Een uitgebreid zeer efficiënt protocol voor isolatie, kweek, polarisatie en glycolytische karakterisering van van beenmerg afgeleide macrofagen

Sahar Eshghjoo; Da Mi Kim; Arul Jayaraman; Yuxiang Sun; Robert C. Alaniz

doi:10.3791/61959

Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Een uitgebreid zeer efficiënt protocol voor isolatie, kweek, polarisatie en glycolytische karakterisering van van beenmerg afgeleide macrofagen

4.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/61959

⸱

7 februari 2021

Sahar Eshghjoo¹ , Da Mi Kim² , Arul Jayaraman¹^,³ , Yuxiang Sun² , Robert C. Alaniz¹

¹Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, College of Medicine, Texas A&M University Health Science Center, ²Department of Nutrition and Food Science, Texas A&M University, ³Artie McFerrin Department of Chemical Engineering, Texas A&M University

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol biedt gedetailleerde en uitgebreide methoden voor de isolatie, kweek, polarisatie en meting van de glycolytische metabole toestand van levende beenmerg-afgeleide macrofagen (BMDM's). Dit document biedt stapsgewijze instructies met realistische visuele illustraties voor de workflow en glycolytische beoordeling van BMDM's in realtime.

Samenvatting

Macrofagen behoren tot de belangrijkste antigeenpresenterende cellen. Veel subsets van macrofagen zijn geïdentificeerd met unieke metabole handtekeningen. Macrofagen worden gewoonlijk geclassificeerd als M1-achtige (inflammatoire) en M2-achtige (ontstekingsremmende) subtypes. M1-achtige macrofagen zijn pro-inflammatoire macrofagen die geactiveerd worden door LPS en/of pro-inflammatoire cytokines zoals INF-γ, IL-12 en IL-2. M1-achtige gepolariseerde macrofagen zijn betrokken bij verschillende ziekten door de afweer van de gastheer tegen een verscheidenheid aan bacteriën en virussen te bemiddelen. Dat is erg belangrijk om LPS-geïnduceerde M1-achtige macrofagen en hun metabole toestanden bij ontstekingsziekten te bestuderen. M2-achtige macrofagen worden beschouwd als ontstekingsremmende macrofagen, geactiveerd door ontstekingsremmende cytokines en stimulatoren. In de pro-inflammatoire toestand vertonen macrofagen een verhoogde glycolyse in de glycolytische functie. De glycolytische functie is actief onderzocht in de context van glycolyse, glycolytische capaciteit, glycolytische reserve, compenserende glycolyse of niet-glycolytische verzuring met behulp van extracellulaire flux (XF) analysatoren.

Dit artikel laat zien hoe de glycolytische toestanden in realtime kunnen worden beoordeeld met gemakkelijk te volgen stappen wanneer de van beenmerg afgeleide macrofagen (BMDM's) ademen, verbruiken en energie produceren. Door gebruik te maken van specifieke remmers en activatoren van glycolyse in dit protocol, laten we zien hoe we een systemisch en volledig beeld kunnen krijgen van glycolytische metabolische processen in de cellen en hoe we nauwkeurigere en realistischere resultaten kunnen opleveren. Om meerdere glycolytische fenotypes te kunnen meten, bieden we een eenvoudige, gevoelige, op DNA gebaseerde normalisatiemethode voor polarisatiebeoordeling van BMDM's. Kweek, activering/polarisatie en identificatie van het fenotype en de metabole toestand van de BMDM's zijn cruciale technieken die kunnen helpen om veel verschillende soorten ziekten te onderzoeken.

In dit artikel hebben we de naïeve M0-macrofagen gepolariseerd naar M1-achtige en M2-achtige macrofagen met respectievelijk LPS en IL4, en hebben we een uitgebreide set glycolytische parameters in BMDM's gemeten in real-time en longitudinaal in de tijd, met behulp van extracellulaire fluxanalyse en glycolytische activatoren en remmers.

Inleiding

Macrofagen zijn een van de meest kritische cellen van het aangeboren immuunsysteem, M1-achtig. Ze zijn betrokken bij het opruimen van infectieziekten, fagocytose, antigeenpresentatie en ontstekingsregulatie². Bovendien zijn macrofagen nodig om andere immuuncellen te reguleren via verschillende cytokines die ze afgeven³. Er is een groot spectrum in macrofaag fenotypes⁴. Afhankelijk van de signalen waaraan macrofagen worden blootgesteld, polariseren ze naar verschillende ontstekings- en metabolische toestanden⁵. Macrofagen vertonen metabole v....