Dit artikel biedt drie eenvoudige en toegankelijke testen voor het beoordelen van het lipidemetabolisme bij muizen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Beoordeling van de lipidenbehandelingscapaciteit van het hele lichaam bij muizen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Het beoordelen van lipidemetabolisme is een hoeksteen van het evalueren van de metabole functie en wordt als essentieel beschouwd voor in vivo metabolismestudies. Lipiden zijn een klasse van veel verschillende moleculen met veel routes die betrokken zijn bij hun synthese en metabolisme. Een startpunt voor het evalueren van lipide hemostase voor onderzoek naar voeding en obesitas is nodig. Dit artikel beschrijft drie eenvoudige en toegankelijke methoden die weinig expertise of oefening vereisen om onder de knie te krijgen, en die door de meeste laboratoria kunnen worden aangepast om te screenen op lipidemetabolismeafwijkingen bij muizen. Deze methoden zijn (1) het meten van verschillende nuchtere serumlipidemoleculen met behulp van commerciële kits (2) het testen van het lipidenverwerkingsvermogen in de voeding door middel van een orale intralipidetolerantietest en (3) het evalueren van de respons op een farmaceutische verbinding, CL 316.243, bij muizen. Samen zullen deze methoden een overzicht op hoog niveau bieden van het vermogen om lipiden bij muizen te hanteren.
Inleiding
Koolhydraten en lipiden zijn twee belangrijke substraten voor het energiemetabolisme. Afwijkend lipidenmetabolisme resulteert in veel menselijke ziekten, waaronder diabetes type II, hart- en vaatziekten, leververvetting en kankers. Voedingslipiden, voornamelijk triglyceriden, worden via de darm in het lymfestelsel opgenomen en komen in de veneuze circulatie in chylomicronen in de buurt van het hart1. Lipiden worden gedragen door lipoproteïnedeeltjes in de bloedbaan, waar de vetzuurmoieties worden geschonden door de werking van lipoproteïnelipase bij perifere organen zoals spieren en vetweefsel2. De resterende cholesterolrijke restdeeltjes worden door de lever opgeruimd3. Muizen zijn op grote schaal gebruikt in laboratoria als een onderzoeksmodel om het lipidenmetabolisme te bestuderen. Met uitgebreide genetische toolsets beschikbaar en een relatief korte fokcyclus, zijn ze een krachtig model voor het bestuderen van hoe lipiden worden geabsorbeerd, gesynthetiseerd en gemetaboliseerd.
Vanwege de complexiteit van het lipidenmetabolisme worden geavanceerde lipidomics-studies of isotopische tracerstudies meestal gebruikt om verzamelingen lipidesoorten of lipidegerelateerde metabole fluxen en lotgevallen te kwantificeren4,5. Dit creëert een enorme uitdaging voor onderzoekers zonder gespecialiseerde apparatuur of expertise. In dit artikel presenteren we drie assays die kunnen dienen als eerste tests voordat technisch uitdagende technieken worden gebruikt. Het zijn niet-terminale procedures voor de muizen en dus zeer nuttig voor het identificeren van potentiële verschillen in lipidenbehandelingscapaciteit en het beperken van de getroffen processen.
Ten eerste kan het meten van nuchtere serumlipidemoleculen helpen om het algehele lipidenprofiel van een muis vast te stellen. Muizen moeten worden vasten, omdat veel lipidesoorten na de maaltijd stijgen en de omvang van de toename sterk wordt beïnvloed door de samenstelling van het dieet. Veel lipidemoleculen, waaronder totaal cholesterol, triglyceride en niet-veresterd vetzuur (NEFA), kunnen worden gemeten met behulp van een commerciële kit en een plaatlezer die absorptie kan lezen.
Ten tweede evalueert een orale intralipide tolerantietest het lipidenbehandelingsvermogen als een netto-effect van absorptie en metabolisme. Een oraal toegediende intralipide veroorzaakt een piek in circulerende triglycerideniveaus (1-2 uur), waarna de serumtriglyceridenspiegels terugkeren naar basale niveaus (4-6 uur). Deze test biedt informatie over hoe goed een muis de exogene lipiden aankan. Hart, lever en bruin vetweefsel zijn actieve consumenten van triglyceriden, terwijl wit vetweefsel het opslaat als een energiereserve. Veranderingen in deze functies zullen leiden tot verschillen in de testresultaten.
Ten slotte wordt het bevorderen van lipolyse om opgeslagen lipiden te mobiliseren beschouwd als een mogelijke strategie voor gewichtsverlies. De β3-adrenerge receptorsignaleringsroute in het vetweefsel speelt een belangrijke rol bij adipocytenlipyse en de menselijke genetica heeft een functieverlies polymorfisme Trp64Arg geïdentificeerd in β3-adrenerge receptor gecorreleerd met obesitas6. CL 316.243, een specifieke en krachtige β3-adrenerge receptoragonist, stimuleert vetweefsel lipolyse en de afgifte van glycerol. Evaluatie van de reactie van een muis op CL 316.243 kan waardevolle informatie opleveren over de ontwikkeling, verbetering en begrip van de werkzaamheid van de verbinding.
Gezamenlijk kunnen deze tests worden gebruikt als een eerste scherm voor veranderingen in de lipide metabolische toestand van muizen. Ze zijn gekozen vanwege de toegankelijkheid van de instrumenten en reagentia. Met de resultaten van deze testen kunnen onderzoekers zich een algemeen beeld vormen van de metabole fitheid van hun dieren en beslissen over meer geavanceerde en gerichte benaderingen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Dieren worden gehuisvest in gestandaardiseerde omstandigheden volgens dierverzorgings- en experimentele protocollen die zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van het Baylor College of Medicine (BCM). Dieren krijgen een standaard of speciaal dieet, water ad libitum, en worden gehouden met een dag / nachtcyclus van 12 uur.
1. Meting van nuchtere serumlipiden
- Breng muizen over naar een nieuwe kooi na 17.00 uur en snel met vrije toegang tot water, 's nachts (met ongeveer 16 uur vasten vóór het experiment). Het nachtelijke vasten zorgt voor een volledige lediging van het maagdarmkanaal van de muizen.
OPMERKING: Muizen eten hun uitwerpselen tijdens het vasten, dus voedselontwenning kan er niet voor zorgen dat ze voldoende vasten. - Pak de volgende ochtend de muis bij de staart en plaats hem op een oppervlak. Trek voorzichtig terug aan de staart van de muis om de muis in de fixator te plaatsen. Plaats de neussteun om de beweging van de muis opnieuw te trainen terwijl u de muis nog steeds laat ademen. Draai de knop van de neussteun vast. Controleer borstbewegingen om ervoor te zorgen dat het dier normaal ademt en minimaliseer de tijd die een muis doorbrengt in fixatoren.
- Maak een oppervlakkige incisie (nick) in de staartader van de vrij bewegende muis en trek 25 μL bloed uit de incisie in een glazen capillair (dat ongeveer 1/3 van het capillair vult) zonder de muis te beperken. Blaas het bloed snel in een microcentrifugebuis.
- Stop het bloeden met behulp van styptische poeders, vul het voer in de kooi bij en zorg ervoor dat de muizen geen tekenen van stress vertonen.
- Voltooi de bloedonttrekking voor alle muizen.
- Laat het bloed stollen door het 1 uur ongestoord op kamertemperatuur te laten. Draai de gestolde bloedmonsters bij 2.000 x g bij 4 °C gedurende 10 minuten in een gekoelde benchtop microcentrifuge en breng supernatant (serum) over voor analyse.
OPMERKING: Serum kan gedurende enkele weken tot analyse worden bewaard bij –20 °C. Houd het serum voor langdurige opslag op –70°C. - Analyseer elke lipidemetaboliet met behulp van het door de fabrikant geleverde protocol.
2. Orale intralipid tolerantietest
- Weeg na 17.00 uur de muizen voor de berekening van het intralipidevolume dat hen de volgende dag moet worden gegeven. Breng de muizen vervolgens over in een nieuwe kooi en vast ze 's nachts (16 uur).
- Markeer de volgende ochtend de staarten van de muizen die in één kooi zijn gehuisvest om ze te helpen identificeren in de daaropvolgende bloedstappen.
- Maak een inkeping in de staartader en trek 15 μL bloed uit de incisie in een glazen capillair (vult ongeveer 1/5 van het capillair) en blaas het bloed snel in een microcentrifugebuis voor T = 0 serum.
OPMERKING: Het is niet nodig om het bloeden tijdens de test te stoppen, tenzij de muizen een teveel aan bloeding vertonen. - Gavage muizen 20% intralipid met behulp van een 18G gavage naald in een verhouding van 15 μl per gram lichaamsgewicht, met behulp van het pre-nuchtere lichaamsgewicht. Stapel elke muis met 1 minuut.
OPMERKING: Weeg het dier en bepaal de juiste naaldgrootte van de maagsonde. Over het algemeen is een 18 gauge gavage naald geschikt voor muizen >25 g, en een 20-22 gauge gavage naald zou meer geschikt zijn voor kleinere dieren. Krab de muis en grijp de huid over de schouders om het hoofd van het dier op zijn plaats te houden. Plaats de maagsondeaald in de mond en ga dan voorzichtig langs het bovenste gehemelte, totdat de slokdarm is bereikt. De buis moet zonder weerstand passeren. Zodra de juiste diepte is bereikt, kan de Intralipid langzaam worden toegediend. Verwijder de naald voorzichtig onder dezelfde hoek tijdens het inbrengen van de naald na toediening van de Intralipid. Breng het dier terug naar de kooi en controleer op tekenen van moeizame ademhaling of ander leed.
OPMERKING: Onderzoekers die onervaren zijn met orale maagsonde- of staartbloedingstechnieken kunnen elke muis met 2 minuten of zelfs langer stapelen. - Trek bloed af bij T = 1, 2, 3, 4, 5 en 6 uur: Trek 15 μL bloed (1/5 capillair) per muis door staartbloedingen en blaas het bloed snel in een microcentrifugebuis.
- Spin de bloedmonsters met 2.000 x g bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten in een microcentrifuge. Breng het supernatant, inclusief de drijvende vetlaag, over naar een PCR-buis voor opslag. Het supernatant kan tot de analyse enkele weken bij –20 °C worden bewaard.
OPMERKING: Het supernatant moet plasma zijn. Als sommige monsters al zijn gestlonterd tegen de tijd van centrifugeren, heeft dit geen invloed op de triglyceridemeting. - Stop na de laatste bloedafname het bloeden met behulp van styptische poeders, vul het voer in de kooi opnieuw en zorg ervoor dat de muizen geen tekenen van extreme stress vertonen.
- Laad 2 μL triglyceride standaard en verzamelde supernatanten in een 96-well plaat.
- Voeg 200 μL triglyceridenreagens toe en laat de plaat 5 minuten incuberen bij 37 °C voor kleurontwikkeling.
- Meet de absorptie bij 500 nm met een referentiegolflengte van 660 nm in een laboratoriumplaatlezer en bereken de concentratie van het monster.
3. β3 Adrenerge receptoragonist CL 316.243 Gestimuleerde lipolysetest
- Bereid CL 316,243 als een standaardoplossing van 5 mg/ml (50x) in steriele zoutoplossing en bewaar bij –20°C tot gebruik.
- Weeg 's ochtends de muizen om de hoeveelheid verdunde CL 316.243-oplossing te berekenen die nodig is voor het experiment. De muis krijgt 10 μL per gram lichaamsgewicht verdunde CL 316.243, voor een einddosis van 1 mg/kg lichaamsgewicht.
- Breng de muizen over in een nieuwe kooi met vrije toegang tot water en vast ze gedurende 4 uur.
- Maak voldoende 1x CL 316.243 oplossing uit 50x bouillon met zoutoplossing. De uiteindelijke concentratie van 1x CL 316,243 oplossing is 0,1 mg/ml. Gebruik zoutoplossing voor de controlebehandelingsgroep.
- Markeer de staarten van de muizen die zich in dezelfde kooi bevinden voor eenvoudige identificatie tijdens de bloedstappen.
- Maak een inkeping in de staartader en trek 15 μL bloed uit de incisie in een glazen capillair (vult ongeveer 1/5 van het capillair) en blaas het bloed snel in een microcentrifugebuis voor T = 0 monster.
OPMERKING: Het is niet nodig om het bloeden tijdens de test te stoppen, tenzij de muizen een teveel aan bloeding vertonen. - Injecteer verdunde CL 316.243 oplossing (of controle indien opgenomen in het experiment) intraperitoneaal bij een volume van 10 μL/g lichaamsgewicht. Stapel elke muis met 1 minuut. Gebruik maximaal 5 muizen voor elk experiment van 60 minuten, of 10 muizen voor een team van twee personen.
- Bloed afnemen bij T = 5, 15, 30, 60 minuten: trek 15 μL bloed (1/5 capillair) per muis door middel van staartbloedingen.
- Stop na de laatste bloedafname het bloeden met behulp van styptische poeders, vul het voer in de kooi opnieuw en zorg ervoor dat de muizen geen tekenen van extreme stress vertonen.
- Spin bloedmonsters bij 2.000 x g bij 4 °C gedurende 5 minuten in een gekoelde microcentrifuge. Breng het supernatant over naar een PCR-buis voor opslag. Het supernatant kan enkele weken tot analyse bij –20°C worden bewaard.
- Laad 1 μL van 2x serieel verdunde glycerolstandaarden (0,156, 0,312, 0,625, 1,25 en 2,5 mg/ml Trioleïne-equivalente concentraties) en verzamelde supernatanten in een 96-well plaat. Voeg 100 μL vrij glycerolreagens toe en laat de plaat gedurende 5 minuten bij 37 °C incuberen om de kleur te ontwikkelen.
- Meet de absorptie bij 540 nm met behulp van een laboratoriumplaatlezer en bereken de concentratie van het monster.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
We laten met drie fragmenten zien dat elke test waardevolle informatie biedt over het lipidenmetabolisme van de muizen. Voor C57BL / 6J mannelijke muizen, uitgedaagd door acht weken vetrijk dieet (HFD) voeding vanaf acht weken oud, waren de totale cholesterolwaarden significant verhoogd, terwijl serumtriglyyceride en NEFA dat niet waren(tabel 1),wat suggereert dat triglyceride en NEFA in het bloed niet overwegend worden gereguleerd door een vetuitdaging in de voeding. In het tweede cohort muizen kregen C...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De drie beschreven testen functioneren robuust in het lab, met een paar kritische overwegingen. 's Nachts vasten is vereist voor het bepalen van nuchtere serumlipidespiegels en orale intralipidtolerantietest. Voor orale intralipid tolerantietest is het van cruciaal belang om het bloed bij kamertemperatuur te laten draaien om de vorming van een vetlaag te minimaliseren, vooral op de tijdstippen van 1 en 2 uur; het is belangrijk om deze vetlaag niet weg te gooien als deze zich vormt. Zorg ervoor dat u het supernatant overb...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk wordt ondersteund door de National Institutes of Health (NIH), subsidie R00-DK114498, en het Amerikaanse ministerie van Landbouw (USDA), subsidie CRIS: 3092-51000-062 aan Y. Z.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 20% Intralipid | Sigma Aldrich | I141 | |
| BD Slip Tip Sterile Syringes 1ml | Shaotong | B07F1KRMYN | |
| CL 316,243 Hydrate | Sigma-Aldrich | C5976 | |
| Curved Feeding Needles (18 Gauge) | Kent Scientific | FNC-18-2-2 | |
| Free Glycerol Reagent | Sigma Aldrich | F6428 | |
| Glycerol Standard Solution | Sigma | G7793 | |
| HR SERIES NEFA-HR(2)COLOR REAGENT A | Fujifilm Wako Diagnostics | 999-34691 | |
| HR SERIES NEFA-HR(2)COLOR REAGENT B | Fujifilm Wako Diagnostics | 991-34891 | |
| HR SERIES NEFA-HR(2)SOLVENT A | Fujifilm Wako Diagnostics | 995-34791 | |
| HR SERIES NEFA-HR(2)SOLVENT B | Fujifilm Wako Diagnostics | 993-35191 | |
| Matrix Plus Chemistry Reference Kit | Verichem | 9500 | |
| Micro Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-222-168 | |
| Microhematrocrit Capillary Tube, Not Heparanized | Fisher Scientific | 22-362-574 | |
| NEFA STANDARD SOLUTION | Fujifilm Wako Diagnostics | 276-76491 | |
| Phosphate Buffered Saline | Boston Bioproducts | BM-220 | |
| Thermo Scientific Triglycerides Reagent | Fisher Scientific | TR22421 | |
| Total Cholesterol Reagents | Thermo Scientifi | TR13421 |
Referenties
- Dixon, J. B. Mechanisms of chylomicron uptake into lacteals. Annals of the New York Academy of Sciences. 1207, Suppl 1 52-57 (2010).
- Nuno, J., de Oya, M. Lipoprotein lipase: review. Revista Clínica Española. 170 (3-4), 83-87 (1983).
- Williams, K. J. Molecular processes that handle -- and mishandle -- dietary lipids. Journal of Clinical Investigation. 118 (10), 3247-3259 (2008).
- Burla, B., et al. MS-based lipidomics of human blood plasma: a community-initiated position paper to develop accepted guidelines. Journal of Lipid Research. 59 (10), 2001-2017 (2018).
- Umpleby, A. M. Hormone measurement guidelines: Tracing lipid metabolism: the value of stable isotopes. Journal of Endocrinology. 226 (3), 1-10 (2015).
- Mitchell, B. D., et al. A paired sibling analysis of the beta-3 adrenergic receptor and obesity in Mexican Americans. Journal of Clinical Investigation. 101 (3), 584-587 (1998).
- Mahoney, L. B., Denny, C. A., Seyfried, T. N. Caloric restriction in C57BL/6J mice mimics therapeutic fasting in humans. Lipids in Health and Disease. 5, 13(2006).
- Hayek, T., et al. Dietary fat increases high density lipoprotein (HDL) levels both by increasing the transport rates and decreasing the fractional catabolic rates of HDL cholesterol ester and apolipoprotein (Apo) A-I. Presentation of a new animal model and mechanistic studies in human Apo A-I transgenic and control mice. Journal of Clinical Investigation. 91 (4), 1665-1671 (1993).
- Hogarth, C. A., Roy, A., Ebert, D. L. Genomic evidence for the absence of a functional cholesteryl ester transfer protein gene in mice and rats. Comparative Biochemistry and Physiology - Part B: Biochemistry & Molecular Biology. 135 (2), 219-229 (2003).
- Tall, A. R. Functions of cholesterol ester transfer protein and relationship to coronary artery disease risk. Journal of Clinical Lipidology. 4 (5), 389-393 (2010).
- Singh, A. K., Singh, R. Triglyceride and cardiovascular risk: A critical appraisal. Indian Journal of Endocrinology and Metabolism. 20 (4), 418-428 (2016).
- Miller, M., et al. Triglycerides and cardiovascular disease: a scientific statement from the American Heart Association. Circulation. 123 (20), 2292-2333 (2011).
- Dron, J. S., Hegele, R. A. Genetics of Hypertriglyceridemia. Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 11, 455(2020).
- Dole, V. P. A relation between non-esterified fatty acids in plasma and the metabolism of glucose. Journal of Clinical Investigation. 35 (2), 150-154 (1956).
- Bartelt, A., et al. Brown adipose tissue activity controls triglyceride clearance. Nature Medicine. 17 (2), 200-205 (2011).
- de Souza, C. J., Burkey, B. F. Beta 3-adrenoceptor agonists as anti-diabetic and anti-obesity drugs in humans. Current Pharmaceutical Design. 7 (14), 1433-1449 (2001).
- Braun, K., Oeckl, J., Westermeier, J., Li, Y., Klingenspor, M. Non-adrenergic control of lipolysis and thermogenesis in adipose tissues. Journal of Experimental Biology. 221, Pt Suppl 1 (2018).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
