Xenopus laevis | Voorbereiding van ei-extract en live beeldvormingsmethoden voor het visualiseren van dynamische cytoplasmatische organisatie

Xianrui Cheng; James E. Ferrell, Jr.

doi:10.3791/61923

Method Article

Xenopus laevis | Voorbereiding van ei-extract en live beeldvormingsmethoden voor het visualiseren van dynamische cytoplasmatische organisatie

DOI:

10.3791/61923

⸱

June 6th, 2021

Xianrui Cheng¹^,² , James E. Ferrell, Jr.¹^,³

¹Department of Chemical and Systems Biology, Stanford University School of Medicine, ²Current Address: Department of Biological Sciences, University of Southern California, ³Department of Biochemistry, Stanford University School of Medicine

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We beschrijven een methode voor de bereiding en live beeldvorming van onverdunde cytoplasmatische extracten van Xenopus laevis-eieren .

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Xenopus laevis ei-extracten, die traditioneel worden gebruikt voor biochemische bulktests, zijn naar voren gekomen als een krachtig op beeldvorming gebaseerd hulpmiddel voor het bestuderen van cytoplasmatische verschijnselen, zoals cytokinese, mitotische spindelvorming en assemblage van de kern. Voortbouwend op vroege methoden die vaste extracten in beeld brachten die op schaarse tijdstippen waren bemonsterd, beeldden recente benaderingen live-extracten af met behulp van time-lapse-microscopie, waarbij meer dynamische kenmerken met verbeterde temporele resolutie werden onthuld. Deze methoden vereisen meestal geavanceerde oppervlaktebehandelingen van het beeldvormende vat. Hier introduceren we een alternatieve methode voor live beeldvorming van ei-extracten die geen chemische oppervlaktebehandeling vereisen. Het is eenvoudig te implementeren en maakt gebruik van in massa geproduceerde laboratorium verbruiksartikelen voor beeldvorming. We beschrijven een systeem dat kan worden gebruikt voor zowel wide-field als confocale microscopie. Het is ontworpen voor het afbeelden van extracten in een 2-dimensionaal (2D) veld, maar kan eenvoudig worden uitgebreid naar beeldvorming in 3D. Het is zeer geschikt voor het bestuderen van ruimtelijke patroonvorming binnen het cytoplasma. Met representatieve gegevens demonstreren we de typische dynamische organisatie van microtubuli, kernen en mitochondriën in interfase-extracten die met deze methode zijn bereid. Deze beeldgegevens kunnen kwantitatieve informatie verschaffen over cytoplasmatische dynamica en ruimtelijke organisatie.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het cytoplasma vormt het hoofdvolume van een cel en heeft een aparte organisatie. De ingrediënten van het eukaryote cytoplasma kunnen zichzelf assembleren tot een breed scala aan ruimtelijke structuren, zoals microtubule-asters en het Golgi-apparaat, die op hun beurt dynamisch worden gerangschikt en omgedraaid, afhankelijk van de identiteit en fysiologische toestand van de cel. Het begrijpen van de ruimtelijke organisatie van het cytoplasma en de link met cellulaire functies is dus belangrijk om te begrijpen hoe de cel werkt. Xenopus laevis ei-extracten worden traditioneel gebruikt voor biochemische bulktests ^{1,2,3,4,5,6,7,8}....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle hier beschreven methoden zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van Stanford University.

1. Voorbereiding van dia's en coverslips

Breng een laag gefluoreerd ethyleenpropyleen (FEP) plakband aan op een glasplaat met een rolapplicator. Knip overtollige tape over de randen af met een schoon scheermesje. Bereid FEP tape-coated coverslips op dezelfde manier voor (figuur 1A).
Breng een dubbelzijdige plakkerige beeldafstandhouder aan op de fep-tape-gecoate kant van de dia. Laat de beschermende voering aan de bovenkant ongepeld (figuur ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Xenopus laevis ei-extracten kunnen worden gebruikt om de zelforganisatie van het cytoplasma tijdens de interfase te bestuderen. Figuur 2A toont de resultaten van een succesvol experiment. We vulden interfase-arresteerde extracten aan met gedemembraneerde Xenopus laevis spermakernen¹⁹ in een concentratie van 27 kernen/μL en 0,38 μM gezuiverd GST-GFP-NLS ^27,28,29,30

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Xenopus laevis ei-extracten zijn naar voren gekomen als een krachtig modelsysteem voor op beeldvorming gebaseerde studies van verschillende subcellulaire structuren 10,14,15,16,17,18,21,31,32,33,34,35,36 en cytoplasmatische organisatie op een geheel

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken J. Kamenz, Y. Chen en W. Y. C. Huang voor hun commentaar op het manuscript. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health (R01 GM110564, P50 GM107615 en R35 GM131792) toegekend aan James E. Ferrell, Jr.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
17 ml centrifuge tube	Beckman Coulter	337986
22x22 mm square #1 cover glass	Corning	284522
Aprotinin	MilliporeSigma	10236624001	Protease inhibitor
Cycloheximide	MilliporeSigma	01810	Protein synthesis inhibitor
Cytochalasin B	MilliporeSigma	C6762	Actin polymerization inhibitor
Female Xenopus laevis frogs	Nasco	LM00535MX
Fluorescent HiLyte 488 labeled tubulin protein	Cytoskeleton, Inc.	TL488M-A	For visualizing the microtubule cytoskeleton
Fluorescent HiLyte 647 labeled tubulin protein	Cytoskeleton, Inc.	TL670M-A	For visualizing the microtubule cytoskeleton
Fluorinated ethylene propylene (FEP) optically clear tape	CS Hyde company	23-FEP-2-5
Glass Pasteur pipette	Fisher Scientific	13-678-20C
Human chorionic gonadotropin (hCG)	MilliporeSigma	CG10
Imaging spacer	Electron Microscopy Sciences	70327-8S
Leupeptin	MilliporeSigma	11017101001	Protease inhibitor
Microscope slides	Fisher Scientific	12-518-100B
Mineral oil	MilliporeSigma	330760
MitoTracker Red CMXRos	Thermo Fisher Scientific	M7512	For visualizing mitochondria
Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG)	BioVendor	RP1782725000
Roller applicator	Amazon	B07HMBJSP8	For applying the FEP tape to the glass slides and coverslips
Single-edged razor blades	Fisher Scientific	12-640	For removing excessive FEP tape
Transfer pipette	Fisher Scientific	13-711-7M

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Murray, A. W., Kirschner, M. W. Cyclin synthesis drives the early embryonic cell cycle. Nature. 339 (6222), 275-280 (1989).
Dunphy, W. G., Brizuela, L., Beach, D., Newport, J. The Xenopus cdc2 protein is a component of MPF, a cytoplasmic regulator of mitosis. Cell. 54

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Xenopus laevis | Voorbereiding van ei-extract en live beeldvormingsmethoden voor het visualiseren van dynamische cytoplasmatische organisatie

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles