Hier wordt een protocol gepresenteerd om oligonucleotiden zoals klein-interfererend RNA (siRNA), micro-RNA-mimics (miRs) of anti-micro-RNA (anti-miR) af te leveren in volwassen adipocyten om eiwit- en micro-RNA-expressie te moduleren.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een adipocytencelkweekmodel om de impact van eiwit- en micro-RNA-modulatie op de adipocytenfunctie te bestuderen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Verandering van de adipocytenfunctie draagt bij aan de pathogenese van metabole ziekten, waaronder diabetes type 2 en insulineresistentie. Dit benadrukt de noodzaak om het moleculaire mechanisme dat betrokken is bij adipocytendisfunctie beter te begrijpen om nieuwe therapieën tegen obesitasgerelateerde ziekten te ontwikkelen. Het moduleren van de expressie van eiwitten en micro-RNA's in adipocyten blijft zeer uitdagend. Dit artikel beschrijft een protocol om murine fibroblasten te differentiëren in volwassen adipocyten en om de expressie van eiwitten en micro-RNA's in volwassen adipocyten te moduleren door middel van omgekeerde transfectie met behulp van klein-interfererend RNA (siRNA) en micro-RNA nabootsen (miR mimic) oligonucleotiden. Dit omgekeerde transfectieprotocol omvat de incubatie van het transfectiereagens en de oligonucleotiden om een complex te vormen in de celkweekplaat waaraan de volwassen adipocyten worden toegevoegd. De adipocyten mogen zich vervolgens opnieuw hechten aan het aanhangen van plaatoppervlak in aanwezigheid van het oligonucleotiden /transfectiereagenscomplex. Functionele analyses zoals de studie van insulinesignalering, glucoseopname, lipogenese en lipolyse kunnen worden uitgevoerd op de getransfecteerde 3T3-L1 volwassen adipocyten om de impact van eiwit- of micro-RNA-manipulatie op de adipocytenfunctie te bestuderen.
Inleiding
Obesitas wordt beschouwd als een belangrijke risicofactor voor tal van stofwisselingsziekten, waaronder insulineresistentie (IR), diabetes type 2 (T2D) en hart- en vaatziekten1. De huidige therapieën zijn er niet in geslaagd om de voortdurend stijgende prevalentie van deze ziekten te stoppen, en het beheer van de IR van obese en diabetische patiënten blijft een belangrijk klinisch probleem. Vetweefsel speelt een cruciale rol bij de controle van energiehomeostase en de pathologische expansie tijdens obesitas draagt bij aan de ontwikkeling van IR en T2D2,3. Dit benadrukt de noodzaak om het moleculaire mechanisme dat betrokken is bij adipocytendisfunctie beter te begrijpen om nieuwe therapieën tegen obesitasgerelateerde ziekten te ontwikkelen. Veel onderzoeken hebben de rol van eiwitcoderende RNA's in de adipocytenfysiologie en hun associatie met obesitas onderzocht.
Meer recent heeft de ontdekking van niet-coderende RNA's (ncRNA's), met name micro-RNA's (miRs), nieuwe concepten gesmeed met betrekking tot het mechanisme van de regulatie van genexpressieprogramma's. Studies hebben aangetoond dat ncRNA's belangrijke regulatoren zijn van de adipocytenfunctie en dat hun ontregeling een belangrijke rol speelt bij stofwisselingsziekten4. De manipulatie van eiwitten en ncRNA's in adipocyten is dus cruciaal om hun rol in de adipocytenfunctie en hun impact op pathologieën zoals T2D te ontcijferen. Het manipuleren van de expressie van eiwitten en ncRNA's in vivo en in primaire adipocyten blijft echter zeer uitdagend, wat het gebruik van in vitro adipocytenmodellen bevordert.
Murine 3T3-L1 fibroblasten differentiëren gemakkelijk in volwassen, functionele en insuline-responsieve adipocyten, die een goed gekarakteriseerde cellijn zijn die wordt gebruikt om de adipocytenfunctie te bestuderen (bijv. Insulinesignalering, glucoseopname, lipolyse en adipokines-secretie)5,6,7,8,9,10. Deze eigenschappen maken 3T3-L1-adipocyten een aantrekkelijk model om de expressie van eiwitcoderende en nc-RNA's te moduleren om hun rol in de adipocytenfunctie en hun potentiële rol bij obesitasgerelateerde ziekten te ontcijferen. Helaas, terwijl 3T3-L1 fibroblasten gemakkelijk te transfecteren zijn met behulp van in de handel verkrijgbare reagentia, zijn gedifferentieerde 3T3-L1-adipocyten een van de moeilijkste cellijnen om te transfecteren. Dit is de reden waarom talrijke studies die genexpressie in 3T3-L1-cellen manipuleren, zich hebben gericht op adipocytendifferentiatie in plaats van op de adipocytenfunctie.
Lange tijd was de enige efficiënte techniek om adipocyten te transfecteren elektroporatie5, wat vervelend en duur is en celschade kan veroorzaken. Dit artikel rapporteert een omgekeerde transfectietechniek met behulp van een gemeenschappelijk transfectiereagens, dat de hands-on tijd voor transfectie vermindert, geen effect heeft op de levensvatbaarheid van cellen en veel goedkoper is dan elektroporatie. Dit protocol is perfect geschikt voor de transfectie van siRNA en andere oligonucleotiden zoals micro-RNA-mimics (miR-mimics) en anti-miRs. Het principe van het reverse-transfectieprotocol is om het transfectiereagens en de oligonucleotiden te incuberen om een complex in de celkweekplaat te vormen en vervolgens de volwassen adipocyten in de putten te zaaien. Vervolgens hechten de adipocyten zich opnieuw aan het aanhangen van het plaatoppervlak in aanwezigheid van het oligonucleotiden / transfectiereagenscomplex. Deze eenvoudige, efficiënte en goedkope methodologie maakt het mogelijk om de rol van eiwitcoderende RNA's en miRs in de adipocytenfunctie en hun potentiële rol bij obesitasgerelateerde ziekten te bestuderen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
OPMERKING: Gebruik steriele technieken om alle stappen van het protocol uit te voeren in een laminaire flowcelkweekkap. Zie tabel met materialen voor meer informatie over alle reagentia en apparatuur.
1. Differentiatie van murine 3T3-L1 fibroblasten in adipocyten
- Kweek de 3T3-L1 fibroblasten in 100 mm schotels in kweek medium-DMEM zonder pyruvaat, 25 mM glucose, 10% pasgeboren kalfsserum en 1% penicilline en streptomycine(Figuur 1A). Plaats de schalen in een weefselkweekincubator (7% CO2 en 37 °C).
- Verander twee dagen na confluentie het kweekmedium en vervang door DMEM zonder pyruvaat, 25 mM glucose, 10% foetaal kalfsserum (FCS) en 1% penicilline en streptomycine aangevuld met 0,25 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX), 0,25 μM dexamethason, 5 μg / ml insuline en 10 μM rosiglitazon.
OPMERKING: Het duurt 5 dagen om samenvloeiing te bereiken wanneer de cellen worden gezaaid bij 300.000 cellen per 100 mm schaal. - Vervang twee dagen later het kweekmedium door DMEM zonder pyruvaat, 25 mM glucose, 10% FCS en 1% penicilline en streptomycine aangevuld met 5 μg/ml insuline en 10 μM rosiglitazon en incubateer gedurende 2 dagen. Voed de cellen vervolgens om de 2 dagen met DMEM zonder pyruvaat, 25 mM glucose, 10% FCS en 1% penicilline en streptomycine(figuur 1B).
- Transfecteer de 3T3-L1 adipocyten 7-8 dagen na het begin van het differentiatieprotocol.
OPMERKING: Het is belangrijk om een hoog niveau van differentiatie (>80%) te bereiken vóór de transfectie om de proliferatie van de resterende fibroblasten na de transfectie te voorkomen, wat zou leiden tot een gemengde populatie van cellen die de resultaten zou kunnen vertekenen.
2. Bereiding van voorgecoate platen
- Bereid op de dag voor of enkele uren voor de transfectie een oplossing van collageen type I bij 100 μg/ml in 30% ethanol uit een stamoplossing van 1 mg/ml. Voeg 250 μL collageen toe per putje van een 12-putplaat en 125 μL per putje van een 24-putplaat en verdeel de oplossing over het oppervlak van de put.
- Laat de plaat zonder deksel onder de kweekkap totdat het collageen droogt. Tweemaal wassen met Dulbecco's fosfaat-gebufferde zoutoplossing (D-PBS).
OPMERKING: Voorgecoate platen zijn te koop.
3. Bereiding van het transfectiemengsel
OPMERKING: De uiteindelijke concentratie siRNA ligt tussen 1 en 100 nM (1 tot 100 pmol siRNA per put van een 12-well plaat). De uiteindelijke concentratie van de miR-nabootsing is 10 nM (10 pmol/put). Bepaal de beste concentratie van elk siRNA, miR-mimiek of ander oligonucleotide voordat het experiment wordt gestart om off-target effecten te voorkomen. Voer transfectie-experimenten uit in drievoud om statistische analyse van de resultaten te vergemakkelijken. Bereid alle reagentia in overmaat voor om rekening te houden met normaal verlies tijdens het pipetteren.
- Meng door pipetteren (volume/volume) het siRNA (of andere oligonucleotiden) met verbeterde Minimal Essential Medium(tabel 1). Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg het transfectiereagens en het verbeterde Minimal Essential Medium toe aan het siRNA en pipetteer om te mengen(tabel 1). Incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur (ga gedurende deze tijd verder naar sectie 4). Voeg de transfectiemix toe aan elk putje van de met collageen beklede plaat.
4. Bereiding van de 3T3-L1 adipocyten
- Was de cellen in de petrischaal van 100 mm tweemaal met D-PBS. Voeg 5x trypsine toe aan de cellen (1 ml per 100 mm schaal) en zorg ervoor dat je het hele oppervlak bedekt met de trypsine. Wacht op 30 s en verwijder voorzichtig de trypsine.
- Incubeer de petrischaal gedurende 5-10 minuten bij 37 °C in de couveuse. Tik op de 100 mm schaal om de cellen los te maken.
- Voeg 10 ml DMEM zonder pyruvaat, 25 mM glucose, 10% FCS en 1% penicilline en streptomycine toe om de trypsine te neutraliseren. Pipetteer het medium voorzichtig op en neer om de cellen los te maken en de celsuspensie te homogeniseren.
- Tel de cellen met behulp van een Malassez-telkamer of een geautomatiseerde celteller en pas de concentratie van de cellen aan op 6,25 x10 5 cellen / ml medium. Zaad 800 μL van de celsuspensie/put van een 12-putplaat (5 x 105 cellen) of 400 μl van de celsuspensie/put van een 24-putplaat (2,5 x 105 cellen) die het transfectiemengsel bevat.
OPMERKING: Een petrischaaltje van 100 mm met adipocyten maakt de bereiding van één 12-well-plaat of één 24-well-plaat mogelijk. Een schaal van 100 mm bevat meestal 6-7 x 106 adipocyten, wat overeenkomt met 5 x 105 adipocyten per put van een 12-well plaat. - Incubeer de platen in een celkweekincubator(7% CO 2 en 37 °C) en verstoor de cellen gedurende 24 uur niet. Vervang de volgende dag voorzichtig het supernatant door verse DMEM zonder pyruvaat, 25 mM glucose, 10% FCS en 1% penicilline en streptomycine.
OPMERKING: Het is ook mogelijk om de cellen in collageen-voorgecoate 48- en 96-well platen te zaaien, maar neem meer voorzorgsmaatregelen bij het vervangen van de media om loslating van de adipocyten te voorkomen.
5. Functionele analyse van getransfecteerde 3T3-L1 adipocyten
- Studie richt zich op knockdown 24-48 h en 48-96 h na siRNA of miR nabootsing voor respectievelijk mRNA en eiwit.
- Voer functionele analyses uit van getransfecteerde adipocyten om insulinesignalering, glucoseopname, adipokine-secretie, lipolyse en lipogenese te bestuderen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Met behulp van de hier beschreven procedure van omgekeerde transfectie om de expressie van eiwitten of micro-RNA's in 3T3-L1-adipocyten te moduleren, is aangetoond dat de adipocyten hun morfologie behouden na de transfectie (Figuur 1B,C). Inderdaad, 2 dagen na de transfectie waren de adipocyten goed verspreid en bevestigd aan de plaat en presenteerden multiloculaire lipidedruppels die kenmerkend zijn voor volwassen 3T3-L1-adipocyten. Het lipi...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dit artikel presenteert een gedetailleerd protocol voor de differentiatie en transfectie van volwassen adipocyten. Deze omgekeerde transfectiemethode is een eenvoudige, economische en zeer efficiënte methode om oligonucleotiden zoals, maar niet beperkt tot, siRNA's, micro-RNA-nabootsingen en anti-micro-RNA's te transfecteren in 3T3-L1-adipocyten, wat een van de moeilijkste cellijnen is om te transfecteren. Deze methode heeft enkele beperkingen waarmee rekening moet worden gehouden. Dit protocol is niet efficiënt voor tra...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door INSERM, de Université Côte d'Azur en het Franse Nationale Onderzoeksagentschap (ANR) via het programma Investments for the future Laboratory of Excellence (Labex SIGNALIFE-ANR-11-LABX-0028-01) en Initiative of Excellence (Idex UCAJEDI ANR-15-IDEX-0001). J.J. wordt ondersteund door subsidies van de Société Francophone du Diabète (SFD), de Association Française d'Etude et de Recherche sur l'Obésité (AFERO), het Institut Thématique Multi-Organismes Technologies pour la Santé (ITMO) en de Fondation Benjamin-Delessert. J.G. wordt ondersteund door ANR-18-CE14-0035-01. J-F.T. wordt ondersteund door ANR-subsidie ADIPOPIEZO-19-CE14-0029-01 en een subsidie van de Fondation pour la Recherche Médicale (Equipe FRM, DEQ20180839587). We danken ook de Imaging Core Facility van C3M, gefinancierd door de Conseil Départemental des Alpes-Maritimes en de Région PACA, die ook wordt ondersteund door het GIS IBiSA Microscopy and Imaging Platform Côte d'Azur (MICA).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 12 well Tissue Culture Plate | Dutscher | 353043 | |
| 2.5% Trypsin (10x) | Gibco | 15090-046 | verdund met D-PBS tot 5x |
| 2-Propanol | Sigma | I9516 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Accell Non-targeting Pool | Horizon Discovery | D-001910-10-05 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| Collagen type I from calf skin | Sigma-Aldrich | C8919 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D1756 | |
| D-PBS | Gibco | 14190144 | |
| Dulbecco's Modified Eagles's Medium (DMEM) | Gibco | 41965062 | 4.5 g/L D-Glucose; L-Glutamine; geen Pyruvaat |
| Ethanol | Sigma | 51976 | |
| FAM-labeled Negative Control si-RNA | Invitrogen | AM4620 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| Free Glycerol Reagent | Sigma-Aldrich | F6428 | |
| Glycerol Standard Solution | Sigma-Aldrich | G7793 | |
| HSP90 antibody | Santa Cruz | sc-131119 | Verdunning: 0,5 µg/mL |
| Improved Minimal Essential Medium (Opti-MEM) | Gibco | 31985-047 | |
| Insulin, Human Recombinant | Gibco | 12585-014 | |
| miRIDIAN micro-RNA mimics | Horizon Discovery | ||
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | |
| miScript II RT Kit | Qiagen | 218161 | |
| miScript Primer Assays Hs_RNU6-2_11 | Qiagen | MS00033740 | |
| miScript Primer Assays Mm_miR-34a_1 | Qiagen | MS00001428 | |
| miScript SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 219073 | |
| Newborn Calf Serum | Gibco | 16010-159 | |
| Oil Red O | Sigma | O0625 | |
| ON-TARGETplus Mouse Plin1 si-RNA SMARTpool | Horizon Discovery | L-056623-01-0005 | |
| Penicillin and Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Perilipin-1 antibody | Cell Signaling | 3470 | Verdunning: 1/1000 |
| Petri dish 100 mm x 20 mm | Dutscher | 353003 | |
| PKB antibody | Cell Signaling | 9272 | Verdunning: 1/1000 |
| PKB Phospho Thr308 antibody | Cell Signaling | 9275 | Verdunning: 1/1000 |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | |
| Transfection reagent (INTERFERin) | Polyplus | 409-10 | |
| α-tubulin antibody | Sigma aldrich | T6199 | Verdunning: 0,5 µg/mL |
| Vamp2 antibody | R&D Systems | MAB5136 | Verdunning: 0,1 µg/mL |
Referenties
- Klöting, N., et al. Insulin-sensitive obesity. American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 299 (3), 506-515 (2010).
- Weyer, C., Foley, J. E., Bogardus, C., Tataranni, P. A., Pratley, R. E. Enlarged subcutaneous abdominal adipocyte size, but not obesity itself, predicts type II diabetes independent of insulin resistance. Diabetologia. 43 (12), 1498-1506 (2000).
- Blüher, M. Adipose tissue dysfunction contributes to obesity related metabolic diseases. Best Practice & Research Clinical Endocrinology & Metabolism. 27 (2), 163-177 (2013).
- Lorente-Cebrián, S., González-Muniesa, P., Milagro, F. I., Martínez, J. A. MicroRNAs and other non-coding RNAs in adipose tissue and obesity: emerging roles as biomarkers and therapeutic targets. Clinical Science. 133 (1), 23-40 (2019).
- Jager, J., et al. Tpl2 kinase is upregulated in adipose tissue in obesity and may mediate interleukin-1beta and tumor necrosis factor-{alpha} effects on extracellular signal-regulated kinase activation and lipolysis. Diabetes. 59 (1), 61-70 (2010).
- Vergoni, B., et al. DNA damage and the activation of the p53 pathway mediate alterations in metabolic and secretory functions of adipocytes. Diabetes. 65 (10), 3062-3074 (2016).
- Berthou, F., et al. The Tpl2 kinase regulates the COX-2/prostaglandin E2 axis in adipocytes in inflammatory conditions. Molecular Endocrinology. 29 (7), 1025-1036 (2015).
- Ceppo, F., et al. Implication of the Tpl2 kinase in inflammatory changes and insulin resistance induced by the interaction between adipocytes and macrophages. Endocrinology. 155 (3), 951-964 (2014).
- Jager, J., Grémeaux, T., Cormont, M., Le Marchand-Brustel, Y., Tanti, J. -F. Interleukin-1beta-induced insulin resistance in adipocytes through down-regulation of insulin receptor substrate-1 expression. Endocrinology. 148 (1), 241-251 (2007).
- Jager, J., et al. Tpl2 kinase is upregulated in adipose tissue in obesity and may mediate interleukin-1beta and tumor necrosis factor-{alpha} effects on extracellular signal-regulated kinase activation and lipolysis. Diabetes. 59 (1), 61-70 (2010).
- Hart, M., et al. miR-34a as hub of T cell regulation networks. Journal of ImmunoTherapy of Cancer. 7, 187(2019).
- Brandenburger, T., et al. MiR-34a is differentially expressed in dorsal root ganglia in a rat model of chronic neuropathic pain. Neuroscience Letters. 708, 134365(2019).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
