitlijningen produceerden (E-waarde <0,005).

Model verfijning
Reacties geassocieerd met de nieuwe 128 metabolieten, samen met hun gecodeerde genen, werden toegevoegd aan het iRC1080-model, waardoor het netwerk werd uitgebreid. Het resulterende model iBD1106, goed voor 2.444 reacties, 1.959 metabolieten en 1.106 genen(tabel 2). De nieuwe 254 toegevoegde reacties waren 20 aminozuuroxidatiereacties, 108 di-peptidehydrolysereacties, vijf tripeptidehydrolysereacties en 120 transportreacties, gecodeerd door vier genen (Cre02.g096350.t1.3, au.g14655_t1, e_gwW.1.243.1, Cre12.g486350.t1.3).

In totaal zijn er 113 nieuwe reacties bijgekomen die verantwoordelijk zijn voor de hydrolyse van di-peptiden en tripeptiden. De hydrolyse van di-peptiden en tripeptiden zijn geassocieerd met twee genen, één voor di-peptiden (Cre02.g078650.t1.3) en één voor tripeptiden (Cre16.g675350.t1.3).

Wat de bronnen van fosfor betreft, werd een reactie voor hydrolyse van cysteamine-S-fosfaat in cysteamine en fosfaat toegevoegd in verband met het gen JLM_162926.

De WoLF PSORT tool39 (http://www.genscript.com/psort/wolf_psort.html) en resultaten gerapporteerd door Ghamsari et al. 35 werden toegepast om de specificatie te verkrijgen van de cellulaire compartimenten waar de nieuwe reacties plaatsvinden. Door eiwitsequenties geassocieerd met de nieuwe reacties te analyseren, voorspelde WoLF PSORT cytosol als het cellulaire compartiment voor de reacties.

Een gegenereerd metabolisch model kan hiaten bevatten wanneer de biochemische informatie onvolledig is. In dergelijke gevallen wordt gapFind,een COBRA-commando, gebruikt. Het geeft een overzicht van de hoofdlacunes en maakt het mogelijk om nieuwe hiaten te identificeren die in het nieuwe model worden in het nieuwe model. De metabolieten die niet kunnen worden geproduceerd in een metabolisch model worden aangeduid als wortelkloven40,41. Analyse van de root gap gaf aan dat zowel iRC1080 als iBD1106 modellen dezelfde 91 gaps bevatten. Dit toont aan dat het toevoegen van de nieuwe metabolieten en hun bijbehorende reacties geen extra wortelspleten introduceerde. Opgemerkt moet worden dat de fenotyperingsmethode die in dit protocol wordt gebruikt, de wortelslacunes niet dicht, omdat de oorspronkelijke wortelkloofmetabolieten geen transport- of productiemechanismen hebben, die niet werden behandeld in de fenotyperingstests. Fluxbalansanalyse werd uitgevoerd om het metabolische gedrag van iBD1106 onder lichte en donkere omstandigheden te testen; (geen acetaat) en (met acetaat), respectievelijk. Het algoritme maximaliseert de biomassaprecursorreacties voor een objectieve functie (biomassagroei). Om de betrokkenheid van elke metaboliet bij de vastgestelde objectieve functie te evalueren, werden "schaduwprijzen" voor alle metabolieten berekend. De verandering in de objectieve functie met betrekking tot fluxveranderingen van de metaboliet definieert de schaduwprijs van eenmetaboliet 30,42. De indicatie of een metaboliet in "overmaat" is of de objectieve functie "beperkt" kan worden bepaald door middel van schaduwprijsanalyse, bijvoorbeeld biomassaproductie. Negatieve of positieve schaduwprijswaarden onthullen metabolieten die, na toevoeging, de objectieve functie zullen verminderen of vergroten. Nulwaarden van schaduwprijzen onthullen metabolieten die de objectieve functie niet zullen beïnvloeden. Uit de vergelijking van schaduwprijzen tussen iBD1106 en iRC1080 in figuur 5 blijkt dat voor de meeste metabolieten geen significante verandering wordt waargenomen; verschillen worden echter gevonden in respectievelijk 105 en 70 gevallen onder lichte en donkere groeiomstandigheden. Tabel 4 bevat voorbeelden van dergelijke metabolieten.

figure-results-1
Figuur 1: Fenotypische microarray profilering van C. reinhardtii. Respiratie XY-plots en niveau plots van de PM01 (Koolstofbronnen; A, C) en PM03 (stikstofbronnen; B, D) testplaten worden getoond. Het cijfer is een array van 8x12 waarbij elke cel een putplaat vertegenwoordigt en dus een bepaalde metaboliet of groeiomgeving. Binnen elke cel of putweergave vertegenwoordigen curven de kleurstofconversie door reductie (y-as) als functie van de tijd (x-as). PM-ademhalingscurven van de CC-503 en lege putjes worden in elke cel weergegeven en worden aangegeven door kleur (groenblauwe kleur vertegenwoordigt lege putjes en paarse kleur vertegenwoordigt CC-503). De level-plot vertegenwoordigt elke ademhalingscurve als een dunne horizontale lijn die in de loop van de tijd van kleur verandert (of ongewijzigd blijft). Heatmap kleurveranderingen zijn van lichtgeel (er heeft weinig tot geen ademhaling plaatsgevonden) naar donkeroranje of bruin (er heeft een aanzienlijke ademhaling plaatsgevonden). Metabolieten gebruikt door C. reinhardtii (CC-503) en de blanco platen worden getoond. Deze figuur komt uit een eerder gepubliceerd werk van Chaiboonchoe et al. 12Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 

figure-results-2
Figuur 2: Genoomschaal metabole netwerk verfijningspijplijn met behulp van PM-gegevens. Nadat een nieuwe verbinding positief test in een PM-test, worden het Enzymcommissienummer (EC), de reactie en de route geïdentificeerd uit beschikbare databases, bijvoorbeeld KEGG en MetaCyc. Genomisch bewijs wordt vervolgens geëxtraheerd uit genomische en annotatiebronnen indien beschikbaar en vormt een verband tussen genotype en fenotype. Wanneer direct genomisch bewijs niet beschikbaar is, wordt de eiwitsequentie geïdentificeerd aan de ec-nummers en genetisch bewijs via PSI-Blast. Het gereconstrueerde metabole netwerk wordt vervolgens verfijnd op basis van nieuw geïdentificeerde verbindingen, maar alleen na een kwaliteitscontrolestap waarbij de eiwitdomeinen worden bevraagd met behulp van relevante databases. Deze figuur is aangepast van eerder gepubliceerd werk van Chaiboonchoe et al. 12Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 

figure-results-3
Figuur 3: Reproduceerbaarheid van PM-tests. De PMI-waarden werden verzameld over een periode van 168 uur en de maximale PMI-waarden werden uitgezet voor twee replicatiestudies. Elke as vertegenwoordigt de maximale PMI-waarden voor elk onderzoek (de x-as is de ene replicatiestudie en de y-as een andere). Gereproduceerde waarden zijn op gelijke afstand van elke as. Elk punt vertegenwoordigt één maximumwaarde. De lineaire regressie werd uitgevoerd door een spreadsheetsoftware en de resulterende bepalingscoëfficiënt (R2)wordt weergegeven. Deze figuur is aangepast van eerder gepubliceerd werk van Chaiboonchoe et al. 12Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 

figure-results-4
Figuur 4: Venn diagram van metabolieten. Het Venn-diagram somt metabolieten op die zijn geïdentificeerd door PM-platen, het iRC1080 metabole model en gaschromatografie Time of Flight (GC-TOF) experimenten. Elke cirkel geeft het totale aantal metabolieten aan dat in elke respectieve onderzoeksmethode bestaat. Tegelijkertijd vertegenwoordigen de overlappende regio's het aantal metabolieten dat tussen die methoden wordt gedeeld. Het iRC1080 metabole model bevat in totaal 1.068 unieke metabolieten. De GC-TOF identificeerde in totaal 77 metabolieten32, terwijl er in totaal 662 metabolieten zijn geïdentificeerd met behulp van de PM-platen. Deze figuur komt uit eerder gepubliceerd werk van Chaiboonchoe et al. 12Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: Schaduwprijzen van metabolieten in iRC1080 en iBD1106 onder verschillende omstandigheden voor biomassamaximalisatie. Elke cirkel op de "radarplots" komt overeen met een schaduwprijswaarde, terwijl elke lijn die zich uitstrekt vanuit het midden van een plot een metaboliet aangeeft. (A) Schaduwprijzen en metabolisch gedrag van iRC1080 en iBD1106 onder een lichte groeiconditie; (B), verschillende metabole gedragingen van iRC1080 en iBD1106 onder een donkere groeiconditie. Deze figuur komt uit eerder gepubliceerd werk van Chaiboonchoe et al. 12Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Biologie ChemischeEG* Gen AnnotatiePSI-BLAST
Cysteamine-S-Fosfaat3.1.3.1JLM_1629261,2,3,4
Tetrathionaat1.8.2.2onbeduidende E-waarde
1.8.5.2onbeduidende E-waarde
D-Alanine1.4.1.1XP_001700222,1
1.5.1.22mislukte handmatige QC
2.1.2.7onbeduidende E-waarde
1.4.3.3Cre02.g096350.t1.35
2.3.2.10onbeduidende E-waarde
2.3.2.14onbeduidende E-waarde
2.3.2.16onbeduidende E-waarde
2.3.2.17onbeduidende E-waarde
2.3.2.18onbeduidende E-waarde
2.6.1.21mislukte handmatige QC
3.4.13.22XP_001698572.1, XP_001693532.1, XP_001701890.1, XP_001700930.1
3.4.16.4Chlre2_kg.scaffold_ 140000391,2,3
3.4.17.8mislukte handmatige QC
3.4.17.13onbeduidende E-waarde
3.4.17.14onbeduidende E-waarde
4.5.1.2onbeduidende E-waarde
6.1.1.13mislukte handmatige QC
6.1.2.1mislukte handmatige QC
6.3.2.4au.g14655_t11,2,3
6.3.2.10mislukte handmatige QC
6.3.2.16onbeduidende E-waarde
6.3.2.35onbeduidende E-waarde
D-Asparagine1.4.5.1onbeduidende E-waarde
1.4.3.3Cre02.g096350.t1.35
3.1.1.96onbeduidende E-waarde
2.3.1.36onbeduidende E-waarde
1.4.99.1XP_001692123,1
3.5.1.77e_gwW.1.243.11,2
3.5.1.81onbeduidende E-waarde
5.1.1.10mislukte handmatige QC
D-asparaginezuur6.3.1.12onbeduidende E-waarde
1.4.3.3Cre02.g096350.t1.35
D-glutaminezuur1.4.3.7onbeduidende E-waarde
1.4.3.3onbeduidende E-waarde
D-Lysine5.4.3.4onbeduidende E-waarde
1.4.3.3Cre02.g096350.t1.35
6.3.2.37mislukte handmatige QC
Serine2.7.11.8onbeduidende E-waarde
2.7.11.17Cre12.g486350.t1.31,2,3,4
3.4.21.78mislukte handmatige QC
3.4.21.104mislukte handmatige QC
4.3.1.18G6244.t14 mislukte handmatige QC
6.3.2.35onbeduidende E-waarde
6.3.3.5onbeduidende E-waarde
1.4.3.3Cre02.g096350.t1.35
D-Valine1.21.3.1mislukte handmatige QC
6.3.2.26mislukte handmatige QC
1.4.3.3Cre02.g096350.t1.35
L-Pyroglutaminezuur
Thiofosfaat
Dithiofosfaat
Ethylamine6.3.1.6
D, L-a-Amino-Boterzuur2.1.1.49onbeduidende E-waarde
1.4.3.3Cre02.g096350.t1.35
Di-peptide3.4.13.18Cre02.g078650.t1.31
Tri-peptide3.4.11.4Cre16.g675350.t1.31

Tabel 1: Lijst van geïdentificeerde metabolieten van positief substraatgebruik (C, P, S, N) die niet aanwezig zijn in het iRC1080 metabole model.  *Reactie was niet inbegrepen als er geen gen werd geïdentificeerd.  1 Phytozome versie 10.0.2 (http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#!info?alias=Org_Creinhardtii).   Arabisch cijfer JGI versie 4 35.  3 Augustus versie 510.  4 KEGG (http://www.genome.jp/kegg/kegg1.html).  5 JGI versie 3.136.  Deze tabel is afkomstig uit eerder gepubliceerd werk van Chaiboonchoe et al. 12

ModelReactiesMetabolietenGenen
iRC10802,1911,7061,086
iBD11062,4451,9591,106

Tabel 2: Inhoud van iRC1080 en iBD1106.  Deze tabel is afkomstig uit eerder gepubliceerd werk van Chaiboonchoe et al. 12

Categorie of klasse van reactiesAantal reacties
Aminozuren20
Dipeptiden108
Tripeptiden5
Transportreactie120

Tabel 3: Samenvatting van de nieuwe reacties in iBD1106. Deze tabel is afkomstig uit eerder gepubliceerd werk van Chaiboonchoe et al. 12

GroeiconditieMetabolietNaamiRC1080iBD1106
4r5au4-(1-D-Ribitylamino)-5-aminouracil00.168
5aprbu5-Amino-6-(5'-fosforibitylamino)uracil-0.0090.158
LichtPA1819Z18111Z1-(9Z)-octadecenoyl,2-(11Z)-octadecenoyl-sn-glycerol3-fosfaat-0.009-0.65
Donker4abut4-aminobutanoaat0.18-0.05

Tabel 4: Voorbeeld van significante schaduwprijzen voor iRC1080 en iBD1106. Deze tabel is afkomstig uit eerder gepubliceerd werk van Chaiboonchoe et al. 12

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metabole fenotypering van de groene microalg, C. reinhardtii, werd hier beschreven met behulp van PM-testplaten met hoge doorvoer en een ongewijzigde PMI. De testen werden gebruikt voor in totaal 190 koolstofbronnen (PM01 en PM02), 95 stikstofbronnen (PM03), 59 fosforbronnen en 35 zwavelbronnen (PM04), samen met peptidestikstofbronnen (PM06-08). Positieve ademhaling werd waargenomen voor 148 voedingsstoffen (één positieve test voor C-brongebruik, vier positieve assays voor elk de S-source en P-source gebruik, en 139 positieve assays voor N-source gebruik). De componenten substraten of nutriënten (koolstof, stikstof, fosfor of zwavel) van de media mogen niet aan het gedefinieerde medium worden toegevoegd wanneer ze worden aangebracht op de relevante PM-microplaten die voor elk van deze bronnen worden getest.

De hier getoonde methode is effectief voor het karakteriseren van metabole microalgenfenotypen die kunnen worden gebruikt om bestaande metabole netwerkmodellen uit te breiden of de reconstructie van nieuwe modellen te sturen. Verder, omdat de voedingsbehoeften van de meeste microalgen niet bekend zijn, kan dit platform worden gebruikt om deze snel te definiëren. Nelson et al. 43 had deze methoden met succes toegepast om nieuwe verbindingen te identificeren die de groei van de microalgen Chloroidium sp. UTEX 3007 ondersteunen en gebruikte de verkregen informatie om de metabolieten van de soortinvoer te definiëren, die, in tegenstelling tot Chlamydomonas, 40 verschillende koolstofbronnen omvatten.

Een belangrijke beperking van de PM voor het profileren van microalgen is dat de PMI geen verlichting heeft in de incubatiekamer en dat de microalgen het heterotroof metabolisme moeten kunnen uitvoeren. De afwezigheid van licht kan van invloed zijn op de interpretatie van modellen die licht bevatten om metabole fluxen te berekenen. Genparen met coördinerende functies zijn mede geëvolueerd om metabole netwerkhubs te vormen, en het onderscheid tussen fotosynthetische en niet-fotosynthetische netwerkhubs kan worden gemaakt44. Over het algemeen zouden fotosynthetische netwerkhubs (d.w.z. sterk verbonden knooppunten in het model) buiten heterotrofe modellen worden gelaten. Voor praktische doeleinden moet het modelleren van heterotrofe bij mixotrofe soorten reacties waarvan bekend is dat ze door licht worden aangedreven, weglaten en rekening houden met de energiebalansverschillen tussen omstandigheden. Het modelleren van lichtafhankelijk en lichtonafhankelijk metabolisme is dus standaardpraktijk in Chlamydomonas metabole modellering6,45.

Van sommige groene microalgen, zoals Trebouxiophyten, is bekend dat ze een verscheidenheid aan koolstofmoleculen voor groei assimileren, en dit wordt verondersteld te zijn voortgekomen uit hun lange evolutionaire geschiedenis als leden van korstmossen46. Terwijl chlorofyten zoals Chlamydomonas acetaat kunnen gebruiken voor groei, kan de bruine mariene microalg Tisochrysis lutea, bekend om zijn potentieel om commercieel zeer lange-keten meervoudig onverzadigde vetzuren (VLC-PUFA's) te produceren, geen acetaat gebruiken, maar kan glycerol gebruiken voor groei47. Biomassaconcentratie van meer dan 100 g l−1 droge celgewicht is bereikt met Chlorella met geoptimaliseerde toevoeging van organische koolstofbronnen in een fed-batch-modus48. Verder kan de toevoeging van suiker aan Chlorellavulgaris de vastlegging van CO2verhogen, waardoor een additief voordeel wordt geboden tijdens fotosynthetische groei49. De meeste heterotrofe microalgen kunnen ook mixotrofisch groeien, maar van de Chlorofyt Chromochloris zofingiensis is aangetoond dat het de fotosynthese uitschakelt bij de toevoeging van suiker50.

Diatomeeën, behorend tot de divisie Bacillariophyta, zijn een belangrijke groep fytoplankton. Hoewel de meeste diatomeeën alleen fotoautotrofisch kunnen groeien, kunnen sommigen van hen mixotrofisch of heterotrofisch worden gekweekt51. Glycerol bleek bijvoorbeeld de groei in het licht te ondersteunen in afwezigheid van CO2 in sommige diatomeeën, waaronder de modelsoort Phaeodactylum tricornutum52. Ook kunnen sommige benthische diatomeeën zoals Nitzschia linearis in het donker op koolhydraten groeien53. Het is waarschijnlijk dat de PM-testen worden uitgebreid naar diatomeeën en andere algengroepen door geschikte organische koolstofbronnen aan te vullen om de cellen in staat te stellen heterotrofisch te groeien, en een mixotrofiestrategie kan mogelijk ook worden gebruikt voor de obligate autotrofe microalgen die een minimaal vereiste lichttoevoer bieden.

Om de reproduceerbaarheid van de gegevens te beoordelen, wordt het ten zeerste aanbevolen om dubbele testen uit te voeren voor alle platen. Een test kan alleen als positief worden beschouwd als, na aftrek van de negatieve controle en de respectieve blanco putten, de absorptie (PMI-waarde) positief is. Deze beschrijving, in aanwezigheid van de geteste verbinding, is een weerspiegeling van de abiotische reactie van de kleurstof met het medium.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Belangrijke ondersteuning voor dit werk werd geleverd door het NYUAD Center for Genomics and Systems Biology (CGSB), gefinancierd door Tamkeen onder de New York University Abu Dhabi Research Institute grant (73 71210 CGSB9) en NYU Abu Dhabi Faculty Research Funds (AD060). W.F. werd bovendien ondersteund door het Hundred Talents Program van Zhejiang University. We bedanken Ashish Jaiswal voor hulp bij het opnemen van de video. We bedanken Hong Cai voor het genereren van de metabole fenotypegegevens.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AmpicillinVWR97062-796
Biolog assay plates [ PM01-08]Biolog, Hayward, CA, USA
Biolog Omnilog InstrumentBiolog, Hayward, CA, USA
Chlamydomonas reinhardtii strain CC-503Chlamydomonas Resource Center at the University of Minnesota, USA.Regents of the University of Minnesota
KanamycinVWR0408-EU-10G
Tetrazolium Violet Dye “D”Biolog, Hayward, CA, USA
TimentinGlaxoSmithKline Australia Pty Ltd42010012-2

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Oberhardt, M. A., Palsson, B. Ø, Papin, J. A. J. M. Applications of genome-scale metabolic reconstructions. Molecular Systems Biology. 5 (1), 320(2009).
  2. Schmidt, B. J., Lin-Schmidt, X., Chamberlin, A., Salehi-Ashtiani, K., Papin, J. A. Metabolic systems analysis to advance algal biotechnology. Biotechnology Journal. 5 (7), 660-670 (2010).
  3. Koskimaki, J. E., Blazier, A. S., Clarens, A. F., Papin, J. A. J. I. B. Computational models of algae metabolism for industrial applications. Industrial Biotechnology. 9 (4), 185-195 (2013).
  4. Koussa, J., Chaiboonchoe, A., Salehi-Ashtiani, K. J. B. Computational approaches for microalgal biofuel optimization: a review. BioMed Research. 2014, 649453(2014).
  5. Nelson, D. R., et al. Large-scale genome sequencing reveals the driving forces of viruses in microalgal evolution. Cell Host & Microbe. 29 (2), 250-266 (2021).
  6. Shene, C., Asenjo, J. A., Chisti, Y. Metabolic modelling and simulation of the light and dark metabolism of Chlamydomonas reinhardtii. The Plant Journal. 96 (5), 1076-1088 (2018).
  7. Tibocha-Bonilla, J. D., Zuñiga, C., Godoy-Silva, R. D., Zengler, K. Advances in metabolic modeling of oleaginous microalgae. Biotechnology for Biofuels. 11 (1), 241(2018).
  8. Merchant, S. S., et al. The Chlamydomonas genome reveals the evolution of key animal and plant functions. Science. 318 (5848), 245-250 (2007).
  9. May, P., Christian, J. -O., Kempa, S., Walther, D. J. B. G. ChlamyCyc: an integrative systems biology database and web-portal for Chlamydomonas reinhardtii. BMC Genomics. 10 (1), 209(2009).
  10. Chang, R. L., et al. Metabolic network reconstruction of Chlamydomonas offers insight into light-driven algal metabolism. Molecular Systems Biology. 7 (1), (2011).
  11. de Oliveira Dal'Molin, C. G., Quek, L. -E., Palfreyman, R. W., Nielsen, L. K. AlgaGEM - a genome-scale metabolic reconstruction of algae based on the Chlamydomonas reinhardtii genome. BMC Genomics. 12 (5), (2011).
  12. Chaiboonchoe, A., et al. Microalgal metabolic network model refinement through high-throughput functional metabolic profiling. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 2, 68(2014).
  13. Kanehisa, M., et al. Data, information, knowledge and principle: back to metabolism in KEGG. Nucleic Acids Research. 42 (1), 199-205 (2014).
  14. Zuñiga, C., et al. Genome-scale metabolic model for the green alga Chlorella vulgaris UTEX 395 accurately predicts phenotypes under autotrophic, heterotrophic, and mixotrophic growth conditions. Plant Physiology. 172 (1), 589-602 (2016).
  15. Bochner, B. R. New technologies to assess genotype-phenotype relationships. Nature Reviews Genetics. 4 (4), 309-314 (2003).
  16. Bochner, B. R. Global phenotypic characterization of bacteria. FEMS Microbiology Reviews. 33 (1), 191-205 (2009).
  17. Bochner, B. R., Gadzinski, P., Panomitros, E. Phenotype microarrays for high-throughput phenotypic testing and assay of gene function. Genome Research. 11 (7), 1246-1255 (2001).
  18. Bartell, J. A., Yen, P., Varga, J. J., Goldberg, J. B., Papin, J. A. Comparative metabolic systems analysis of pathogenic Burkholderia. Journal of Bacteriology. 196 (2), 210-226 (2014).
  19. Gorman, D. S., Levine, R. J. P. otN. A. oS. Cytochrome f and plastocyanin: their sequence in the photosynthetic electron transport chain of Chlamydomonas reinhardi. PNAS. 54 (6), 1665-1669 (1965).
  20. Smith, A. C., Hussey, M. A. Gram stain protocols. American Society for Microbiology. , 1-9 (2005).
  21. Vaas, L. A. I., et al. opm: an R package for analysing OmniLog phenotype microarray data. Bioinformatics. 29 (14), 1823-1824 (2013).
  22. Vaas, L. A. I., Sikorski, J., Michael, V., Göker, M., Klenk, H. -P. Visualization and Curve-Parameter Estimation Strategies for Efficient Exploration of Phenotype Microarray Kinetics. PLoS ONE. 7 (4), 34846(2012).
  23. Caspi, R., et al. The MetaCyc database of metabolic pathways and enzymes-a 2019 update. Nucleic Acids Research. 48 (1), 445-453 (2020).
  24. Kanehisa, M., Furumichi, M., Sato, Y., Ishiguro-Watanabe, M., Tanabe, M. KEGG: integrating viruses and cellular organisms. Nucleic Acids Research. , (2020).
  25. Lopez, D., Casero, D., Cokus, S. J., Merchant, S. S., Pellegrini, M. Algal Functional Annotation Tool: a web-based analysis suite to functionally interpret large gene lists using integrated annotation and expression data. BMC Bioinformatics. 12 (1), 282(2011).
  26. Caspi, R., et al. The MetaCyc database of metabolic pathways and enzymes. Nucleic Acids Research. 46, 633-639 (2018).
  27. Sahoo, S., et al. dEMBF v2. 0: An Updated Database of Enzymes for Microalgal Biofuel Feedstock. Plant and Cell Physiology. 61 (5), 1019-1024 (2020).
  28. Heirendt, L., et al. Creation and analysis of biochemical constraint-based models using the COBRA Toolbox v. 3.0. Nature Protocols. 14 (3), 639-702 (2019).
  29. Heirendt, L., et al. Creation and analysis of biochemical constraint-based models using the COBRA Toolbox v. 3.0. Nature Protocols. 1, (2019).
  30. Orth, J. D., Thiele, I., Palsson, B. Ø What is flux balance analysis. Nature Biotechnology. 28 (3), 245(2010).
  31. Ebrahim, A., Lerman, J. A., Palsson, B. O., Hyduke, D. R. COBRApy: constraints-based reconstruction and analysis for python. BMC Systems Biology. 7 (1), 74(2013).
  32. Bölling, C., Fiehn, O. Metabolite profiling of Chlamydomonas reinhardtii under nutrient deprivation. Plant Physiology. 139 (4), 1995-2005 (2005).
  33. Harris, E. H. The Chlamydomonas sourcebook: introduction to Chlamydomonas and its laboratory use. 1, Academic Press. (2009).
  34. Goodstein, D. M., et al. Phytozome: a comparative platform for green plant genomics. Nucleic Acids Research. 40, 1178-1186 (2012).
  35. Ghamsari, L., et al. Genome-wide functional annotation and structural verification of metabolic ORFeome of Chlamydomonas reinhardtii. BMC Genomics. 12 (1), 4(2011).
  36. Manichaikul, A., et al. Metabolic network analysis integrated with transcript verification for sequenced genomes. Nature Methods. 6 (8), 589-592 (2009).
  37. Apweiler, R., et al. UniProt: the Universal Protein knowledgebase. Nucleic Acids Research. 32, 115-119 (2004).
  38. Consortium, T. U. Activities at the universal protein resource (UniProt). Nucleic Acids Research. 42 (11), 7486-7486 (2014).
  39. Horton, P., et al. PSORT: protein localization predictor. Nucleic Acids Research. 35, suppl_2 585-587 (2007).
  40. Becker, S. A., et al. Quantitative prediction of cellular metabolism with constraint-based models: the COBRA Toolbox. Nature Protocols. 2 (3), 727-738 (2007).
  41. Schellenberger, J., et al. Quantitative prediction of cellular metabolism with constraint-based models: the COBRA Toolbox v2.0. Nature Protocols. 6 (9), 1290(2011).
  42. Varma, A., Boesch, B. W., Palsson, B. O. Stoichiometric interpretation of Escherichia coli glucose catabolism under various oxygenation rates. Applied and Environmental Microbiology. 59 (8), 2465-2473 (1993).
  43. Nelson, D. R., et al. The genome and phenome of the green alga Chloroidium sp. UTEX 3007 reveal adaptive traits for desert acclimatization. eLife. , 25783(2017).
  44. Chaiboonchoe, A., et al. Systems level analysis of the Chlamydomonas reinhardtii metabolic network reveals variability in evolutionary co-conservation. Molecular BioSystems. 12 (8), 2394-2407 (2016).
  45. Chang, R. L., et al. Metabolic network reconstruction of Chlamydomonas offers insight into light-driven algal metabolism. Molecular Systems Biology. 7 (1), 518(2011).
  46. Rajendran, A., Hu, B. Mycoalgae biofilm: development of a novel platform technology using algae and fungal cultures. Biotechnology for Biofuels. 9 (1), 112(2016).
  47. Hu, H., et al. Effect of cultivation mode on the production of docosahexaenoic acid by Tisochrysis lutea. AMB Express. 8 (1), 50(2018).
  48. Bumbak, F., Cook, S., Zachleder, V., Hauser, S., Kovar, K. Best practices in heterotrophic high-cell-density microalgal processes: achievements, potential and possible limitations. Applied Microbiology and Biotechnology. 91 (1), 31(2011).
  49. Fu, W., et al. Sugar-stimulated CO2 sequestration by the green microalga Chlorella vulgaris. Science of the Total Environment. 654, 275-283 (2019).
  50. Roth, M. S., et al. Regulation of oxygenic photosynthesis during trophic transitions in the green alga Chromochloris zofingiensis. The Plant Cell. , (2019).
  51. Villanova, V., et al. Investigating mixotrophic metabolism in the model diatom Phaeodactylum tricornutum. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 372 (1728), 20160404(2017).
  52. Cerón-García, M., et al. Mixotrophic growth of Phaeodactylum tricornutum on fructose and glycerol in fed-batch and semi-continuous modes. Bioresource Technology. 147, 569-576 (2013).
  53. Tuchman, N. C., Schollett, M. A., Rier, S. T., Geddes, P. Advances in Algal Biology: A Commemoration of the Work of Rex Lowe. , Springer. 167-177 (2006).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Metabolic ProfilingPhenotype MicroarrayGenome Scale ModelsChlamydomonas ReinhardtiiMetabolic Network RefinementFlux Balance AnalysisCOBRA ToolboxPhenotypic AssaysMetabolite IdentificationModel Expansion

Related Articles