Een nauwkeurige en reproduceerbare methode voor in vivo nucleosiden/nucleotiden kwantificering in planten wordt hier beschreven. Deze methode maakt gebruik van een HPLC-MS/MS.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Plantmonstervoorbereiding voor nucleoside/nucleotide-inhoudsmeting met een HPLC-MS/MS
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Nucleosiden/nucleotiden zijn bouwstenen van nucleïnezuren, delen van cosubstraten en co-enzymen, celsignaleringsmoleculen en energiedragers, die betrokken zijn bij veel celactiviteiten. Hier beschrijven we een snelle en betrouwbare methode voor de absolute kwalificatie van nucleoside/nucleotidegehalte in planten. Kortom, 100 mg gehomogeniseerd plantaardig materiaal werd geëxtraheerd met 1 ml extractiebuffer (methanol, acetonitril en water in een verhouding van 2:2:1). Later werd het monster vijf keer geconcentreerd in een vriesdroger en vervolgens geïnjecteerd in een HPLC-MS/MS. Nucleotiden werden gescheiden op een poreuze grafitische koolstofkolom (PGC) en nucleosiden werden gescheiden op een C18-kolom. De massaovergangen van elke nucleoside en nucleotide werden gecontroleerd door massaspectrometrie. De inhoud van de nucleosiden en nucleotiden werd gekwantificeerd aan de hand van hun externe normen (ESTD's). Met deze methode kunnen onderzoekers daarom nucleosiden/nucleotiden in verschillende planten eenvoudig kwantificeren.
Inleiding
Nucleosiden/Nucleotiden zijn centrale metabolische componenten in alle levende organismen, die de voorlopers zijn van nucleïnezuren en veel co-enzymen, zoals nicotinamide adenine dinucleotide (NAD), en belangrijk bij de synthese van macromoleculen zoals fosfolipiden, glycolipiden en polysachariden. Structureel bevat nucleoside een nucleobase, die een adenine, guanine, uracil, cytosine of thymine kan zijn, en een suikeremoiety, die een ribose of een deoxyribose1,2kan zijn . Nucleotiden hebben maximaal drie fosfaatgroepen die zich binden aan de 5-koolstofpositie van de suikermoiety van de nucleosiden3. Het metabolisme van nucleotiden in planten is essentieel voor zaadkieming en bladgroei4,5,6. Om hun fysiologische rol in de ontwikkeling van planten beter te begrijpen, moeten de methoden voor de absolute kwantificering van verschillende nucleosiden/nucleotiden in vivo worden vastgesteld.
Een van de meest gebruikte benaderingen voor het meten van nucleosiden/nucleotiden maakt gebruik van een hoogwaardige vloeistofchromatografie (HPLC) in combinatie met een ultraviolet-zichtbare (UV-VIS) detector4,7,8,9,10,11. In 2013 kwantificeerden Dahncke en Witte met behulp van HPLC verschillende soorten nucleosiden in Arabidopsis thaliana7. Ze identificeerden een verhoogd guanosinegehalte in een T-DNA insertie mutant gericht op het guanosine deaminase gen in vergelijking met de wilde plant. Een andere pyrimidine nucleoside, cytidine, werd ook kwantitatief gedetecteerd in planten die deze methode gebruikten, wat resulteerde in de identificatie van een bonafide cytidine-deaminasegen4. Op basis van de UV-detector kan deze methode echter niet gemakkelijk de nucleosiden onderscheiden die vergelijkbare spectrums en retentietijden hebben, bijvoorbeeld guanosine of xanthosine. De detectielimiet van de HPLC-methode is relatief hoog en wordt daarom vaak gebruikt voor het meten van een hoog gehalte aan nucleosiden in vivo, zoals cytidine, uridine en guanosine.
Daarnaast kan gaschromatografie gekoppeld aan massaspectrometrie (GC-MS) ook worden gebruikt bij nucleosidemeting. Profiteer ervan, Hauck et. al. met succes uridine en urinezuur, een downstream metaboliet van nucleoside katabole route, in de zaden van A. thaliana12. GC wordt echter normaal gesproken gebruikt om vluchtige stoffen te scheiden, maar is niet geschikt voor de thermisch labiele stoffen. Daarom is een vloeistofchromatografie gekoppeld aan massaspectrometrie (LC-MS/MS) waarschijnlijk een meer geschikte en nauwkeurige analysetechniek voor de in vivo identificatie, scheiding en kwantificering van de nucleosiden/nucleotiden13,14. Verschillende eerdere studies meldden dat een HILIC-kolom kan worden gebruikt voor nucleosiden en nucleotidenscheiding15,16 en isotopisch gelabelde interne normen werden gebruikt voor de samengestelde kwantificering17. Beide componenten zijn echter relatief duur, vooral de commerciële normen met isotooplabel. Hier rapporteren we een economisch toepasbare LC-MS/MS-benadering voor nucleosiden/nucleotidenmeting. Deze methode is al met succes gebruikt voor de kwantificering van diverse nucleosiden/nucleotiden, waaronder ATP, N6-methyl-AMP, AMP, GMP, uridine, cytidine en pseudouridine1,5,6,18, in planten en Drosophila. Bovendien kan de methode die we hier rapporteren ook in andere organismen worden gebruikt.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1 De groei van de installatie en materialeninzameling
- Zorg ervoor dat Arabidopsis zaden gedurende 10 minuten worden gesteriliseerd in 70% ethanol en worden gezaaid op de agarplaten, die werden bereid met murashige- en Skoog-voedingsstoffen van halve sterkte.
- Incubeer de platen met Arabidopsis-zaden gedurende 48 uur onder donker bij 4 °C en breng ze vervolgens over in een gecontroleerde groeikamer onder 16 uur licht van 55 μmol m-2 s-1 bij 22 °C en 8 uur donker bij 20 °C.
- Oogst 100 mg zaailingen van 2 weken (vers gewicht) en vries in vloeibare stikstof voor metabolietextractie.
LET OP: Onderzoekers moeten op de juiste manier handschoenen, een beschermende bril en een laboratoriumjas dragen om besmetting van menselijk weefsel tijdens het verzamelen van materialen te voorkomen.
2 Nucleosiden/Nucleotiden extractie
- Gemalen 100 mg bevroren plantenweefsels met 7-8 stalen kralen in een voorverkoude mengmolen gedurende 5 minuten met een frequentie van 60 Hz.
- Bereid de extractieoplossing, die methanol, acetonitril en water bevat in een verhouding van 2:2:1.
- Resuspendeer de gehomogeniseerde materialen (inclusief de meeste metabolieten maar geen eiwitten) met 1 ml extractieoplossing.
- Centrifugeer de resulterende oplossing bij 12.000 x g gedurende 15 min bij 4 °C.
- Breng 0,5 ml van de suspensie over naar een nieuwe buis van 1,5 ml en vries de vloeibare stikstof in.
- Verdampt het bevroren monster in een vrieskleurstof en resuspend in 0,1 ml 5% acetonitril en 95% water.
- Centrifugeer de resulterende oplossing (0,1 ml) bij 40.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Plaats het supernatant in een flacon voor LC-MS/MS-meting.
3 LC-MS/MS meting
- Bereid een ammoniumacetaatbuffer van 10 mM door 1,1 g ammoniumacetaat op te lossen in 2 L dubbel gedeioneerd water (mobiele fase A). Stel de pH in op 9,5 bij 10% ammonium- en acetaatzuur.
- Bereid 2 L ultrapure 100% methanol (mobiele fase B1) voor op nucleosidenmeting. Bereid ook 2 L ultrapure 100% acetonitril (mobiele fase B2) voor voor nucleotidenmeting.
- Injecteer 0,02 ml voorbehandelde metabolietenextractie van elk monster uit stap 2.7 in een HPLC-systeem met binaire pompen (LC) in combinatie met een drievoudige viervoudige massaspectrometer (MS).
LET OP: HPLC-systeem maakt gebruik van een C18-kolom (50 x 4,6 mm, deeltjesgrootte 5 μm; werken bij 25 °C) buffering met mobiele fase A en B1 (Figuur 1A) voor de nucleosidenscheiding en gebruikt een poreuze grafitische koolstofkolom (PGC) (50 x 4,6 mm, deeltjesgrootte 5 μm; werken bij25°C) met mobiele fase A en B2. Elk monster werd drie keer geïnjecteerd voor de technische replicatie. - Programmeer de methode zoals weergegeven in tabel 1 voor de kolom C18 en de methode zoals weergegeven in tabel 2 voor de pgc-kolom. Stel een debiet in van 0,65 ml min-1.
OPMERKING: De massaovergangen (tabel 3) werden gecontroleerd door massaspectrometer. De massaspectrumanalyseomstandigheden van acht nucleosiden en vijf nucleotiden die canonieke en gewijzigde nucleotiden bevatten , zijn opgenomen in tabel 3. - Noteer de piekgebieden van elke doelverbinding (figuur 1).
4 Generatie van de standaard kalibratiecurven
- Pool zes monsterextracties samen, die werden geproduceerd volgens de beschrijving in sectie 2, en vortex het. Voer het vervolgens opnieuw naar zes extracties (hetzelfde volume) om elke achtergrond te krijgen.
- Voeg zes verschillende concentraties van elke norm toe aan deze zes extracties en injecteer ze één voor één na stap 3.3.
- Registreer de piekgebieden van elke norm in verschillende concentraties via de massaovergangen zoals beschreven in stap 3.4 en 3.5.
- Zet het piekgebied af tegen de nominale concentratie van elke norm om een zespuntscurve te genereren.
OPMERKING: De piekgebieden van nucleosiden/nucleotiden die in stap 3.5 zijn geregistreerd, moeten binnen het bereik van de standaardkalibratiecurven vallen. - Bereken de vergelijking van een rechte lijn voor elke standaardverbinding: Y = aX + b
5 Kwantificering van metabolieten
- Bereken de inhoud van de metabolieten met behulp van het piekgebied dat is geregistreerd in stap 3.5 en de vergelijking uit stap 4.5.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Hier tonen we de identificatie en kwantificering van N1-methyladenosine, een bekende gemodificeerde nucleoside, in 2 weken oude Arabidopsis wild type (Col-0) zaailingen als voorbeeld. Massaspectrometrieprofiel geeft aan dat de productionen die worden gegenereerd uit de N1-methyladenosinestandaard 150 m/z en 133 m/z (figuur 2A) zijn, en hetzelfde profiel wordt ook waargenomen bij Col-0-extractie (figuur 2B
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Organismen bevatten verschillende nucleosiden/nucleotiden, waaronder canonieke en afwijkende. De oorsprong en metabolische eindpunten ervan, vooral gemodificeerde nucleosiden, zijn echter nog steeds onduidelijk. Bovendien moet het huidige begrip van de functie en homeostase van het metabolisme van nucleosiden/nucleotiden nog worden onderzocht en uitgebreid. Om ze te onderzoeken, moet een nauwkeurige en gouden standaardmethode voor de identificatie en kwantificering van deze metabolieten worden gebruikt. Hier beschreven w...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenverstrengeling te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd financieel ondersteund door de Fundamental Research Funds for the Central Universities (KJQN202060), de National Natural Science Foundation of China (31900907), de Natural Science Foundation of Jiangsu Province (BK20190528), het International Centre for Genetic Engineering and Biotechnology (CRP/CHN20-04_EC) tot M.C., en de Fundamental Research Funds for the Central Universities (LGZD202004).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | 1000291000 | |
| adenosine | Sigma-Aldrich | A9251-1G | |
| ammonium acetate | Sigma-Aldrich | 73594-100G-F | |
| AMP | Sigma-Aldrich | 01930-5G | |
| CMP | Sigma-Aldrich | C1006-500MG | |
| cytidine | Sigma-Aldrich | C122106-1G | |
| GMP | Sigma-Aldrich | G8377-500MG | |
| guanosine | Sigma-Aldrich | G6752-1G | |
| Hypercarb column | Thermo Fisher Scientific GmbH | 35005-054630 | |
| IMP | Sigma-Aldrich | 57510-5G | |
| inosine | Sigma-Aldrich | I4125-1G | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860-1L-R | |
| N1-methyladenosine | Carbosynth | NM03697 | |
| O6-methylguanosine | Carbosynth | NM02922 | |
| Murashige and Skoog Medium | Duchefa Biochemie | M0255.005 | |
| Polaris 5 C18A column | Agilent Technologies | A2000050X046 | |
| pseudouridine | Carbosynth | NP11297 | |
| UMP | Sigma-Aldrich | U6375-1G | |
| uridine | Sigma-Aldrich | U3750-1G |
Referenties
- Liu, B., Winkler, F., Herde, M., Witte, C. -P., Großhans, J. A link between deoxyribonucleotide metabolites and embryonic cell-cycle control. Current Biology. 29 (7), 1187-1192 (2019).
- Zrenner, R., Stitt, M., Sonnewald, U., Boldt, R. Pyrimidine and purine biosynthesis and degradation in plants. Annual Review of Plant Biology. 57, 805-836 (2006).
- Witte, C. -P., Herde, M. Nucleotide metabolism in plants. Plant Physiology. 182 (1), 63-78 (2020).
- Chen, M., Herde, M., Witte, C. -P. Of the nine cytidine deaminase-like genes in Arabidopsis, eight are pseudogenes and only one is required to maintain pyrimidine homeostasis in vivo. Plant Physiology. 171 (2), 799-809 (2016).
- Chen, M., et al. m6A RNA degradation products are catabolized by an evolutionarily conserved N6-methyl-AMP deaminase in plant and mammalian cells. The Plant Cell. 30 (7), 1511-1522 (2018).
- Chen, M., Witte, C. -P. A kinase and a glycosylase catabolize pseudouridine in the peroxisome to prevent toxic pseudouridine monophosphate accumulation. The Plant Cell. 32 (3), 722-739 (2020).
- Dahncke, K., Witte, C. -P. Plant purine nucleoside catabolism employs a guanosine deaminase required for the generation of xanthosine in Arabidopsis. The Plant Cell. 25 (10), (2013).
- Jung, B., et al. Uridine-ribohydrolase is a key regulator in the uridine degradation pathway of Arabidopsis. The Plant Cell. 21 (3), 876-891 (2009).
- Jung, B., Hoffmann, C., Moehlmann, T. Arabidopsis nucleoside hydrolases involved in intracellular and extracellular degradation of purines. Plant Journal. 65 (5), 703-711 (2011).
- Riegler, H., Geserick, C., Zrenner, R. Arabidopsis thaliana nucleosidase mutants provide new insights into nucleoside degradation. New Phytologist. 191 (2), 349-359 (2011).
- Zrenner, R., et al. A functional analysis of the pyrimidine catabolic pathway in Arabidopsis. New Phytologist. 183 (1), 117-132 (2009).
- Hauck, O. K., et al. Uric acid accumulation in an Arabidopsis urate oxidase mutant impairs seedling establishment by blocking peroxisome maintenance. The Plant Cell. 26 (7), 3090-3100 (2014).
- Qu, C., et al. Comparative analysis of nucleosides, nucleobases, and amino acids in different parts of Angelicae Sinensis Radix by ultra high performance liquid chromatography coupled to triple quadrupole tandem mass spectrometry. Journal of Separation Science. 42 (6), 1122-1132 (2019).
- Zong, S. -Y., et al. Fast simultaneous determination of 13 nucleosides and nucleobases in Cordyceps sinensis by UHPLC-ESI-MS/MS. Molecules. 20 (12), 21816-21825 (2015).
- Moravcová, D., et al. Separation of nucleobases, nucleosides, and nucleotides using two zwitterionic silica-based monolithic capillary columns coupled with tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography. A. 1373, 90-96 (2014).
- Guo, S., et al. Hydrophilic interaction ultra-high performance liquid chromatography coupled with triple quadrupole mass spectrometry for determination of nucleotides, nucleosides and nucleobases in Ziziphus plants. Journal of Chromatography. A. 1301, 147-155 (2013).
- Seifar, R. M., et al. Simultaneous quantification of free nucleotides in complex biological samples using ion pair reversed phase liquid chromatography isotope dilution tandem mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 388 (2), 213-219 (2009).
- Baccolini, C., Witte, C. -P. AMP and GMP catabolism in Arabidopsis converge on xanthosine, which is degraded by a nucleoside hydrolase heterocomplex. The Plant Cell. 31 (3), 734-751 (2019).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
