Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Synthese van pH-afhankelijke pyrazol, imidazol en isoindodondiyrrinonefluoroforen met behulp van een Claisen-Schmidt condensatiebenadering

5.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/61944

⸱

10 juni 2021

 ,  , 
1Department of Physical and Life Sciences, Nevada State College, 2Department of Humanities, Nevada State College

In dit artikel

Samenvatting

De Claisen-Schmidt condensatiereactie is een belangrijke methodiek voor het genereren van methine-overbrugde geconjugeerde bicyclische aromatische verbindingen. Door gebruik te maken van een basisgemedieerde variant van de aldolreactie, kan een reeks fluorescerende en/of biologisch relevante moleculen toegankelijk zijn via een over het algemeen goedkope en operationeel eenvoudige synthetische aanpak.

Samenvatting

Methine-overbrugde geconjugeerde bicyclische aromatische verbindingen zijn gemeenschappelijke bestanddelen van een reeks biologisch relevante moleculen zoals porfyrines, dipyrrinonen en geneesmiddelen. Bovendien resulteert beperkte rotatie van deze systemen vaak in sterk tot matig fluorescerende systemen zoals waargenomen in 3H,5H-dipyrrolo[1,2-c:2',1'-f]pyrimidin-3-ones, xanthoglows, pyrroloindolizinedione analogen, BODIPY analogen, en de fenolische en imidazolinone ringsystemen van Green Fluorescent Protein (GFP). Dit manuscript beschrijft een goedkope en operationeel eenvoudige methode om een Claisen-Schmidt condensatie uit te voeren om een reeks fluorescerende pH-afhankelijke pyrazol/imidazol/isoindolon dipyrrinone analogen te genereren. Hoewel de methodologie de synthese van dipyrrinone-analogen illustreert, kan het worden vertaald om een breed scala aan geconjugeerde bicyclische aromatische verbindingen te produceren. De claisen-schmidtcondensatiereactie die bij deze methode wordt gebruikt, is beperkt tot nucleofielen en elektrofielen die onder basisomstandigheden (nucleofiele component) en niet-enolizeerbare aldehyden (elektrofiele component) kunnen worden geëvervandeerd. Bovendien moeten zowel de nucleofiele als de elektrofiele reactanten functionele groepen bevatten die niet per ongeluk met hydroxide zullen reageren. Ondanks deze beperkingen biedt deze methodologie toegang tot volledig nieuwe systemen die kunnen worden gebruikt als biologische of moleculaire sondes.

Inleiding

Een aantal geconjugeerde bicyclische systemen, waarbij twee aromatische ringen met elkaar verbonden zijn door een monomethinebrug, ondergaan isomerisatie via bindingsrotatie, wanneer opgewekt met een foton (Figuur 1A)1,2,3,4,5. Het opgewonden isomeer zal over het algemeen ontspannen tot de grondtoestand door niet-radiatieve vervalprocessen6. Als de energiebarrière voor bindingsrotatie voldoende wordt verhoogd, is het mogelijk om de fotoisomerisatie te beperken of te voorkomen. In plaats daarvan resulteert fotonische excitatie in een opgewonden singlettoestand die vaak ontspant via fluorescentie in plaats van niet-radiatief verval (Figuur 1B). Het beperken van fotoisomerisatie wordt meestal bereikt door de bindingsrotatie mechanisch te beperken door de twee aromatische ringsystemen te binden door covalente verbindingen, waardoor het molecuul in een bepaalde isomeertoestand wordt vergrendeld. Deze benadering is gebruikt om verschillende fluorescerende tricyclische dipyrrinone en dipyrrolemethane analogen te creëren, zoals: 3H,5H-dipyrrolo[1,2-c:2',1'-f]pyrimidin-3-ones (1), xanthoglows (2)6,7, pyrroloindolizinedione analogen( 3)8, en BODIPY carbonyl, of boordifluore linkers. Typisch, 1-4 bezitten ΦF > 0.7 suggererend deze systemen zeer efficiënt als fluorofooreenheden zijn.

Het is ook mogelijk om fotoisomerisatie te beperken door middel van andere middelen dan het covalent verbinden van de ringsystemen. De fenolische en imidazolinone ringen (figuur 2) van Green Fluorescent Protein (GFP) zijn bijvoorbeeld beperkt tot rotatie door de eiwitomgeving; de beperkende instelling verhoogt de kwantumopbrengst met drie ordes van grootte in vergelijking met dezelfde chromofooreenheid in vrije oplossing10. Er wordt aangenomen dat de eiwitsteiger van GFP een rotatiebarrière biedt door sterische en elektrostatische effecten11. Onlangs ontdekte onze groep in samenwerking met de Odoh-groep aan de Universiteit van Nevada, Reno een ander fluorofoorsysteem dat structurele gelijkenis vertoont met de op dipyrrinone gebaseerde xanthoglow-systemen (Figuur 2)12. Deze dipyrrinone-analogen verschillen echter van het xanthoglow-systeem in die tijd dat intramoleculaire waterstofbindingen, in plaats van covalente bindingen, fotoisomerisatie ontmoedigen en resulteren in een fluorescerend bicyclisch systeem. Bovendien kunnen de pyrazol-, imidazol- en isoindolondiprorinone-analogen waterstofbinding in geprotoneerde en gedeprotoneerde toestanden; deprotonatie resulteert in de roodverschuiving van zowel de excitatie- als de emissiegolflengten, waarschijnlijk als gevolg van een verandering in de elektronische aard van het systeem. Hoewel er is gemeld dat waterstofbinding de kwantumopbrengsten verhoogt, hoewel beperkte rotatie13,14,15,16, zijn we ons niet bewust van enig ander fluorofoorsysteem waarin beperkte isomeer als fluorescentiewijze dient in zowel geprotoneerde als gedeprotoneerde toestanden van het molecuul. Daarom zijn deze pH-afhankelijke dipyrrinonefluoroforen in dat opzicht uniek.

In deze video richten we ons op de synthese en chemische karakterisering van de fluorescerende dipyrrinone analoge serie. In het bijzonder wordt de nadruk gelegd op de Claisen-Schmidt condensatiemethode die werd gebruikt om de complete serie fluorescerende analogen te construeren. Deze reactie is gebaseerd op de generatie van een basisgemedieerd vinylogous enolaation dat een aldehydegroep aanvalt, om een alcohol te produceren die vervolgens wordt geëlimineerd. Voor de analoge difthrrinonereeks wordt een pyrrolinon/isoindolon omgezet in een enolaat om een aanval op een aldehydegroep die aan een pyrazol- of imidazolring is bevestigd, te vergemakkelijken (figuur 3); na eliminatie wordt een volledig geconjugeerd bicyclisch systeem gevormd, verbonden door een methinebrug. Het is opmerkelijk dat de hele serie dipyrrinone-analogen kan worden gemaakt van direct beschikbare commerciële materialen en kan worden geproduceerd in een enkele eenpotreactiesequentie, meestal in matige tot hoge opbrengsten (opbrengsten variëren van ongeveer 50-95%). Aangezien de meeste dipyrrinone-analogen zeer kristallijn van aard zijn, is er zeer weinig zuivering buiten de standaard workup-omstandigheden nodig om analytisch zuivere monsters te produceren. Bijgevolg vereist dit fluorofoorsysteem slechts een paar stappen om toegang te krijgen tot direct beschikbare commerciële materialen en kan het in relatief korte tijd worden gesynthetiseerd, gezuiverd en voorbereid voor analytische of biologische studies.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Algemene procedure voor de synthese van Dipyrrinone-analogen 16-25

  1. Los pyrrolinon/isoindolon (1,00 mmol) en de overeenkomstige pyrazol/imidazolaldehyde (1,00 mmol) op in 5,0 ml ethanol in een kolf met ronde bodem.
  2. Voeg waterige KOH (24,0 mmol, 10 M, 2,40 ml) in één portie toe aan de kolf.
  3. Roer en reflux het mengsel totdat de reactie is voltooid door TLC (zie tabel 1 voor een lijst met reactietijden). Er werd een TLC-eluent van 10% methanol in dichloormethaan gebruikt en de analogen werden waargenomen om Rf-waarden te bezitten in of rond het bereik van 0,62 tot 0,86. Breng voldoende vacuümvet aan of gebruik een PTFE-huls aan de interfase van glasverbindingen om te voorkomen dat het glas van de condensor en de kolf met ronde bodem onder hoge temperaturen en basisomstandigheden in beslag worden nemen.
  4. Laat het reactiemengsel afkoelen tot kamertemperatuur en verdampt vluchtige stoffen onder verminderde druk met behulp van een roterende verdamper.
  5. Koel het reactiemengsel af tot 0 °C met behulp van een ijsbad.
  6. Neutraliseer het resterende olieachtige mengsel door azijnzuur (30,0 mmol, 1,70 ml) in één portie toe te voegen.
  7. Zuiver het resulterende productmateriaal met vacuümfiltratie (zie stap 2a, voor verbindingen: 17, 18, 20-22, 24 en 25) of gebruik vloeistof-vloeistofextractie/kolomchromatografie (zie stap 2b, voor verbindingen: 16, 19en 23).

2. Procedure Zuivering

  1. via vacuümfiltratie
    1. Plaats een Hirsch trechter in een zijarmkolf met behulp van een gemonteerde rubberen adapter.
    2. Breng een stuk rond filterpapier aan op de Hirsch-trechter en licht nat met gedeioneerd water om de trechter te kunnen vasthouden.
    3. Sluit een vacuümbron aan op de zijarm van de kolf en zorg ervoor dat er voldoende vacuümafdichting is door ervoor te zorgen dat geen van het glaswerk uit elkaar kan worden getrokken terwijl u onder vacuüm staat.
    4. Giet de kolf met het gekristalliseerde product over het vacuümfilter en laat filteren. Spoel de kristallen af met 10 ml ijskoud gedeioneerd water.
    5. Laat de gefilterde kristallen op het filterpapier blijven drogen, terwijl ze nog steeds verbonden zijn met de vacuümbron, na de filtratie van alle vloeistoffen.
    6. Verzamel de gefilterde kristallen en plaats ze in een kolf met ronde bodem van 25 ml.
    7. Bevestig de kolf met ronde bodem aan een gemalen glasverbinding/vacuümleidingadapter. Bevestig de glazen voegverbinding met een keck-clip.
    8. Bevestig aan het geribbelde uiteinde van de glashoge vacuümlijnadapter een vacuümleiding die naar een hoge vacuümpomp wordt gerouteerd en koel een vacuümvanger (met behulp van koelmiddel zoals vloeibare stikstof of droogijs/aceton) om vluchtige materialen te condenseren die uit het kristallijne materiaal kunnen verdampen. Schakel de hoogvacuümpomp in om volledige verdamping van eventuele sporen van overgebleven oplosmiddel uit de kristallen te garanderen.
    9. Laat de kristallen minimaal 1 uur drogen onder hoog vacuüm. Verwijder de kolf met ronde bodem van de vacuümleiding/adapter, schakel de hoge vacuümpomp uit en maak de vacuümvanger schoon.
  2. Procedure Zuivering via Kolomchromatografie
    1. Verdun de inhoud van het met azijnzuur behandelde reactiemengsel (vanaf stap 1.6) met 10 ml gedeioneerd water en breng het over in een afscheidingstrechter. Voeg 10 ml dichloormethaan toe aan de afscheidingstrechter. Schud en ontlucht de afscheidingstrechter voorzichtig om de twee lagen te scheiden.
    2. Extraheer de waterige laag met behulp van volgende porties dichloormethaan (3 x 5 ml). Combineer de organische fracties en droog met watervrij Na2SO4. Decanteer en verwijder alle vluchtige stoffen onder verminderde druk met behulp van een roterende verdamper.
    3. Verdun het residu verkregen uit stap 2.2.2. met 5 ml CH2Cl2. Voer flitskolomchromatografie uit met ongeveer 75 g silicagel. Elute het monster met een oplossing van 10% methanol in dichloormethaan.
    4. Verwijder de verzamelde fracties oplosmiddel onder verminderde druk met behulp van een roterende verdamper. Breng het vaste residu over in een kolf met ronde bodem van 25 ml met ongeveer 10 ml CH2Cl2. Verwijder het oplosmiddel onder verminderde druk met behulp van een roterende verdamper.
    5. Droog de resterende vaste resten onder hoog vacuüm zoals eerder beschreven in stap 2.1.7 - 2.1.9.

3. Molaire absorptiviteit acquisitie en UV / Vis pKa studies voor analogen 16-25

  1. Maak samengestelde voorraadoplossingen voor UV/Vis Spectrofotometrie voor analogen 16 - 25.
    1. Weeg 10 μmol van de geselecteerde dipyrrinone analoog (16 - 25) af en voeg deze toe aan een maatkolf van 10 ml.
    2. Voeg DMSO toe aan de 10,0 ml markering op de volumetrische kolf.
      OPMERKING: Als de verbinding niet volledig oplost, verwarmt u de kolf met behulp van een warmtepistool en roert u de kolf indien nodig om de verbinding volledig op te lossen.
  2. Maak fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) op verschillende pH-niveaus. De analogen werden gekarakteriseerd in PBS-buffers variërend in pH van ongeveer 4 tot 15.
    1. Maak met behulp van een volumetrische cilinder van 1 L PBS-voorraadoplossing 1 L door 100 ml PBS (x100) in 900 ml gedeioneerd water te verdunnen.
    2. Breng 50 ml van de bereide PBS-voorraadoplossing (stap 3.2.1) over naar een bekerglas van 100 ml en voeg een magnetische roerstaaf toe. Gebruik vervolgens een gekalibreerde pH-meter om veranderingen in de pH te controleren en titreer de PBS-buffer met een waterige 1,0 M NaOH (om buffers met pH > 7,0) of 1,0 M HCl te verkrijgen (om buffers met pH < 7,0 te verkrijgen).
      OPMERKING: Om gegevens te verkrijgen die resulteren in een goed gedefinieerde titratiecurve, raden we aan pH-buffers te genereren in stappen van 0,1 pH-eenheden binnen ± 0,5 van het verwachte punt van buiging en stappen van 0,5 buiten het verwachte punt van verbuiging.
  3. Verkrijg molaire absorptiviteitsspectra voor analogen 16 - 25 in PBS (pH 7,0) en 1,0 M NaOH (pH 14,0) oplossingen.
    1. Bereid een "blanco" met een schone en droge kwarts cuvette en voeg vervolgens 2,0 ml PBS-stamoplossing (pH 7,0) of waterige 1,0 M NaOH toe aan de cuvette met behulp van een micropipet van 100 - 1000 μL.
      OPMERKING: Het is belangrijk voor de integriteit van het blanco proces voor het verzamelen van gegevens over de oplossing om ervoor te zorgen dat er geen luchtbellen in de cuvette-oplossing zitten en om de zijkanten van de cuvette grondig af te vegen met een Kim-doekje om lichtverstrooiing als gevolg van stof of vuil aan de buitenkant van de cuvette te voorkomen. Als de bubbels aanhouden, tikt u voorzichtig en herhaaldelijk op de cuvette op een papieren handdoek die op een harde ondergrond is gelegd.
    2. Maak met behulp van een UV/Vis spectrofotometer de geselecteerde oplossing leeg voor een bereik van 200 - 800 nm.
    3. Voeg in een tweede schone en droge kwarts cuvette 2,00 ml PBS (pH 7,0) of 1,0 M NaOH (pH 14) toe, gevolgd door 10 μL van de dipyrrinone analoge (16 - 25) stamoplossing (zie stap 3.1) met een 5-50 μL micropipet. Plaats een dop op de cuvette en schud goed naast het omkeren van de cuvette.
      OPMERKING: Het is belangrijk voor de integriteit van het proces voor het verzamelen van gegevens van de monsteroplossing om ervoor te zorgen dat er geen luchtbellen in de cuvette-oplossing zitten en om de zijkanten van de cuvette grondig af te vegen met een Kim-doekje om te voorkomen dat lichtverstrooiing als gevolg van stof of vuil aan de buitenkant van de cuvette. Als de bubbels aanhouden, tikt u voorzichtig en herhaaldelijk op de cuvette op een papieren handdoek die op een harde ondergrond is gelegd.
    4. Met behulp van de UV/Vis spectrofotometer verkrijgt u een absorptiespectrum voor de dipyrrinone analoge oplossing voor een bereik van 200 - 800 nm.
    5. Voeg aan dezelfde cuvette nog eens 10 μL van de dipyrrinone analoge stamoplossing toe en herhaal stap 3.3.3 en 3.3.4.
    6. Herhaal stap 3.3.5 totdat in totaal 50 μL dipyrrinone analoge stamoplossing aan de cuvette is toegevoegd om ten minste vijf excitatiegolflengtegegevenspunten te verkrijgen. Herhaal stap 3.3.1 - 3.3.6 totdat alle voorraadoplossingen van 16 - 25 zijn verkregen in zowel PBS (pH 7,0) als 1,0 M NaOH.
  4. Verkrijg molaire absorptiviteitswaarden voor 16 - 25 in PBS (pH 7,0) en 1,0 M NaOH met behulp van de best passende lineaire regressieanalyse.
    1. Met behulp van een grafiekprogramma zoals GraphPad Prism 7, plot u de gemeten absorptie (y-as) tegen de dipyrrinone analoge concentratie (x-as). Maak een best passende lineaire regressieanalyse voor de vijf geplote punten. Er moet een lineaire relatie worden waargenomen en statistische analyse moet een R2-waarde ≥ 0,98 laten zien.
    2. Herhaal stap 3.4.1 voor analogen 16 - 25 in PBS (pH 7.0) en 1.0 M NaOH.
    3. Bereken de molaire absorptiviteit voor 16 - 25 in PBS (pH 7,0) en 1,0 M NaOH met behulp van de geëxtrapoleerde hellingswaarde van de best passende lineaire curve.
  5. Bepaal de pKa-waarden van 16 - 25 studies met uv/vis spectrofotometrie
    1. Breng in een schone en droge kwarts cuvette 1.900 μL van de PBS-buffer over op het geselecteerde pH-niveau (bereid in stap 3.2) met behulp van een micropipet van 100 - 1000 μL.
      OPMERKING: We hebben bij opslag gemerkt dat er een wit neerslag kan ontstaan in sommige buffers. Om ervoor te zorgen dat de buffer volledig homogeen is en als er een neerslag zichtbaar is, gebruikt u zwaartekrachtfiltratie om elk neerslag onmiddellijk voor gebruik te verwijderen. Zie de opmerking na stap 3.3.1.
    2. Maak met behulp van de UV/Vis spectrofotometer de geselecteerde PBS-bufferoplossing leeg voor een bereik van 200 - 800 nm.
    3. Breng in een tweede schone en droge kwarts cuvette 1.900 μL van de geselecteerde PBS-buffer over en voeg vervolgens 100 μL van de geselecteerde analoge voorraadoplossing toe met behulp van een micropipet van 5-50 μL. Plaats een dop op de cuvette en schud goed naast het omkeren van de cuvette.
      OPMERKING: Zie de vorige opmerking na stap 3.3.3.
    4. Met behulp van de UV/Vis spectrofotometer verkrijgt u het absorptiespectrum voor de dipyrrinone analoog voor een bereik van 200 - 800 nm.
    5. Herhaal stap 3.5.1 - 3.5.4 voor 16 - 25 in elk van de PBS-buffers die in stap 3.2 zijn gegenereerd.
  6. Bepaal de pKa-waarden voor 16 - 25 met behulp van een best passende sigmoidale curve fittingfunctie.
    1. Met behulp van een grafiekprogramma, grafiek de gemeten absorptie vs. golflengte (nm) voor 16 - 25 op de verschillende pH-niveaus.
    2. Kies een golflengte tussen 380-415 nm waarbij bij lagere pH-niveaus (< 7,0) de absorptie klein is (0-0,1 eenheden) en bij een hogere pH (> 12,0) de absorptie aanzienlijk groter is (0,8-1,0 eenheden). Plot de absorptie op de gekozen golflengte versus de pH.
    3. Genereer met behulp van een sigmoidale curvefunctie een best passende curve voor elk van de analogen 16 - 25. Rapporteer de geëxtrapoleerde pH op halve hoogte van de curve. Dit is de gerapporteerde pKeen waarde.

4. Quantum Yield Acquisitie en Fluorescentie Studies

  1. Maak fluorescentiestudie voorraadoplossingen voor dipyrrinone analogen 16 - 18 en 20 - 25.
    1. Voer met behulp van een dipyrrinone analoge stamoplossing die in stap 3.1 is gemaakt, een verdunning van de stamoplossing uit door 10 μL van de stamoplossing toe te voegen aan een maatkolf van 1 ml met behulp van een micropipet van 2 - 20 μL en voeg vervolgens PBS (pH 7,0) buffer toe aan de 1 ml-markering. Plaats een dop op de volumetrische kolf en meng goed door de kolf om te keren en te schudden. Deze verdunde stamoplossing zal worden gebruikt om de fluorescentiespectra te genereren en zal de fluorescentievoorraadoplossing worden genoemd.
    2. Herhaal stap 4.1.1 voor analogen 16 - 18 en 20 - 25.
  2. Verkrijg fluorescentie-emissiespectra in verschillende concentraties, voor analogen 16 - 18 en 20 - 25. Voor alle andere analogen dan 18, verkrijg vijf spectra voor elke analoog in oplossingen van pH 7 en 14 bij concentraties van: 19,96, 39,84, 59,64, 79,37 en 99,01 nM. Voor analoog 18, verwerf vijf spectra in een oplossing van pH 7 bij concentraties van: 49,75, 99,01, 147,8, 196,1 en 243,9 nM. In een oplossing van pH 14, verwerf vijf spectra voor analoog 18 bij concentraties van: 99.01, 196.1, 291.3, 384.6, 476.2 nM.
    1. Voeg in een transparante vierzijdige kwarts cuvette 3,00 ml PBS (pH 7,0) of 1,0 NaOH toe met een micropipet van 100 -1.000 μL in drie stappen van 1.000 μL.
      OPMERKING: Zie opmerking na stap 3.3.1.
    2. Met behulp van de fluorometer en het fluorometersoftwareprogramma FluorEssence verkrijgt u een emissiespectrum voor de geselecteerde oplossing en labelt u dit als de oplossing "blanco".
    3. Voeg aan dezelfde cuvette 6 μL fluorescentievoorraadoplossing toe voor de geselecteerde dipyrrinone-analoog (deel 4.1) met behulp van een 0,5-10 μL micropipet. Plaats de dop op de cuvette en meng goed door de cuvette om te keren en zachtjes te schudden.
      OPMERKING: Zie opmerking na stap 3.3.3.
    4. Met behulp van de fluorometer, verwerven van een emissiespectrum voor de geselecteerde samengestelde oplossing met behulp van λmax abs als de excitatie golflengte. Excitatie-intensiteit werd gemeten over een bereik van 200 nm vanaf 15 nm buiten de excitatiegolflengte (meestal is een bereik van 200 nm vereist om de fluorescentie-intensiteit terug te laten keren naar de uitgangswaarde).
    5. Herhaal stap 4.2.3 - 4.2.4 totdat in totaal 30 μL fluorescentievoorraadoplossing aan de cuvette is toegevoegd.
    6. Herhaal stap 4.2.1 - 4.2.5 voor analogen 16 - 25 in PBS (pH 7,0) en 1,0 M NaOH.
      OPMERKING: De cuvetteconcentraties werden gewijzigd voor analoog 18 en de gegevens werden verkregen met behulp van: 2,0 ml PBS met vijf opeenvolgende stappen van 10 μL fluorescentievoorraadoplossing voor een neutrale (geprotoneerde 18)oplossing en 2,0 ml 1,0 M NaOH met vijf stappen van 20 μL toegevoegde samengestelde stamoplossing voor een basisoplossing (gedeprotoneerde 18).
  3. Bepaal de kwantumopbrengst met behulp van de methode van Williams, A.T. et al.17
    1. Importeer met behulp van een spreadsheetsoftwareprogramma (d.w.z. Microsoft Excel) de gegevens (emissie-intensiteitsgegevenspunten) voor de emissiespectra voor een enkele dipyrrinone-analoog (genomen in PBS [pH 7.0] of 1.0 M NaOH) op de verschillende concentratieniveaus.
    2. Importeer de gegevenspunten uit de emissiespectra voor de "blanco" oplossing (stappen 4.2.1 - 4.2.2) en trek de "blanco" emissie-intensiteitsgegevenspunten af van de emissie-intensiteitsgegevenspunten, op de overeenkomstige golflengten, verkregen op verschillende concentratieniveaus.
    3. Breng de "blanco" gecorrigeerde emissie-intensiteitsgegevenspunten over in een grafiekprogramma, zoals GraphPad Prism 7, en plotemissie versus golflengte. Bereken het gebied onder de curve voor elk van de curven verkregen bij de verschillende concentratieniveaus van dipyrrinone analoog.
    4. Volgens de door Williams, A. T. et al. beschreven techniek, berekent u een geëxtrapoleerde absorptiewaarde voor elk van de variërende concentratieniveaus van dipyrrinone analoog. Dit wordt bereikt door de berekende molaire absorptiviteitswaarde (uit de best passende lineaire regressieanalyse, zie stap 3.4) te vermenigvuldigen met elke concentratie dipyrrinone analoog die wordt gebruikt in stap 4.2.3-4.2.5.
    5. Maak met behulp van een grafiekprogramma zoals GraphPad Prism 7 een plot van de geëxtrapoleerde absorptieantie (x-as) van de analoog ten opzichte van het berekende gebied onder elke concentratiecurve (stap 4.3.4) voor de emissiegolflengte die overeenkomt met de grootste emissiewaarde. Een lineaire relatie met een r2 ≥ 0,96 moet worden waargenomen.
    6. Voer stappen uit die vergelijkbaar zijn met 3.1-3.4 en 4.1-4.3.5 voor kinine in 0,5 M H2SO4 (ΦF = 0,55)18 en antracine in ethanol (ΦF = 0,27)18,19 om gegevens voor normen te verkrijgen.
    7. Verkrijg de kwantumopbrengstwaarden voor 16 - 25 in PBS (pH 7,0) en 1,0 M NaOH met behulp van de geëxtrapoleerde hellingen verkregen uit stap 4.3.5 en 4.3.6 in de volgende vergelijking:
      Φx =Φst(Gradx/Gradst)(η2x/η2st)
      waar Φst de kwantumopbrengst van de standaard vertegenwoordigt, Φx de kwantumopbrengst van het onbekende, grad is de helling van de beste lineaire pasvorm en η is de brekingsindex van het gebruikte oplosmiddel (de brekingsindexverhouding werd berekend met behulp van η = 1,36 voor ethanol en η = 1,35 voor 0,5 M H2SO4).
    8. Rapporteer de kwantumopbrengsten voor 16 - 18 en 20 - 25 in PBS (pH 7,0) en 1,0 M NaOH als een gemiddelde van de Φx verkregen voor kinine en antraceen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De condensatiereactie claisen-Schmidt gaf toegang tot dipyrrinone-analogen (16-25, figuur 4) volgens de in het protocolgedeelte beschreven eenpotprocedure (zie stap 1). Analogen 16-25 werden allemaal gegenereerd door het condenseren van pyrrolinon 9, bromoisoindolone 10, of isoindolon 11 met 1H-imidazol-2-carboxaldehyde (12), 1H-imidazol-5-...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De Claisen-Schmidt condensatiebenadering biedt een vrij robuust middel om pyrazol, imidazol en isoindodondi synergrinonefluoroforen te genereren door middel van een relatief operationeel simplistisch protocol. Hoewel de synthese van de fluorescerende dipyrrinone-analogen de focus van deze studie was, moet worden opgemerkt dat vergelijkbare voorwaarden kunnen worden toegepast om toegang te krijgen tot andere bicyclische methine-gekoppelde ringsystemen zoals dipyrrinonen23 ,

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets bekend te maken.

Dankbetuigingen

Z.R.W. en N.B. danken de NIH (2P20 GM103440-14A1) voor hun genereuze financiering, evenals Jungjae Koh en de Universiteit van Nevada, Las Vegas voor hun hulp bij het verwerven van 1H en 13C NMR. Daarnaast willen we NSC visual media studenten, Arnold Placencia-Flores, Aubry Jacobs en Alistair Cooper bedanken voor hun hulp bij de film- en animatieprocessen binnen de cinematografische delen van dit manuscript.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html
Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
3-ethyl-4-methyl-3-pyrrolin-2-onCombi-Blocks [766-36-9]Gele vaste reagens
isoindolin-1-onArkPharm [480-91-1]Roomkleurige vaste reagens
5-broomisoindolin-1-onCombi-Blocks [552330-86-6]Roze vaste reagens
2-formylimidazoolCombi-Blocks [10111-08-7 ]Roomkleurige vaste reagens
Imidazool-4-carbaldehydeArkPharm [3034-50-2]Vaste reagens
1-H-pyrazool-4-carbaldehydeOakwood Chemicals [35344-95-7]Vaste reagens
1-H-pyrazool-5-carbaldehydeMatrix Scientific [3920-50-1]Vaste reagens
Vaste KOH-pelletsBeanTown Chemicals[1310-58-3]Witte vaste pellets
Siliflash Silica GelScilicycleR12030BFijne witte poeder
Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) (x10)GrowcellsMRGF-6235Kleurloze doorschijnende vloeistof
Beckman Coulter DU-800 UV/Vis Spectrofotometer en SoftwareBeckman CoulterN/ASpectroscopie-instrument en Software
Fluoromax-4 SpectrofluorometerHoriba ScientificN/ASpectroscopie-instrument
FluorEssence Fluorometrie Software V3.5Horiba ScientificN/ASpectroscopie-software
Finnpipette II Micropipet (maten: 100-1.000, 20-200 en 0,5-10 µL)FischerbrandN/AApparatuur
Wilmad-LabGlass Roterende Verdamper (Model: WG-EV311-V-PLUS)SP SciencewareN/AApparatuur
DuoSeal Vacuümpomp (Modelnummer: 1405)WelchN/AApparatuur
GraphPad Prism 4GraphPadN/AData-analysesoftware
SympHony pH Meter (Model: Sb70P)VWRN/AApparatuur
```

Referenties

  1. Abbandonato, G., et al. Cis-trans photoisomerization properties of GFP chromophore analogs. European Biophysics Journal. 40 (11), 1205-1214 (2011).
  2. Funakoshi, H., et al. Spectroscopic studies on merocyanine photoisomers. IV. Catalytic isomerization of photoisomers of merocyanine derivatives in protic solvents. Nippon Kagaku Kaishi. (9), 1516-1522 (1989).
  3. Puzicha, G., Shrout, D. P., Lightner, D. A. Synthesis and properties of homomologated and contracted dipyrrinone analogs of xanthobilirubic acid. Journal of Heterocyclic Chemistry. 27 (7), 2117-2123 (1990).
  4. Bonnett, R., Hamzetash, D., Asuncion Valles, M. Propentdyopents [5-(2-oxo-2H-pyrrol-5-ylmethylene)pyrrol-2(5H)-ones] and related compounds. Part 2. The Z E photoisomerization of pyrromethenone systems. Journal of the Chemical Society, Perkins Transactions. 1 (6), 1383-1388 (1987).
  5. Tikhomirova, K., Anisimov, A., Khoroshutin, A. Biscyclohexane-Annulated Diethyl Dipyrrindicarboxylates: Observation of a Dipyrrin Form with Absent Visible Absorption. European Journal of Organic Chemistry. 2012 (11), 2201-2207 (2012).
  6. Brower, J. O., Lightner, D. A. Synthesis and spectroscopic properties of a new class of strongly fluorescent dipyrrinones. Journal of Organic Chemistry. 67 (8), 2713-2716 (2002).
  7. Woydziak, Z. R., Boiadjiev, S. E., Norona, W. S., McDonagh, A. F., Lightner, D. A. Synthesis and Hepatic Transport of Strongly Fluorescent Cholephilic Dipyrrinones. Journal of Organic Chemistry. 70 (21), 8417-8423 (2005).
  8. Jarvis, T., et al. Pyrrole β-amides: Synthesis and characterization of a dipyrrinone carboxylic acid and an N-Confused fluorescent dipyrrinone. Tetrahedron. 74 (14), 1698-1704 (2018).
  9. Bodio, E., Denat, F., Goze, C. BODIPYS and aza-BODIPY derivatives as promising fluorophores for in vivo molecular imaging and theranostic applications. Journal of Porphyrins and Phthalocyanines. 23, 1159-1183 (2019).
  10. Acharya, A., et al. Photoinduced Chemistry in Fluorescent Proteins: Curse or Blessing. Chemical Reviews. 117 (2), 758-795 (2017).
  11. Romei, M. G., Lin, C. -Y., Mathews, I. I., Boxer, S. G. Electrostatic control of photoisomerization pathways in proteins. Science. 367 (6473), 76-79 (2020).
  12. Benson, N., Suleiman, O., Odoh, S. O., Woydziak, Z. Ryrazole, Imidazole, and Isoindolone Dipyrrinone Analogues: pH-Dependent Fluorophores That Red-Shift Emission Frequencies in a Basic Solution. Journal of Organic Chemistry. 84 (18), 11856-11862 (2019).
  13. Xie, P., Gao, G., Liu, J., Jin, Q., Yang, G. A New Turn on Fluorescent Probe for Selective Detection of Cysteine/Homocysteine. Journal of Fluorescence. 25 (5), 1315-1321 (2015).
  14. Alty, I. G., et al. Intramolecular Hydrogen-Bonding Effects on the Fluorescence of PRODAN Derivatives. Journal of Physical Chemistry A. 120 (20), 3518-3523 (2016).
  15. Yang, Y., Li, D., Li, C., Liu, Y. F., Jiang, K. Hydrogen bond strengthening induces fluorescence quenching of PRODAN derivative by turning on twisted intramolecular charge transfer. Spectrochimica Acta, Part A. 187, 68-74 (2017).
  16. Zhang, L., Liu, J., Gao, J., Zhang, F., Ding, L. High solid fluorescence of a pyrazoline derivative through hydrogen bonding. Molecules. 22 (8), 1(2017).
  17. Williams, A. T. R., Winfield, S. A., Miller, J. N. Relative fluorescence quantum yields using a computer-controlled luminescence spectrometer. Analyst. 108 (1290), 1067-1071 (1983).
  18. Eaton, D. F. Reference materials for fluorescence measurement. Pure and Applied Chemistry. 60 (7), 1107-1114 (1988).
  19. Dawson, W. R., Windsor, M. W. Fluorescence yields of aromatic compounds. Journal of Physical Chemistry. 72 (9), 3251-3260 (1968).
  20. Zhang, X. -F., Zhang, J., Lu, X. The Fluorescence Properties of Three Rhodamine Dye Analogues: Acridine Red, Pyronin Y and Pyronin B. Journal of Fluorescence. 25 (4), 1151-1158 (2015).
  21. Zanker, V., Rammensee, H., Haibach, T. Measurements of the relative quantum yields of the fluorescence of acridine and fluorescein dyes. Zeitschrift für Angewandte Physik. 10, 357-361 (1958).
  22. Mujumdar, R. B., Ernst, L. A., Mujumdar, S. R., Lewis, C. J., Waggoner, A. S. Cyanine dye labeling reagents: Sulfoindocyanine succinimidyl esters. Bioconjugate Chemistry. 4 (2), 105-111 (1993).
  23. Battersby, A. R., Dutton, C. J., Fookes, C. J. R. Synthetic studies relevant to biosynthetic research on vitamin B12. Part 7. Synthesis of (±)-bonellin dimethyl ester. Journal of the Chemical Society, Perkin Transactions. 1 (6), 1569-1576 (1988).
  24. Pfeiffer, W. P., Lightner, D. A. (m.n)-Homorubins: syntheses and structures. Monatschfte für Chemie. 145 (11), 1777-1801 (2014).
  25. Huggins, M. T., Musto, C., Munro, L., Catalano, V. J. Molecular recognition studies with a simple dipyrrinone. Tetrahedron. 63 (52), 12994-12999 (2007).
  26. Groselj, U., et al. Synthesis of Spiro-δ2-Pyrrolin-4-One Pseudo Enantiomers via an Organocatalyzed Sulfa-Michael/Aldol Domino Sequence. Advanced Synthesis & Catalyst. 361 (22), 5118-5126 (2019).
  27. El-Shwiniy, W. H., Shehab, W. S., Mohamed, S. F., Ibrahium, H. G. Synthesis and cytotoxic evaluation of some substituted pyrazole zirconium(IV) complexes and their biological assay. Applied Organometallic Chemistry. 32 (10), (2018).
  28. Murray, L., O'Farrell, A. -M., Abrams, T. Preparation of indolinone compounds for treatment of excessive osteolysis. US Patent. , US20040209937A1 (2004).
  29. Lozinskaya, N. A., et al. Synthesis and biological evaluation of 3-substituted 2-oxindole derivatives as new glycogen synthase kinase 3β inhibitors. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 27 (9), 1804-1817 (2019).
  30. Montforts, F. P., Schwartz, U. M. A directed synthesis of the chlorin system. Liebigs Annalen der Chemie. (6), 1228-1253 (1985).
  31. Uddin, M. I., Thirumalairajan, S., Crawford, S. M., Cameron, T. S., Thompson, A. Improved synthetic route to C-ring ester-functionalized prodigiosenes. Synlett. (17), 2561-2564 (2010).
  32. Brower, J. O., Lightner, D. A., McDonagh, A. F. Aromatic congeners of bilirubin: synthesis, stereochemistry, glucuronidation and hepatic transport. Tetrahedron. 57 (37), 7813-7827 (2001).
  33. Clift, M. D., Thomson, R. J. Development of a Merged Conjugate Addition/Oxidative Coupling Sequence. Application to the Enantioselective Total Synthesis of Metacycloprodigiosin and Prodigiosin R1. Journal of the American Chemical Society. 131 (40), 14579-14583 (2009).
  34. Brower, J. O., Lightner, D. A., McDonagh, A. F. Synthesis of a New Lipophilic Bilirubin. Conformation, Transhepatic Transport and Glucuronidation. Tetrahedron. 56 (40), 7869-7883 (2000).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

DipyrrinonesynthesepH afhankelijke fluoroforenvinyloog enolaatfluorescerende dipyrrinonanalogenreflux met kaliumhydroxidedunlaagchromatografieflashkolomchromatografieUV Vis spectroscopiefluorescentiespectroscopie
Synthese van pH-afhankelijke pyrazol, imidazol en isoindodondiyrrinonefluoroforen met behulp van een Claisen-Schmidt condensatiebenadering
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.