In deze studie presenteren we een real-time beeldvormingsmethode met confocale microscopie om cellen te observeren die naar beschadigd weefsel bewegen door ex vivo incubatie met het cochleaire epitheel dat het orgaan van Corti bevat.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
In vitro time-lapse live-cell imaging om celmigratie naar het orgaan van Corti te verkennen
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Om de effecten van mesenchymale stamcellen (MSC's) op celregeneratie en -behandeling te bestuderen, volgt deze methode MSC-migratie en morfologische veranderingen na co-cultuur met cochleair epitheel. Het orgaan van Corti werd geïmmobiliseerd op een plastic deklip door een deel van het membraan van de Reissner te drukken dat tijdens de dissectie werd gegenereerd. MSC's die door een glazen cilinder werden opgesloten, migreerden naar cochleair epitheel toen de cilinder werd verwijderd. Hun overheersende lokalisatie werd waargenomen in de modiolus van het orgaan van Corti, uitgelijnd in een richting die vergelijkbaar is met die van de zenuwvezels. Sommige MSC's werden echter gelokaliseerd in het limbusgebied en vertoonden een horizontaal langwerpige vorm. Bovendien werd de migratie naar het haarcelgebied verhoogd en veranderde de morfologie van de MSC's in verschillende vormen na de behandeling met kanamycine. Concluderend geven de resultaten van deze studie aan dat de cocultuur van MSC's met cochleair epitheel nuttig zal zijn voor de ontwikkeling van therapieën via celtransplantatie en voor studies naar celregeneratie die verschillende aandoeningen en factoren kunnen onderzoeken.
Inleiding
Gehoorverlies kan aangeboren optreden of kan geleidelijk worden veroorzaakt door verschillende factoren, waaronder veroudering, medicijnen en lawaai. Gehoorverlies is vaak moeilijk te behandelen omdat het zeer uitdagend is om een verminderde functie te herstellen zodra de haarcellen die verantwoordelijk zijn voor het gehoor zijn beschadigd1. Volgens de Wereldgezondheidsorganisatie hebben naar schatting 461 miljoen mensen wereldwijd gehoorverlies, wat verantwoordelijk is voor 6,1% van de wereldbevolking. Van degenen met gehoorverlies is 93% volwassen en 7% kinderen.
Er is geprobeerd gehoorverlies te behandelen; met na....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle onderzoeksprotocollen met ICR-muizen zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Yonsei University aan het Wonju College of Medicine. Experimenten werden uitgevoerd volgens de Ethische Code van de World Medical Association. In dit protocol werden zwangere ICR-muizen gehouden in een 12/12 uur licht/ donker cyclus met vrije toegang tot voedsel en water.
1. Cochleae dissectie
- Steriliseer de laminaire stroom weefselkweekkap door het ultraviolette licht gedurende ~ 30 minuten aan te zetten en besproei alle oppervlakken met 70% ethanol voor gebruik. Laat de oppervlakken drogen.
- Plaa....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
In vitro migratie van MSC's in driedimensionale modus is beoordeeld door een Transwell-systeem of door de traditionele wondgenezingsmethode om migratie in tweedimensionale (2D) modus11te observeren . Het orgaan van Corti is een complexe structuur die bestaat uit verschillende cellen zoals Boettcher-cellen, Claudius-cellen, Deiters-cellen, pilaarcellen, Hensen-cellen, buitenste haarcellen, binnenste haarcellen, zenuwvezels, basilair membraan en reticulaire lamina
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Transplantatie van MSC's naar beschadigde locaties om de regeneratie van beschadigde cellen te bevorderen is uitgebreid bestudeerd en het therapeutische effect is duidelijk. De transplantatie en daaropvolgende differentiatie van MSC's zijn gemeld om het gehoor te herstellen bij ratten met gehoorverlies veroorzaakt door 3-nitropropioninezuur13. Hoewel Lee c.s. MSC's trans-veneus op mensen toepasten, bereikten zij geen significante verbetering in het gehoor14. Tot voor kort w.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets bekend te maken.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door onderzoeksbeurzen (NRF-2018-R1D1A1B07050175, HURF-2017-66) van de National Research Foundation (NRF) of Korea en Hallym University Research Fund.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 10X PBS Buffer | GenDEPOT | P2100-104 | |
| 4% Formalin | T&I | BPP-9004 | |
| Ampicillin | sigma | A5354-10ml | |
| BSA | sigma | A4503-100G | |
| confocal dish | SPL | 200350 | |
| confocal microscope | ZEISS | LSM800 | |
| coverslip | SPL | 20009 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 10565-018 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher scientific | 16140071 | |
| Fluorsheild with DAPI | sigma | F6057 | |
| Forcep | Dumont | 0508-L5-P0 | |
| HBSS | Thermo Fisher scientific | 14065056 | |
| HEPES | Thermo Fisher scientific | 15630080 | |
| N2 supplement | Gibco | 17502-048 | |
| Phalloidin-iFluor 647 Reagent | abcam | ab176759 | |
| Stage Top Incubator | TOKAI HIT | WELSX | |
| Strain C57BL/6 mouse messenchymal stem cells with GFP | cyagen | MUBMX-01101 | |
| Triton X-100 | sigma | T8787 |
Referenties
- Brown, C. S., Emmett, S. D., Robler, S. K., Tucci, D. L. Global hearing loss prevention. Otolaryngologic Clinics of North America. 51 (3), 575-592 (2018).
- Chamberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. Concise revie....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
