Methodenartikel

Een uitgebreid zeer efficiënt protocol voor isolatie, kweek, polarisatie en glycolytische karakterisering van van beenmerg afgeleide macrofagen

DOI:

10.3791/61959

⸱

7 februari 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, College of Medicine, Texas A&M University Health Science Center, 2Department of Nutrition and Food Science, Texas A&M University, 3Artie McFerrin Department of Chemical Engineering, Texas A&M University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol biedt gedetailleerde en uitgebreide methoden voor de isolatie, kweek, polarisatie en meting van de glycolytische metabole toestand van levende beenmerg-afgeleide macrofagen (BMDM's). Dit document biedt stapsgewijze instructies met realistische visuele illustraties voor de workflow en glycolytische beoordeling van BMDM's in realtime.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Macrofagen behoren tot de belangrijkste antigeenpresenterende cellen. Veel subsets van macrofagen zijn geïdentificeerd met unieke metabole handtekeningen. Macrofagen worden gewoonlijk geclassificeerd als M1-achtige (inflammatoire) en M2-achtige (ontstekingsremmende) subtypes. M1-achtige macrofagen zijn pro-inflammatoire macrofagen die geactiveerd worden door LPS en/of pro-inflammatoire cytokines zoals INF-γ, IL-12 en IL-2. M1-achtige gepolariseerde macrofagen zijn betrokken bij verschillende ziekten door de afweer van de gastheer tegen een verscheidenheid aan bacteriën en virussen te bemiddelen. Dat is erg belangrijk om LPS-geïnduceerde M1-achtige macrofagen en hun metabole toestanden bij ontstekingsziekten te bestuderen. M2-achtige macrofagen worden beschouwd als ontstekingsremmende macrofagen, geactiveerd door ontstekingsremmende cytokines en stimulatoren. In de pro-inflammatoire toestand vertonen macrofagen een verhoogde glycolyse in de glycolytische functie. De glycolytische functie is actief onderzocht in de context van glycolyse, glycolytische capaciteit, glycolytische reserve, compenserende glycolyse of niet-glycolytische verzuring met behulp van extracellulaire flux (XF) analysatoren.

Dit artikel laat zien hoe de glycolytische toestanden in realtime kunnen worden beoordeeld met gemakkelijk te volgen stappen wanneer de van beenmerg afgeleide macrofagen (BMDM's) ademen, verbruiken en energie produceren. Door gebruik te maken van specifieke remmers en activatoren van glycolyse in dit protocol, laten we zien hoe we een systemisch en volledig beeld kunnen krijgen van glycolytische metabolische processen in de cellen en hoe we nauwkeurigere en realistischere resultaten kunnen opleveren. Om meerdere glycolytische fenotypes te kunnen meten, bieden we een eenvoudige, gevoelige, op DNA gebaseerde normalisatiemethode voor polarisatiebeoordeling van BMDM's. Kweek, activering/polarisatie en identificatie van het fenotype en de metabole toestand van de BMDM's zijn cruciale technieken die kunnen helpen om veel verschillende soorten ziekten te onderzoeken.

In dit artikel hebben we de naïeve M0-macrofagen gepolariseerd naar M1-achtige en M2-achtige macrofagen met respectievelijk LPS en IL4, en hebben we een uitgebreide set glycolytische parameters in BMDM's gemeten in real-time en longitudinaal in de tijd, met behulp van extracellulaire fluxanalyse en glycolytische activatoren en remmers.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Macrofagen zijn een van de meest kritische cellen van het aangeboren immuunsysteem, M1-achtig. Ze zijn betrokken bij het opruimen van infectieziekten, fagocytose, antigeenpresentatie en ontstekingsregulatie2. Bovendien zijn macrofagen nodig om andere immuuncellen te reguleren via verschillende cytokines die ze afgeven3. Er is een groot spectrum in macrofaag fenotypes4. Afhankelijk van de signalen waaraan macrofagen worden blootgesteld, polariseren ze naar verschillende ontstekings- en metabolische toestanden5. Macrofagen vertonen metabole veranderingen bij verschillende ziekten, afhankelijk van het weefsel waar de macrofagen zich bevinden6. Gepolariseerde macrofagen hebben het vermogen om hun glycolytisch metabolisme, lipidenmetabolisme, aminozuurmetabolisme en mitochondriale oxidatieve fosforylering (OXPHOS) te herprogrammeren of te veranderen7,8. Klassiek geactiveerde M1-achtige macrofagen en alternatief geactiveerde M2-achtige macrofagen zijn de twee meest bestudeerde fenotypes van macrofagen3. Niet-geactiveerde rustende macrofagen worden M0-macrofagen genoemd. Polarisatie van M0-macrofagen naar een M1-achtig fenotype kan worden geïnduceerd door stimulatie van naïeve BMDM's met bacteriële lipopolysaccharide (LPS)9. De PI3K-AKT-mTOR-HIF1a-signaalroute kan worden geactiveerd in macrofagen in aanwezigheid van inflammatoire cytokines, interferon-gamma (IFN γ) of tumornecrosefactor (TNF)10. M1-achtige macrofagen hebben verhoogde niveaus van glycolysemetabolisme, verlaagde niveaus van oxidatieve fosforylering (OXPHOS), waardoor inflammatoire cytokines worden geproduceerd die betrokken zijn bij infectie- en ontstekingsziekten8. Aan de andere kant kan polarisatie naar het M2-achtige fenotype worden geïnduceerd door interleukine (IL)-4, via de JAK-STAT-, PPAR- en AMPK-routes, of door (IL)-13 en TGFβ-pathays11,12.

In tegenstelling tot M1-achtige macrofagen hebben M2-achtige macrofagen een verminderde glycolyse en een verhoogde OXPHOS en zijn ze betrokken bij antiparasitaire en weefselherstelactiviteiten 8,13. BMDM's zijn een veelgebruikt systeem voor de studie van macrofagen die zijn afgeleid van beenmergstamcellen. Glycolyse en OXPHOS zijn de twee belangrijkste energieproductieroutes in de cellen14. Op basis van hun micro-omgeving kunnen BMDM's ervoor kiezen om een van deze routes te gebruiken; Schakel in sommige gevallen over van de ene naar de andere, of gebruik beide routes14. In deze studie hebben we ons gericht op het glycolysemetabolisme in geactiveerde pro-inflammatoire macrofagen. Wanneer de glucose in het cytoplasma wordt omgezet in pyruvaat en vervolgens lactaat, produceren de cellen protonen in het medium die een verhoging van de verzuringssnelheid veroorzaken in het omringende medium van M1-achtige cellen5. Een extracellulaire fluxanalysator werd gebruikt om de verzuringssnelheid van de celmedia te meten. De resultaten worden gerapporteerd als extracellulaire verzuringssnelheid (ECAR) of als protoneneffluxsnelheid.

Een geoptimaliseerde snelle en gemakkelijke methode om toegang te krijgen tot glycolyseniveaus in gepolariseerde macrofagen is essentieel om het glycolytische fenotype, metabolietveranderingen en de effecten van remmers/activatoren en geneesmiddelen op de gepolariseerde macrofagen te bepalen. De methode die in dit manuscript wordt beschreven, is geoptimaliseerd om informatie te geven over specifieke glycolysefactoren (glycolyse, glycolytische capaciteit, glycolytische reserve en niet-glycolytische verzuring), evenals de metabole herprogrammering van het glycolytische metabolisme. De remmer (2DG) die in dit onderzoek is gebruikt, richt zich expliciet op de glycolyseroute.

Dit geoptimaliseerde protocol is aangepast en verbeterd op basis van de combinatie van een gepubliceerd protocol16, extracellulaire fluxanalyse van glycolytische testen in de gebruikershandleidingen van de fabrikant en directe communicatie met R&D-wetenschappers van de fabrikant.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Muizen werden op humane wijze geofferd volgens de richtlijnen van de Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC) en de American Association for Laboratory Animal Science (AALAS) en met behulp van protocollen die zijn goedgekeurd door de institutionele commissie voor dierenverzorging en -gebruik van de Texas A & M University (IACUC).

1. Oogst van beenmerg bij muizen en cultuur van BMDM's

  1. Offer de muis (6-10 weken oud C57Bl/6 muizen zaten in dit protocol) en leg hem op zijn buikzijde, snijd de huid en peritoneale laag af en pel voorzichtig de poten af.
    OPMERKING: Gebruik blootstelling aan CO2 -gas om de muis te euthanaseren.
  2. Scheid beide achterpoten van de heup naar beneden en zorg ervoor dat u het bot niet snijdt.
  3. Plaats het hele been in een lege conische buis van 50 ml (met de voeten naar boven om later gemakkelijk vast te kunnen trekken) op ijs en ga verder met het oogsten van beide benen van de muis.

2. Blootstelling aan het dijbeen

NOTITIE: Voer de volgende stappen uit in een bioveiligheidskast.

  1. Oogst het dijbeen door het scheenbeen van elk been af te knippen en verwijder zoveel mogelijk weefsel rond het dijbeen met een schaar en laboratoriumpapier.
  2. Plaats de geoogste, "gereinigde" dijbenen op een plaat van 10 cm met daarin een stuk laboratoriumpapier dat verzadigd is met weefselkweekmedium (TC) of PBS. Leg ze op ijs.
  3. Ga door met het oogsten van dijbenen en het verwijderen van weefsel uit alle dijbenen voordat u overgaat tot de spoelfase (Figuur 1A).

3. Merg spoeling

  1. Om merg uit dijbenen te spoelen, gebruikt u een spuit van 3 ml gevuld met TC medium of PBS met een 23G-naald. Vul de spuit voordat u het merg blootlegt.
  2. Gebruik een schaar om het merg bloot te leggen door het uiteinde van het dijbeen bij beide epifysen af te knippen.
  3. Steek de naaldpunt in het dijbeen en spoel het merg voorzichtig uit in een schaal van 10 cm.
  4. Ga met de naald over de gehele lengte van het dijbeen en spoel totdat de botkleur wit wordt. Gewoonlijk kan het meeste merg worden weggespoeld met 2-3 ml media.
  5. Spoel alle dijbenen en het beenmerg in de schaal. Gebruik een naald om eventuele zichtbare klonten te breken. Zeef het merg in een conische buis van 50 ml (figuur 1A).

4. RBC-lysis

  1. Draai het merg 10 minuten op 190 x g. Aspiratie van het bovenlevende.
  2. Resuspendeer de pellet in 4 ml ACK-lysisbuffer met een pipet. Laat de RBC-lysisbuffer 5 minuten inwerken bij kamertemperatuur.
  3. Voeg 4 ml TC medium RPMI-C 10% (RPMI 1640 -GlutaMAX) aangevuld met 2-mercaptoethanol, gentamicine, streptomycine en 10% FCS toe aan de mergsuspensie en draai gedurende 10 minuten op 1300 x g.
  4. Zeef opnieuw om RBC-vuil te verwijderen en suspendeer opnieuw in een kleine hoeveelheid RPMI-C 10% om te tellen.
  5. Tel cellen met een cellenteller (Figuur 1B). Een Vi-Cell Counter werd gebruikt om het aantal en de levensvatbaarheid van cellen in de suspensie te bepalen.

5. Plating en cultuur

  1. Voeg 10 ml RPMI-C 10% + 10 ng/ml m-csf (Macrophage Colony Stimulating Factor, een essentiële regulator van de proliferatie, differentiatie en overleving van monocyten/macrofagen) toe aan zoveel platen van 10 cm als gewenst.
  2. Voeg een passend aantal getelde cellen toe, zodat elke plaat van 10 cm 1 x 106 cellen bevat. Plaats de platen in een broedmachine van 37 °C (gedefinieerd als dag 0).
  3. Voeg op dag 3 voorzichtig 5 ml verse RPMI-C 10% + 10 ng/ml m-CSF toe aan elke plaat.
    OPMERKING: Op dag 7 moeten BMDM's klaar zijn om te worden getest (Figuur 1C).

6. Oogst van borden

  1. Gebruik een lichtmicroscoop om te bevestigen dat de meeste cellen zich aan platen hebben gehecht.
  2. Zuig media voorzichtig aan. Voeg vervolgens 3 ml PBS toe en draai de plaat voorzichtig rond. Zuig dit goed op om eventuele resterende niet-aanhangende cellen te verwijderen.
  3. Voeg 7-10 ml koude PBS toe aan de plaat, gebruik een P1000-pipet om de bodem van de platen te wassen en oogst alle resterende cellen in een opvangbuis.
    OPMERKING: Houd de buisjes op ijs, want macrofagen hechten zeer goed en hechten zich aan de binnenkant van de buis. Als de cellen koud zouden blijven, zouden ze minder goed hechten.
  4. Centrifuge-, tel- en plaatcellen voor experimenten (Figuur 1D). Met behulp van flowcytometrie zouden de resulterende cellen >95% positief moeten zijn voor CD11b en F4/80. (macrofaagpolarisatie werd bepaald door kleuring met M1-achtige markers van CD38, TNF-a en MCP-1 en M2-achtige marker van CD206.
    NOTITIE: Voer stap 6.1-6.3 uit in de bioveiligheidskast en voer stap 6.4 uit op het werkblad. Handhaaf aseptische technieken tijdens de procedure.

figure-protocol-1
Figuur 1: Grafische workflow van beenmergcultuur bij muizen van BM-afgeleide macrofagen. (A) Beenoogst, blootstelling aan dijbeen en mergspoeling; b) RBC-lysis; (C) Beplating en cultuur; (D) Celoogst van de platen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

7. De dag voor de metabole fluxanalyser-test: zaaien en polariseren van de cellen voor de glycolytische test

  1. Warm de Metabolic Flux Analyzer op tot 37 °C door het instrument aan te zetten.
  2. Hydrateer een patroon door 200 μl van een kalibrantoplossing toe te voegen en incubeer de patroon een nacht in een niet-CO2 -incubator (Figuur 2A). De vochtigheid van de CO2 -vrije incubator is niet belangrijk voor de hydratatie van de patroon.
    1. Dompel de plaat een uur voor het experiment een paar keer op en neer, dit zal helpen om luchtbellen te verwijderen.
  3. Ontwerp de plaatkaart op de software in de standaard glycolyse-stresstest-acute injectie, door de instructies van de test te volgen.
    1. Klik op het softwarepictogram en klik vervolgens op Glycolyse stress-acute injectietest. Genereer groepsnamen op het pictogram voor groepsdefinitie.
  4. Er zijn vijf meetcycli met een duur van 18 minuten en vier injecties. Verander de injectie van poort A naar glucose, poort B naar oligomycine, poort C naar rotenon en antimycine A (Rot/AA) en poort D naar 2DG.
  5. Resuspendeer de cellen in RPMI-C 10% medium en zaai 50k cellen per putje, behalve de vier randen van de plaat (A1, A12, H1 en H12; Voeg alleen media toe, geen cellen) in een microplaat van de Metabolic Flux Analyzer tot een eindvolume van 100 μL. Normaal gesproken zijn er minimaal 40k cellen nodig om deze test uit te voeren.
  6. Laat de cellen 45 minuten op kamertemperatuur staan om het randeffect van de cellen te voorkomen. Het randeffect is wanneer het medium rond de omtrek van de plaat gedeeltelijk verdampt, wat volume- en concentratieveranderingen veroorzaakt en de levensvatbaarheid van de cel vermindert.
  7. Voeg 10 ng/ml LPS toe om de naïeve macrofagen te polariseren naar M1-achtige cellen en voeg 20 ng/ml IL-4 toe om ze te polariseren naar M2-achtige cellen. Gebruik minimaal 3 tot 6 putjes per toestand (Figuur 2B).
  8. Controleer de cellen onder de microscoop en plaats de plaat gedurende 24 uur in een broedmachine bij 37 °C en 5% CO2 .

figure-protocol-2
Figuur 2: Grafische demonstratie van het zaaien en polariseren van de cellen. (A) Opstelling van de extracellulaire fluxanalysator en hydratatie van de cartridge; (B) Polarisatie van de cellen en nachtelijke incubatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

8. Dag van de analyse: XF Medium en samengestelde voorbereiding

  1. Vul 100 ml XF RPMI (pH 7,4) analysemedium aan met 2 mM glutamine.
  2. Filter en steriliseer de media met behulp van een vacuümfiltersysteem van 0,2 μm.
  3. Plaats het analysemedium gedurende 20 minuten in een waterbad van 37°C.
  4. Verwijder de geplateerde cellen uit de 37 °C, 5% CO2 -incubator. Was de cellen twee keer met analysemedia en vervang de vorige media door testmedia tot het uiteindelijke volume van 180 μl.
  5. Gebruik een microscoop om er zeker van te zijn dat alle putjes confluente cellen hebben en markeer alle putjes die krassen van pipetteren hebben. Als er krassen zijn, verwijder dan die plaat voordat u deze analyseert.
  6. Plaats de celhoudende plaat gedurende 45 minuten in een CO2 -vrije broedmachine (Figuur 3A).
  7. Gebruik van de verbindingen en de analysemedia om stockoplossingen van glucose (100 mM), oligomycine (100 μM), Rot/AA (50 μM) en 2DG (500 mM) te maken (Tabel 1).
  8. Maak een 10x injectiemengsel van elke verbinding met behulp van analysemedia (tabel 2).
Injectievoorraden (meegeleverd in de kits)Voeg complete analysemedia (ml) toeFinale voorraadconcentratie (μM)
Glucose3100K
Oligomycine0.72100
2-DG3100k

Tabel 1. Injectie voorraden

Poorten op de cartridgeVoorraad oplossingenVoorraadvolume toevoegenAnalysemedia toevoegenEindconcentratie van injecties (10x)Voeg dit volume toe aan de aangewezen poort (μL)Eindconcentratie na injectie in elk putje
EenGlucose (100 mM)3000 μL + 0 μL100 mM2010 mM
BOligomycine (100 μM)300 μL + 2700 μL10 μM221,0 μM
CRotenon/ Antimycine A (50 μM)300 μL + 2700 μL5 μM250,5 μM
D2-DG (500 mM)300 μL + 0 μL500 mM2850 mM

Tabel 2. Uiteindelijke injectieconcentraties

9. Dag van de test: Uitvoeren van de acute glycolytische test op gepolariseerde macrofagen

  1. Open de opgeslagen sjabloon voor glycolyse-stresstest (acute injectie) vanuit de software. De standaard acute glyco-stresstest heeft 3 minuten mengen en meten voor elke injectie.
  2. Controleer de sjabloon en de testdetails en wanneer u klaar bent, klikt u op Uitvoeren en volgt u de instructies van de standaardtest. Alle parameters kunnen echter worden aangepast.
  3. Verwijder de sensorcartridge uit de CO2 -vrije couveuse, verwijder het deksel en plaats het instrument zo in dat de A1-opening van de cartridgeplaat in de linkerbovenhoek van het insteekpaneel van de machine valt. Meestal duurt de kalibratie tussen de 20 en 45 minuten.
  4. Nadat de kalibratie is voltooid, werpt het apparaat de plaat met de kalibrerende oplossing uit en houdt het de sensorcartridge vast. Verwijder het kalibrant met de plaat.
  5. Verwijder de celplaat van de CO2 -vrije broedmachine, verwijder het plaatdeksel en plaats deze in de machine. Klik op Uitvoeren (Figuur 3B).
  6. Wanneer de test is voltooid, zal de machine de celplaat en de sensorcartridge uitwerpen.
  7. Verwijder de media van de plaat en vries deze in bij -20 °C voor verdere normalisatie.
  8. Gebruik de in de handel verkrijgbare celproliferatietestkit (bijv. CyQUANT) voor het normaliseren van de cellen.
  9. Voeg 1 ml verbinding B of lysisbuffer toe aan 19 ml nucleasevrij gedestilleerd water.
  10. Voeg 100 μL werkoplossing van Verbinding A of GR toe aan de bovengenoemde oplossing.
  11. Zorg ervoor dat de cellen in de plaat ontdooid zijn en voeg dan 200 μL van de oplossing toe aan elk putje.
  12. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT).
  13. Meet de fluorescentie in 480 nm excitatie en 520 nm emissiegolflengten met behulp van een plaatlezer.
  14. Normaliseer de cellen op het normalisatiepaneel van de software.
  15. Normaliseer cellen op basis van naïeve macrofagen celtelling (Figuur 3C). Beschouw het gemiddelde van de naïeve macrofagen als 1 (door het celaantal van elk putje te delen door het gemiddelde celaantal naïeve macrofagen) en pas ze toe op alle macrofagen.

figure-protocol-3
Figuur 3: Dag van de test: bereiding van het medium en de verbinding en uitvoering van de test. A) Voorbereiding van de cellen voor de test; (B) Voorbereiding, kalibratie en uitvoering van de test van verbindingen; (C) Normalisatie en gegevensanalyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Glycolyse en mitochondriale oxidatieve fosforylering zijn de twee belangrijkste ATP-productieroutes in de cellen (Figuur 4A). Sommige cellen hebben het vermogen om tussen deze twee routes te schakelen om aan hun energiebehoefte te voldoen. De omzetting van glucose in pyruvaat in het cytoplasma wordt glycolyse genoemd. Pyruvaat heeft twee lotsbestemmingen; het wordt ofwel omgezet in lactaat of verder gemetaboliseerd via de TCA...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zoals eerder vermeld, kan de extracellulaire fluxanalysator real-time informatie verstrekken over twee belangrijke energieproducerende routes van de cellen door OCR (zuurstofverbruik), een indicator van mitochondriale OXPHOS-activiteit en ECAR (extracellulaire verzuringssnelheid) te meten, wat een indicator is van glycolyse. Macrofagen kunnen beide routes gebruiken, afhankelijk van hun micro-omgeving. Ze kunnen ook hun energieproductiepad omschakelen 17,18

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We danken mevrouw Joanna Rocha voor redactionele hulp. Het werk werd gedeeltelijk ondersteund door de National Institutes of Health (NIH) R01DK118334 (aan Drs. Sun en Alaniz) en (NIH) R01A11064Z (aan Drs. Jayaraman en Alaniz).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
23G naaldenVWRBD305145
2-mercaptoethanolLife Technologies21985023
50ml Conische buisVWR21008-951
ACK lysis bufferThermo Fisher ScientificA1049201Kan in het laboratorium worden gemaakt
Agilent Seahorse XF glycolyse stresstestkitAgilent Technologies103020-100
Agilent Seahorse XF Glycolysis Stress Test Kit GebruikershandleidingAgilent Technologies103020-400
Agilent Seahorse XF Glycolytic Rate Assay KitAgilent Technologies103344-100
Agilent Seahorse XF Glycolytic Rate Assay Kit GebruikershandleidingAgilent Technologies103344-100
Alexa Fluor 488 anti-muis CD206 (MMR) AntilichaamBioLegend141710
anti-muis CD11b eFluor450 100ugeBioscience48-0112-82
BD 3ML - SPRUITVWRBD309657Ook andere spuiten zijn acceptabel
Celteller-Vi-CELL- XR Compleet SysteemBECKMAN COULTER Life Sciences731050Cellen kunnen ook handmatig worden geteld
Celzeef-70µmVWR10199-656
CyQUANT Celproliferatie Assay KitThermo Fisher ScientificC7026
F4/80 monoklonaal antilichaam (BM8) pe-Cyanine7eBioscience25-4801-82
Fetaal bovien serumLife Technologies16000-044
Flowcytometer: BD LSFRFortessa X-20BD656385
Kim WipesVWR82003-822
LPS-SM ultrapuur (tlrl-smpls) 5 mgInvivogentlrl-smlps
MCSFPeprotech315-02
Murine IL-4Peprotech214-14
PE Rat Anti-Muis CD38BD Biosciences553764
Penicilline-Streptomycine (10.000 U/mL)Life Technologies15140122
Petrischaal 100mm x 15 mmFisher ScientificF80875712
RPMI, Glutamax, HEPESInvitrogen72400-120
Seahorse Calibrant OplossingAgilent Technologies103059-000
Seahorse XF 200mM Glutamine OplossingAgilent Technologies103579-100
Seahorse XF Glycolytic Rate Assay KitAgilent Technologies103344-100
Seahorse XFe96 FluxPaksAgilent Technologies102416-100
XF Glycolysis Stress Test KitAgilent Technologies103020-100
XF RPMI Medium, pH 7.4 zonder fenol RoodAgilent Technologies103336-100

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rosowski, E. E. Determining macrophage versus neutrophil contributions to innate immunity using larval zebrafish. Disease Models & Mechanisms. 13 (1), (2020).
  2. Martinez-Pomares, L., Gordon, S. The Autoimmune Diseases. , Elsevier. 191-212 (2020).
  3. Orecchioni, M., Ghosheh, Y., Pramod, A. B., Ley, K. Macrophage polarization: different gene signatures in M1 (LPS+) vs. classically and M2- (LPS–) vs. alternatively activated macrophages. Frontiers in immunology. 10, 1084(2019).
  4. Barrett, T. J. Macrophages in atherosclerosis regression. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 40 (1), 20-33 (2020).
  5. Ni, Y., et al. Adipose tissue macrophage phenotypes and characteristics: the key to insulin resistance in obesity and metabolic disorders. Obesity. 28 (2), 225-234 (2020).
  6. Chu, C., et al. Modulation of foreign body reaction and macrophage phenotypes concerning microenvironment. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 108 (1), 127-135 (2020).
  7. Batista-Gonzalez, A., Vidal, R., Criollo, A., Carreño, L. J. New insights on the role of lipid metabolism in the metabolic reprogramming of macrophages. Frontiers in Immunology. 10, 2993(2020).
  8. Kang, S., Kumanogoh, A. The spectrum of macrophage activation by immunometabolism. International Immunology. , (2020).
  9. Shi, Y., et al. M1 But Not M0 Extracellular Vesicles Induce Polarization of RAW264. 7 Macrophages Via the TLR4-NFκB Pathway In Vitro. Inflammation. , 1-9 (2020).
  10. Zhang, L., Li, S. Lactic acid promotes macrophage polarization through MCT-HIF1α signaling in gastric cancer. Experimental Cell Research. 388 (2), 111846(2020).
  11. Geng, T., et al. CD137 signaling induces macrophage M2 polarization in atherosclerosis through STAT6/PPARδ pathway. Cellular Signalling. , 109628(2020).
  12. Liu, Q., et al. Combined blockade of TGf-β1 and GM-CSF improves chemotherapeutic effects for pancreatic cancer by modulating tumor microenvironment. Cancer Immunology & Immunotherapy. , 1-16 (2020).
  13. Rigoni, T. S., et al. RANK Ligand Helps Immunity to Leishmania major by Skewing M2 Into M1 Macrophages. Frontiers in Immunology. 11, 886(2020).
  14. Viola, A., Munari, F., Sánchez-Rodríguez, R., Scolaro, T., Castegna, A. The metabolic signature of macrophage responses. Frontiers in Immunology. 10, (2019).
  15. Ivashkiv, L. B. The hypoxia–lactate axis tempers inflammation. Nature Reviews Immunology. 20 (2), 85-86 (2020).
  16. Van den Bossche, J., Baardman, J., de Winther, M. P. Metabolic characterization of polarized M1 and M2 bone marrow-derived macrophages using real-time extracellular flux analysis. Journal of Visualized Experiments. (105), e53424(2015).
  17. Van den Bossche, J., et al. Mitochondrial dysfunction prevents repolarization of inflammatory macrophages. Cell reports. 17 (3), 684-696 (2016).
  18. Liu, P. S., Ho, P. C. Metabolic Signaling. , Springer. 173-186 (2019).
  19. Wang, F., et al. Glycolytic stimulation is not a requirement for M2 macrophage differentiation. Cell metabolism. 28 (3), 463-475 (2018).
  20. Romero, N., Rogers, G., Neilson, A., Dranka, B. Quantifying Cellular ATP Production Rate Using Agilent Seahorse XF Technology. , Agilent Technologies, Inc. (2018).
  21. Mookerjee, S. A., Brand, M. D. Measurement and analysis of extracellular acid production to determine glycolytic rate. Journal of Visualized Experiments. (106), e53464(2015).
  22. Mookerjee, S. A., Goncalves, R. L., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. The contributions of respiration and glycolysis to extracellular acid production. Biochimica Et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1847 (2), 171-181 (2015).
  23. Yang, S., et al. Macrophage polarization in atherosclerosis. Clinica Chimica Acta. 501, 142-146 (2020).
  24. Hörhold, F., et al. Reprogramming of macrophages employing gene regulatory and metabolic network models. PLoS Computational Biology. 16 (2), e1007657(2020).
  25. Han, X., Ma, W., Zhu, Y., Sun, X., Liu, N. Advanced glycation end products enhance macrophage polarization to the M1 phenotype via the HIF-1α/PDK4 pathway. Molecular and Cellular Endocrinology. , 110878(2020).
  26. Müller, E., et al. Toll-like receptor ligands and interferon-γ synergize for induction of antitumor M1 macrophages. Frontiers in Immunology. 8, 1383(2017).
  27. Soto-Heredero, G., Gómez de las Heras, M. M., Gabandé-Rodríguez, E., Oller, J., Mittelbrunn, M. Glycolysis–a key player in the inflammatory response. The FEBS Journal. , (2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

M1 like Macrophage PolarizationM2 like Macrophage PolarizationExtracellular Flux AnalysisDNA based NormalizationMacrophage Culture ProtocolLPS ActivationIL4 StimulationMetabolic Phenotyping
Video binnenkort beschikbaar

Gerelateerde artikelen