In vitro time-lapse live-cell imaging om celmigratie naar het orgaan van Corti te verkennen

Samenvatting

In deze studie presenteren we een real-time beeldvormingsmethode met confocale microscopie om cellen te observeren die naar beschadigd weefsel bewegen door ex vivo incubatie met het cochleaire epitheel dat het orgaan van Corti bevat.

Samenvatting

Om de effecten van mesenchymale stamcellen (MSC's) op celregeneratie en -behandeling te bestuderen, volgt deze methode MSC-migratie en morfologische veranderingen na co-cultuur met cochleair epitheel. Het orgaan van Corti werd geïmmobiliseerd op een plastic deklip door een deel van het membraan van de Reissner te drukken dat tijdens de dissectie werd gegenereerd. MSC's die door een glazen cilinder werden opgesloten, migreerden naar cochleair epitheel toen de cilinder werd verwijderd. Hun overheersende lokalisatie werd waargenomen in de modiolus van het orgaan van Corti, uitgelijnd in een richting die vergelijkbaar is met die van de zenuwvezels. Sommige MSC's werden echter gelokaliseerd in het limbusgebied en vertoonden een horizontaal langwerpige vorm. Bovendien werd de migratie naar het haarcelgebied verhoogd en veranderde de morfologie van de MSC's in verschillende vormen na de behandeling met kanamycine. Concluderend geven de resultaten van deze studie aan dat de cocultuur van MSC's met cochleair epitheel nuttig zal zijn voor de ontwikkeling van therapieën via celtransplantatie en voor studies naar celregeneratie die verschillende aandoeningen en factoren kunnen onderzoeken.

Inleiding

Gehoorverlies kan aangeboren optreden of kan geleidelijk worden veroorzaakt door verschillende factoren, waaronder veroudering, medicijnen en lawaai. Gehoorverlies is vaak moeilijk te behandelen omdat het zeer uitdagend is om een verminderde functie te herstellen zodra de haarcellen die verantwoordelijk zijn voor het gehoor zijn beschadigd¹. Volgens de Wereldgezondheidsorganisatie hebben naar schatting 461 miljoen mensen wereldwijd gehoorverlies, wat verantwoordelijk is voor 6,1% van de wereldbevolking. Van degenen met gehoorverlies is 93% volwassen en 7% kinderen.

Er is geprobeerd gehoorverlies te behandelen; met name een regeneratiebenadering met behulp van MSC's is een veelbelovende behandeling gebleken. Wanneer weefsel beschadigd is, worden MSC's van nature vrijgegeven in de bloedsomloop en migreren ze naar de plaats van verwondingen waar ze verschillende moleculen afscheiden om een micromilieu te vormen dat regeneratie^{bevordert 2}. Daarom is het belangrijk om een methode te ontwikkelen om beschadigde weefsels te behandelen door de migratie van extern geïmplanteerde MSC's om organen te targeten en hun daaropvolgende afscheiding van moleculen die krachtige immuunregulatie, angiogenese en anti-apoptose veroorzaken om het herstel van beschadigde celfunctie^3,4,5te verbeteren .

Het homing-proces waarbij MSC's migreren naar beschadigde weefsels kan het belangrijkste obstakel zijn om te overwinnen. MSC 's hebben een systemisch homingmechanisme met opeenvolgende stappen van tethering/rolling, activering, arrestatie, transmigratie/diapedese en migratie^6,7,8. Momenteel worden er inspanningen geleverd om manieren te vinden om deze stappen te verbeteren. Verschillende strategieën, waaronder genetische modificatie, celoppervlaktechniek, in vitro priming en magnetische geleiding, zijn getest^6,7. Daarnaast zijn verschillende pogingen gedaan om de bescherming en regeneratie van auditieve haarcellen te bevorderen door MSC's naar de plaats van beschadigd slakkenhuis te brengen. Het volgen van MSC's in vivo is echter tijdrovend en arbeidsintensief en vereist zeer gespecialiseerde vaardigheden⁹.

Om dit probleem op te lossen, werd een methode ontwikkeld om de homing van MSC's in het slakkenhuis te observeren door middel van time-lapse confocale microscopie die de migratie van cellen gedurende meerdere uren fotografeert (Figuur 1). Het werd ontwikkeld in het begin van de 20e eeuw en is onlangs uitgegroeid tot een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van migratie van specifieke cellen.

Figuur 1: Grafische samenvatting. (A) Nadat het ontlede orgaan van Corti met behulp van een tang op een plastic afdeklip is gehecht, wordt de afdeklip op een confocale microscopische schaal met glazen bodem van 35 mm geplaatst en (B) de glazen cilinder is geplaatst. (C) Na het vullen van de binnenkant van de glazen cilinder met medium, (D) GFP-gelabelde MSC's met medium worden zorgvuldig toegevoegd buiten de cilinder. (E) Na incubatie 's nachts, (F) wordt de glazen cilinder verwijderd en worden beelden gemaakt met een confocale microscoop. Afkortingen: GFP = groen fluorescerend eiwit; MSC's = mesenchymale stamcellen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Protocol

Alle onderzoeksprotocollen met ICR-muizen zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Yonsei University aan het Wonju College of Medicine. Experimenten werden uitgevoerd volgens de Ethische Code van de World Medical Association. In dit protocol werden zwangere ICR-muizen gehouden in een 12/12 uur licht/ donker cyclus met vrije toegang tot voedsel en water.

1. Cochleae dissectie

1. Steriliseer de laminaire stroom weefselkweekkap door het ultraviolette licht gedurende ~ 30 minuten aan te zetten en besproei alle oppervlakken met 70% ethanol voor gebruik. Laat de oppervlakken drogen.
2. Plaats dissectie-instrumenten gedurende 10 minuten in 70% ethanol en droog ze voor gebruik.
3. Gebruik een operatiemes om postnatale muizen van 3-4 dagen oud te onthoofden (Figuur 2A).
4. Plaats de schedel onder een stereomicroscoop in de laminaire stromingskap en week het weefsel in 70% ethanol.
5. Week het weefsel snel in weefseldissectieoplossing (1x Hank's Balanced Salt Solution, 1 mM HEPES) om de ethanol te verwijderen.
6. Snijd de middellijn van de schedel door met een chirurgisch mes (figuur 2B,C).
7. Stel de schedel bloot door de huid voorin de huid naar beneden te trekken en de uitwendige gehoorgang van het oor door te snijden (figuur 2D).
8. Snijd van de voorste naar het achterste deel van de schedel over de ooglijn (Figuur 2E).
9. Open de schedel en verwijder de voorhersenen, het cerebellum en de hersenstam met een stompe tang (Figuur 2F,G).
10. Scheid met behulp van micro-tang het slakkenhuis van het temporale bot (figuur 2H).
11. Breng het slakkenhuis over in een petrischaaltje met weefseldissectieoplossing.
12. Ontleed voorzichtig alle cochleaire roeicapsules, waarbij alleen het interne cochleaire zachte weefsel overblijft(figuur 2I,J).
13. Houd de modiolus van het slakkenhuis met de tang en het cochleair kanaal vast met een ander paar tangen en scheid de twee weefsels langzaam (Figuur 2K).
14. Verwijder de stria vascularis en het tectoriale membraan door ze voorzichtig af te pellen(figuur 2L,M).
15. Plaats een gesteriliseerde plastic afdeklip in een nieuwe weefseldissectieoplossing en plaats het orgaan van Corti vervolgens op een afdeklip met een diameter van 9 mm, zorg ervoor dat het basilaire membraan naar beneden gericht is (Figuur 2N-P).
16. Immobiliseer het weefsel door het membraan van de Reissner en het resterende modiolusweefsel met een tang op de afdeklip te drukken (afbeelding 2N-P).
17. Breng de afdeklip met het ingebedde weefsel over naar het midden van een confocale schaal met een diameter van 35 mm.
18. Plaats de glazen klooncilinder op de schaal, met de cochleaire explant in het midden van de schaal, en voeg 100 μL explantcultuurmedium (DMEM/F12, 10% foetale runderserum (FBS), 1% N2-supplement, ampicilline (10 μg/ml))¹⁰ in de cilinder toe(figuur 2Q).
19. Plaat 5 × 10³ cellen van muis beenmerg-afgeleide groene fluorescerende eiwit (GFP)-gelabeld MCC's in 2 ml cultuurmedium (45% DMEM + 45% DMEM/F12, 10% FBS, 1% N2 supplement, 10 μg/ml ampicilline) buiten de glazen cilinder (Figuur 2R).
    1. Wanneer de MSC's 80-90% samenvloeien, doorloop ze dan door ze los te maken met trypsine-ethyleendiaminetetraazijnzuur.
20. Breng de confocale schaal voorzichtig over in een bevochtigde incubator en incubeer 's nachts bij 37 °C in een CO_2-atmosfeer van 5%.
21. Aspireer alle medium binnen en buiten de cilinder en verwijder vervolgens de glazen cilinder uit de confocale schotel.
22. Voeg 2 ml vers kweekmedium toe aan de confocale schaal en incubeer de weefselkweekschaal in een bevochtigde incubator totdat deze klaar is voor analyse.

Figuur 2. Dissectie van een muizenslakkenhuis en cocultuur van het orgaan van Corti en MSC's. (A) Onthoofding van de muis, (B) en(C) midline sagittale dissectie van het hoofd, (D) en (E) coronale dissectie van de hersenen, (F) en (G) verwijdering van de hersenen en temporale bot, (H) het slakkenhuis, (I) verwijdering van de benige cochleaire wand, (J) isolatie van het slakkenhuis, (K) scheiding van het cochleair kanaal van de modiolus, (L) scheiding van stria vascularis (SV) en spiraalligment (SL) van het orgaan van Corti, (M) verwijdering van het tectoriale membraan, (N-P) fixatie van het slakkenhuis op een plastic afdekslip, (Q) plaats van de deksels oranje (F, G, P) en gele schaalbalk (H,I) = 1 mm; groene schaalbalk (J-O) = 0,5 mm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

2. Time-lapse beeldvorming

1. Gebruik voor de hier gepresenteerde experimenten een confocale microscopiesysteem met een stage top incubatorsysteem.
2. Zet de confocale microscoop, het fluorescerende licht en de computer aan.
3. Stel de omstandigheden van de stage-top incubator op het podium van de confocale microscoop in op 37 °C en 5% CO_2-atmosfeer.
4. Plaats de monsterschaal op het schotelbevestigingsvat, dek af met het deksel van de schotelbevestiging en sluit de kamer met het deksel van de bovenste kachel.
5. Pas de zoom en focus aan om het orgaan van Corti en MSC's in het gezichtsveld te lokaliseren.
6. Open de beeldverwerkingssoftware. Selecteer onder de zoekoptie een 20x Plan-Apochromat-objectief (numeriek diafragma 0,8) en een 0,5x bijsnijdgebied.
7. Klik onder Acquisitieop slimme instellingen en selecteer EGFP.
8. Open het kanaaltabblad onder Acquisitieen stel het laservermogen in op 0,2%, het pinhole op 44 μm, de master gain op 750 Ven de digitale gain op 1,0.
9. Klik op ESID onder imaging setupen stel de ESID gain in op 4 en de digitale gain op 7.5.
10. Klik op Tegels en stake om 210 tegels te produceren.
11. Open de focusstrategie en selecteer de scherpstelmodus.
12. Stel onder tijdreeksde duur in op 24 uur en het interval op 10 min.
13. Stel onder Acquisitiede framegrootte in op 512 x 512 pixels, scansnelheid op 8, de richting naar bidirectioneel, de gemiddelde op 4xen de bits per pixel op 16.
14. Klik op experiment starten om het experiment te starten.

3. Wijziging van afbeeldingsbestanden

1. Klik tijdens de verwerkingop stikselsen stel de minimale overlay in op 5% en de maximale verschuiving op 10%.
2. Klik op filmexport, stel ongecomprimeerdin en stel de snelheid in op 7,5.

4. Immunostaining

1. Aspireer het medium voorzichtig en was het monster tweemaal met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) gedurende 5 minuten.
2. Bevestig het monster met 4% formaline in PBS gedurende 15 minuten en was het monster 3 keer met PBS gedurende 5 minuten.
3. Permeabiliseer het monster in 0,1% Triton X-100 in PBS gedurende 10 minuten en was 3 keer met PBS gedurende 5 minuten.
4. Voeg 250 μL phalloidine-iFluor 647 reagens (1:1000 verdunning in PBS) toe en incubeer het monster gedurende 1 uur bij kamertemperatuur op de shaker.
5. Was het monster 3 keer met PBS gedurende 5 minuten.
6. Breng de afdeklip over op de glazen glijbaan en voeg 2 druppels montageoplossing toe.
7. Plaats voorzichtig een afdeklip op de glijbaan.
8. Sluit de hoezenlip af met heldere nagellak en bewaar bij 4 °C in het donker totdat cellen worden waargenomen.
9. Beeld de dia af met een confocale microscoop met een geschikt filter bij excitatie/emissie (Ex/Em)=650/665 nm voor falloïdine en bij Ex/Em=488/507 nm voor EGFP.

Resultaten

In vitro migratie van MSC's in driedimensionale modus is beoordeeld door een Transwell-systeem of door de traditionele wondgenezingsmethode om migratie in tweedimensionale (2D) modus¹¹te observeren . Het orgaan van Corti is een complexe structuur die bestaat uit verschillende cellen zoals Boettcher-cellen, Claudius-cellen, Deiters-cellen, pilaarcellen, Hensen-cellen, buitenste haarcellen, binnenste haarcellen, zenuwvezels, basilair membraan en reticulaire lamina

Discussie

Transplantatie van MSC's naar beschadigde locaties om de regeneratie van beschadigde cellen te bevorderen is uitgebreid bestudeerd en het therapeutische effect is duidelijk. De transplantatie en daaropvolgende differentiatie van MSC's zijn gemeld om het gehoor te herstellen bij ratten met gehoorverlies veroorzaakt door 3-nitropropioninezuur¹³. Hoewel Lee c.s. MSC's trans-veneus op mensen toepasten, bereikten zij geen significante verbetering in het gehoor¹⁴. Tot voor kort w...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
10X PBS Buffer	GenDEPOT	P2100-104
4% Formalin	T&I	BPP-9004
Ampicillin	sigma	A5354-10ml
BSA	sigma	A4503-100G
confocal dish	SPL	200350
confocal microscope	ZEISS	LSM800
coverslip	SPL	20009
DMEM/F12	Gibco	10565-018
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher scientific	16140071
Fluorsheild with DAPI	sigma	F6057
Forcep	Dumont	0508-L5-P0
HBSS	Thermo Fisher scientific	14065056
HEPES	Thermo Fisher scientific	15630080
N2 supplement	Gibco	17502-048
Phalloidin-iFluor 647 Reagent	abcam	ab176759
Stage Top Incubator	TOKAI HIT	WELSX
Strain C57BL/6 mouse messenchymal stem cells with GFP	cyagen	MUBMX-01101
Triton X-100	sigma	T8787