Methodenartikel

Vruchtbaarheidsbehoud door oöcyt vitrificatie: klinische en laboratoriumperspectieven

6.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/61963

⸱

16 september 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Clinica Valle Giulia, GeneraLife IVF

In dit artikel

Samenvatting

Oöcyt cryopreservatie wordt erkend door verschillende internationale wetenschappelijke verenigingen als de gouden standaard voor vruchtbaarheidsbehoud bij postpubertale vrouwen. De aangewezen klinische en laboratoriumstrategieën verzekeren maximumeffectiviteit, efficiency, en veiligheid van vruchtbaarheidsbehoudsbehandelingen.

Samenvatting

Het behoud van de vruchtbaarheid van vrouwen is cruciaal in een multifunctioneel gezondheidszorgsysteem dat zorgt voor de toekomstige kwaliteit van leven van patiënten. Oöcyt cryopreservatie wordt erkend door verschillende internationale wetenschappelijke verenigingen als de gouden standaard voor vruchtbaarheidsbehoud bij postpubertale vrouwen, voor zowel medische als niet-medische indicaties. De belangrijkste medische indicaties zijn oncologische ziekten, gynaecologische ziekten zoals ernstige endometriose, systemische ziekten die de eierstokreserve in gevaar brengen en genetische aandoeningen met voortijdige menopauze. Dit document beschrijft het gehele klinische en laboratoriumwerk van een behandeling van het vruchtbaarheidsbehoud door aanbevelingen voor objectieve en bewijsmateriaal-gebaseerde begeleiding te beschrijven. Bovendien richt het zich op de effectiviteit van de procedure en beschrijft het de meest geschikte strategieën om de ovariële reserve volledig te benutten en het aantal teruggewonnen oöcyten in de kortst mogelijke tijd te maximaliseren. De evaluatie van de ovariële reserve, de definitie van een ideaal stimulatieprotocol, evenals het ophalen van oöcyten, denudatie en vitrificatieprocedures zijn gedetailleerd, samen met benaderingen om hun effectiviteit, efficiëntie en veiligheid te maximaliseren.

Inleiding

De ontwikkeling en implementatie van een efficiënt cryopreservatieprogramma voor menselijke oöcyten is een belangrijke doorbraak geweest in de reproductieve geneeskunde. Volgens recent bewijs is vitrificatie de meest effectieve strategie om cryopreserve metaphase II (MII) oöcyten te cryopreserve, omdat het resulteert in statistisch hogere overlevingspercentages in vergelijking met langzaam bevriezen, onafhankelijk van de patiëntenpopulatie (onvruchtbare patiënten of oöcytdonatieprogramma)1,2,3. De opmerkelijke verwezenlijkingen van oöcyt vitrification leidden de Praktijkcommissies van de Amerikaanse Maatschappij voor Reproductieve Geneeskunde (ASRM) en de Maatschappij voor Geassisteerde Reproductieve Technologie (SART) om deze techniek uit te spreken om het meest efficiënt voor electieve vruchtbaarheidsbehoud in postpubertal vrouwen, voor zowel medische als niet-medische aanwijzingen4,5,6uit te spreken . Medische indicaties voor vruchtbaarheidsbehoud omvatten (i) kanker en auto-immuunziekten die therapieën7 vereisen, zoals radiotherapie, cytotoxische chemotherapie en endocriene therapie (waarvan het schadelijke effect op de eierstokreserve geassocieerd is met de leeftijd van de moeder, evenals het type en de dosis van de behandeling); ii) eierstokaandoeningen waarvoor herhaalde of radicale chirurgie nodig is (zoals endometriose)8; en iii) genetische aandoeningen (bijv. X-fragile) of voortijdig eierstokfalen. Bovendien is vruchtbaarheidsbehoud een waardevolle optie geworden voor alle vrouwen die hun ouderlijke doelstelling om niet-medische redenen (ook bekend als sociale bevriezing) niet hebben bereikt.

Ongeacht de indicatie voor vruchtbaarheidsbehoud en volgens de belangrijkste internationale richtlijnen voor vruchtbaarheidsbehoud, moeten alle patiënten die bereid zijn hun oöcyten te vitriferen, passende begeleiding krijgen om te worden geïnformeerd over hun realistische kans op succes, de kosten, risico's en beperkingen van de procedure9,10,11,12,13. Het belangrijkste is dat het duidelijk moet zijn dat het vitrificeren van een cohort MII-oöcyten geen zwangerschap garandeert, maar dat het een grotere kans van slagen biedt voor toekomstige in-vitrofertilisatiebehandeling (IVF), indien nodig14. In dit opzicht is de leeftijd van de vrouw op het moment van oöcyt vitrificatie zeker de belangrijkste beperkende factor15, aangezien gevorderde moederleeftijd (AMA; >35 jaar) de belangrijkste oorzaak is van vrouwelijke onvruchtbaarheid16. Naast een progressieve vermindering van de ovariële reserve, ama wordt geassocieerd met een aantasting van oöcyt competentie als gevolg van defecte fysiologische paden zoals metabolisme, epigenetische regulatie, celcyclus checkpoints, en meiotische segregatie17. Daarom hangt het redelijke aantal eieren tot vitrify voornamelijk af van de leeftijd van de moeder. Bij vrouwen jonger dan 36 jaar zijn ten minste 8-10 MII-oöcyten18 nodig om de kans op succes te maximaliseren. Over het algemeen geldt: hoe hoger het aantal verglaasde oöcyten, hoe groter de kans op succes. Daarom is het aanpassen van ovariële stimulatie op basis van ovariële reservemarkers zoals anti-Mülleriaanse hormoonspiegels (AMH) of antrale follikeltelling (AFC) cruciaal om de ovariële reserve in de kortst mogelijke tijd volledig te benutten.

De veiligheid van de gehele procedure is het andere belangrijke punt bij het inschrijven van patiënten voor vruchtbaarheidsbehoud. Clinici moeten de beste strategieën gebruiken om de risico's te minimaliseren en (i)ovariële hyperstimulatiesyndroom (OHSS) te voorkomen door veilige benaderingen te gebruiken, zoals het gonadotrofine-releasing hormone (GnRH) antagonistprotocol gevolgd door een GnRH-agonist trigger19 en (ii) het afgelegen, maar mogelijk, risico op peritoneale bloedingen, letsel aan de bekkenstructuren (ureter, darm, appendix, zenuwen) of bekkeninfectie tijdens het ophalen van oöcyten. Ten slotte worden (iii) traditionele stimulatieschema's geassocieerd met suprafysiologisch serumestradiol en worden daarom niet aanbevolen bij oestrogeengevoelige ziekten zoals borstkanker. Protocollen met aromataseremmers (zoals letrozol of tamoxifen) zijn in deze gevallen geschikter20,21. In de laboratoriumomgeving is het meest wijdverspreide protocol voor oöcyt vitrificatie nog steeds het protocol dat voor het eerst werd beschreven door Kuwayama en collega's2,23, dat bestaat uit een stapsgewijze procedure waarbij cryoprotectiva (CPA's) geleidelijk worden toegevoegd. In de eerste fase (evenwicht/uitdroging) worden oöcyten blootgesteld in een CPA-oplossing die 7,5% v/v ethyleenglycol en 7,5% v/v dimethylsulfoxide (DMSO) bevat, terwijl in de tweede fase oöcyten worden verplaatst naar een vitrificatieoplossing met 15% v/v ethyleenglycol en 15% v/v DMSO, plus 0,5 mol/L-sucrose. Na een korte incubatie in het medium vitrificatie kunnen de oöcyten in speciaal ontworpen, open cryodevicen worden geplaatst en uiteindelijk in vloeibare stikstof bij -196 °C worden gedompeld om tot gebruik te worden opgeslagen.

Hier is het gehele klinische en laboratoriumwerk van een vruchtbaarheidsbehoudsbehandeling beschreven door (i) aanbevelingen voor objectieve en evidence-based counseling, (ii) gericht op de kosteneffectiviteit van de procedure, en (iii) het beschrijven van de meest geschikte strategieën om de ovariële reserve volledig te benutten en het aantal teruggewonnen oöcyten in de kortst mogelijke tijd te maximaliseren. De evaluatie van de ovariële reserve, de definitie van een ideaal stimulatieprotocol, evenals het ophalen van oöcyten, denudatie en vitrificatieprocedures zullen worden gedetailleerd, samen met benaderingen om hun effectiviteit, efficiëntie en veiligheid te maximaliseren. Aangezien er andere protocollen of aanpassingen van dit protocol in de literatuur bestaan, zijn de representatieve resultaten en de discussiesecties van dit manuscript alleen van toepassing op deze procedure.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Work-up en klinische counseling

OPMERKING: In het geval van patiënten die om oncologische redenen vruchtbaarheidsbehoud nodig hebben, zorg er dan voor dat er geen wachtlijst is voor het plannen van overleg en dat de afspraak zo snel mogelijk wordt verstrekt.

  1. Bekijk de medische geschiedenis en eerdere documentatie en beoordeel de algemene gezondheidstoestand van de patiënt.
  2. Noteer alle informatie (inclusief de toestemming van de oncoloog om eierstokstimulatie te ondergaan in geval van kankerpatiënten) in een relationele database.
  3. Geef de patiënt specifieke begeleiding over de haalbaarheid van de procedure. Leg de stappen van de procedure uit (ovariële stimulatie, oöcytopvraging, oöcyt vitrificatie) en informeer haar over de realistische kansen op succes (voornamelijk afhankelijk van de leeftijd van de moeder en het verwachte aantal MII-oöcyten op het moment van het ophalen van oöcyt), evenals de kosten en beperkingen van de procedure.
  4. Voer transvaginale echografie uit om informatie te verkrijgen over de eierstokreserve (d.w.z. AFC) en om de toegankelijkheid van de eierstokken voor het verzamelen van eieren te beoordelen.
  5. Vraag bloedonderzoek aan om de bloedgroep en rhesusfactor, stollingsscreening (bloedtelling, protrombine, tromboplastine, fibrinogeen, eiwit C, eiwit S, anti-trombine III, homocysteïne) en infectieziekten (hepatitis B, hepatitis C, HIV, onderzoekslaboratorium voor geslachtsziekten/Treponema pallidum Hemagglutinatietest) te beoordelen.
    OPMERKING: In het geval van patiënten die om niet-dringende medische redenen toegang hebben tot een vruchtbaarheidsbehoudsprogramma, kan een uitgebreidere beoordeling basaal follikelstimulerend hormoon (FSH), luteïniserend hormoon (LH), estradiol, AMH, borstonderzoek, Papanicolaou-test, genetische screening van stolling (factor V van Leiden en protrombine) en TORCH-screening (toxoplasmose, rubella, cytomegalovirus) omvatten.
  6. Vraag een cardiologische evaluatie aan (elektrocardiogram).
  7. Beveel psychologische counseling aan.

2. Gecontroleerde eierstokstimulatieprotocollen voor vruchtbaarheidsbehoud

OPMERKING: Wanneer de beschikbare tijd voor het starten van de kankerbehandeling beperkt is, wordt het random-start protocol (d.w.z. het starten van eierstokstimulatie op elk moment tijdens de menstruatiecyclus) aanbevolen voor de ovariële stimulatie bij oncologische patiënten die kandidaat zijn voor vruchtbaarheidsbehoud. In een vruchtbaarheidsbehoudsprogramma om niet-dringende medische redenen of sociale redenen heeft conventionele stimulatie die begint in de vroege folliculaire fase de voorkeur en wordt eierstokstimulatie gestart op basis van de menstruatiecyclus. Gecontroleerde ovariële stimulatie (COS) moet worden uitgevoerd volgens de recente richtlijnen van de European Society of Human Reproduction and Embryology (ESHRE)24.

  1. Pas COS aan op basis van de kenmerken van de patiënt en ovariële reservemarkers, voornamelijk maternale leeftijd, FSH, AMH en AFC.
  2. Start COS op dag 5 van de menstruatiecyclus met recombinant of urinaire FSH met een vaste dosis van 150-300 IE/dag (antagonistprotocol).
    OPMERKING: In een specifieke patiëntenpopulatie met LH-deficiëntie of slechte suboptimale respons kan extra LH 75/150 IE/dag worden toegediend op basis van de ovariële respons, LH-niveaus en het oordeel van de gynaecoloog.
  3. Bij patiënten met oestrogeengevoelige ziekten, omvatten gonadotropins geassocieerd met aromataseremmers (letrozol) vanaf dag 1 van stimulatie tot dag 7 na het ophalen van oöcyt.
  4. Dien gedurende 4 dagen een vaste dosis gonadotropins toe.
  5. Monitor folliculaire groei op dag 5 en vervolgens om de 2-3 dagen; uiteindelijk, pas de gonadotropin dosering.
  6. Zodra ten minste 3 follikels een diameter van 17-18 mm hebben bereikt, dient u de trigger toe te dienen voor de uiteindelijke rijping van de oöcyt met een enkele subcutane bolus gnrh-agonist in de dosis van 0,5 ml.

3. Oöcyt ophalen

  1. Voorbereiden op het ophalen van oöcyten
    1. Voor benodigde materialen, raadpleeg de tabel met materialen,en houd klaar laboratorium schoeisel en outfit, chirurgisch gezichtsmasker, haarbedekking, chirurgische handschoenen, een permanente niet-toxische marker, pincet, steriele kleine gaasjes, wegwerp of herbruikbaar speculum, vaginale chirurgie apparatuur en oppervlaktedesinfectiemiddel. Zorg voor de beschikbaarheid van reanimatieapparatuur, verdovingsmedicijnen voor omkering, een kit die is voorbereid voor de behandeling van anafylactische shock en zuurstof in de operatiekamer.
    2. Voer de procedure voor het ophalen van oöcyten uit volgens de aanbevelingen van de ESHRE-werkgroep echografie in ondersteunde reproductietechnologieën (ART)25.
      1. Dien sedatie of algemene anesthesie toe, en antibiotica voor profylaxe.
        OPMERKING: In dit protocol werd diepe sedatie bereikt door propofol (waarvan de dosering is aangepast aan het gewicht van de patiënt) en 50-100 μg fentanyl, 1000 mg paracetamol en geassisteerde maskerventilatie met zuurstof te administreren.
      2. Voer het ophalen van oöcyten uit met behulp van een aspiratie-eenheid bestaande uit een vacuümpomp, een opvangbuis die is aangesloten op een naald van 17 G met één lumen en een oöcytopvangbuis. Overschrijd tijdens het verzamelen geen druk van ~ 120 mmHg om het risico van schade aan de oöcyten te voorkomen, zoals het verwijderen van de cumuluscellen of het breken van de zona pellucida.
      3. Kalibreer de temperatuur van het werkoppervlak om 37 °C in de kweekmedia te garanderen. Minimaliseer tijdens de hele procedure de blootstelling aan oöcyt aan zelfs voorbijgaande temperaturen die hun ontwikkelingscompetentie kunnen beïnvloeden.
      4. Aan het einde van het ophalen van de oöcyt, observeer de patiënt gedurende 3-4 uur voor ontslag.
  2. Operatie theater
    1. Voordat u de operatiekamer betreedt, identificeert u de patiënt en bevestigt u het tijdstip van de ovulatietrigger.
    2. Laat de patiënt op de operatietafel liggen in een gynaecologische positie.
    3. Reinig de vagina/baarmoederhals voordat de oöcyt wordt opgehaald om bacteriële besmetting te minimaliseren.
    4. Voer een voorlopige transvaginale echografie uit om de positie van de eierstokken en de anatomische relaties met de verschillende organen en bloedvaten te beoordelen.
    5. Steek onder echografie een naald met één lumen door de vaginale wand en in een eierstokfollikel, waarbij u ervoor zorgt dat de organen of bloedvaten tussen de vaginale wand en de eierstok niet worden verwond.
    6. Begin aspiratie vanaf de dichtstbijzijnde follikel en ga verder met de meest distale.
    7. Prik alle follikels met een diameter groter dan 11-12 mm door en voer "draaiende bewegingen" van de naald uit om de hele folliculaire vloeistof te aspireren, die vervolgens wordt vrijgegeven in een steriele buis (ronde bodem 14 ml) voorverwarmd in de blokverwarming van de operatiekamer.
    8. Onmiddellijk na het ophalen verzegelt en labelt u de tube met details van de identiteit van de patiënt.
    9. Zorg ervoor dat de verpleegkundige de buis naar het laboratorium brengt, waar deze onmiddellijk wordt gescreend op de aanwezigheid van cumulus-oöcytcomplexen (COC's).
    10. Instrueer de embryologen om de clinicus te informeren over het totale aantal opgehaalde COC's.
    11. Zodra de procedure voor de eerste eierstok is voltooid, spoelt u de naald met een schoon medium en gaat u verder met de tweede eierstok met dezelfde procedure.
    12. Evalueer na het ophalen van oöcyten eventuele bloedingen uit de eierstokken of bloedvaten van het parametrium en vrije vloeistof in de zak van Douglas.
      OPMERKING: Om de effectiviteit van de traceerbaarheid van gameten en embryo's op klinisch niveau te automatiseren en te verbeteren, werd in het centrum26een elektronisch getuigensysteem (EWS) geïmplementeerd. In dit protocol wordt echter geen melding gemaakt van het EWS om de reproduceerbaarheid van het protocol in elk IVF-laboratorium te waarborgen. Toch moet u van mening zijn dat voor alle stappen van de procedure een tweede exploitant (d.w.z. een getuige) nodig is om de traceerbaarheid van gameten en embryo's te waarborgen.

4. IVF laboratorium

  1. De dag voor de oöcytophaalprocedure
    1. Bereid oöcytopvangbuizen voor (zie de tabel met materialen).
      1. Doseer 1 ml IVF-medium (zie de materiaaltabel)in elke oöcytinzamelingsbuis (ronde bodem, 5 ml) en dek af met 0,2 ml minerale olie (zie de materiaaltabel)voor embryokweek.
        OPMERKING: Het aantal buizen wordt bepaald op basis van het aantal follikels dat naar verwachting zal worden opgehaald. Elke buis kan maximaal 4 COC's bevatten.
    2. Sluit de buizen af met de dop (eerste druk op de foto). Etiket de buizen met details van het type medium en de datum van bereiding. Incubeer de buizen 's nachts bij 37 °C in een gecontroleerde atmosfeer (6% CO2, 5% 02).
  2. Op de dag van het ophalen van de oöcyt
    1. Verwarm de plastic voorraden voor op 37 °C (steriele kweekschalen en Pasteurpipetten).
    2. Vraag de patiënten om hun identiteit (volledige naam en geboortedatum) en het tijdstip van ovulatie te bevestigen. Noteer op het laboratoriumblad dat de identificatieprocedure (ID) is voltooid en dat het tijdstip van de ovulatietrigger is bevestigd.
    3. Haal de oöcyt opvangbuizen van de incubator (vlak voordat de procedure begint) en duw de dop naar beneden om een strakke sluiting te garanderen. Etiketteer de oöcytinzamelbuizen met de informatie van de patiënt. Plaats de oöcyt opvangbuizen in de blokverwarming op 37 °C.
    4. Onderzoek de folliculaire vloeistof in de voorverwarmde steriele kweekschotels en identificeer COC's. Zodra een of meer COC's zijn geïdentificeerd, spoelt u ze twee keer in twee druppels medium om de folliculaire vloeistof en bloedverontreiniging te verwijderen.
    5. Breng de COC's over naar de oöcytopvangbuizen en maak aantekeningen bij het aantal COC's op de buis. Maak de doppen van de middelgrote buizen los en incubeer ze onmiddellijk bij 37 °C in een atmosfeer van 6% CO2, 5% O2.
    6. Herhaal stap 7 tot en met 9 op basis van het aantal opgehaalde oöcyten. Werk het laboratoriumblad bij.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat een getuige controleert of alle buisopwarmingsblokken (inclusief die in de operatiekamer) leeg zijn en de sluiting van de procedure op het laboratoriumblad ondertekent.
    7. Veeg de werkfase af na voltooiing van de procedure.

5. Oöcyt denudatie

  1. Prewarm 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonzuur (HEPES)-gebufferd medium en hyaluronidase (zie de materiaaltabel) bij 37 °C ten minste 1 uur voor aanvang.
  2. Bereid een 4-put IVF-plaat (zie de materialentabel)met 0,6 ml/put van voorverwarmd HEPES-gebufferd medium (aangevuld met 5% humaan serumalbumine [HSA]) bedekt met 0,3 ml minerale olie voor embryokweek en warm bij 37 °C gedurende ten minste 30 minuten.
  3. Label de oöcyt denudatieplaat met details van de identiteit van de patiënt.
  4. Voeg onmiddellijk voor het starten van de procedure hyaluronidase toe aan de eerste put om een eindconcentratie van ongeveer 20 IE/ml te verkrijgen.
  5. Plaats een beperkt aantal COC's (tot 6) in de eerste put die het enzym bevat om de cumuluscellen te dispergeren.
  6. Om de enzymatische verwijdering van de cumulus- en coronacellen te verbeteren, voert u het strippen van cumuluscellen uit door de oöcyten herhaaldelijk door een Pasteur-pipet met een binnendiameter van ongeveer 250 μm voor maximaal 30 s te pipeten. Nadat de initiële celdissociatie is waargenomen, breng de oöcyten over naar de tweede put die alleen HEPES-gebufferd medium bevat, waarbij ervoor wordt gezorgd dat een minimale hoeveelheid van het enzym wordt overgedragen.
  7. Voer verdere denudatie uit om de coronacellen te verwijderen met behulp van denuding pipetten met afnemende binnendiameters (170-145 μm). Gebruik lagere diameters (135μm) alleen als dit strikt noodzakelijk is.
  8. Was de gedenudeerde oöcyten zorgvuldig om het enzym uit te wassen.
  9. Onderzoek na de denudatie de oöcyten onder een omgekeerde microscoop om hun integriteit en rijpingsstadium te beoordelen. Scheid MII-oöcyten van de onrijpe (kiemblaasje en metafase-I).
  10. Verplaats de MII-oöcyten naar het vitrificatiegebied om onmiddellijk cryopreservatie uit te voeren. Werk het laboratoriumblad bij.

6. Oöcyt vitrificatie

OPMERKING: Voer oöcyt vitrificatie bij voorkeur uit binnen 38 uur na het ophalen van oöcyt en onmiddellijk na de denudatie. De hier beschreven vitrificatieprocedure moet worden uitgevoerd bij kamertemperatuur (RT) en door het gebruik van een stripperpipet met een binnendiameter van 170 μm om oöcyten tijdens manipulatie niet te beschadigen.

  1. Breng ongeveer 30 minuten voor de procedure de equilibratieoplossing (ES) en de vitrificatieoplossing (VS) naar RT (25-27 °C).
  2. Label de cryodevices correct met de naam en ID van de patiënt, behandelings-ID, datum van invriezen, aantal oöcyten en cryobarcode.
  3. Vul een wegwerpkoelrek tot aan de bovenkant met verse vloeibare stikstof en start het sterilisatieproces.
  4. Label de vitrificatieplaat (zie de materialentabel)met de naam en ID van de patiënt. Vraag een getuige om de juiste ID van de cryodevices te controleren.
  5. Keer elke flacon twee keer voorzichtig om om de inhoud ervan voor gebruik te mengen en bereid het deksel van een petrischaal van 6 mm met één druppel van 30 μL HEPES-gebufferd medium (met 5% HSA) en één aangrenzende druppel van 30 μL ES.
    OPMERKING: Plaats druppels vlak voor gebruik om de gemiddelde verdamping te beperken.
  6. Plaats de oöcyten (tot 9) in de eerste druppel met een zo klein mogelijk volume medium met een stripperpipet met een diameter van 170 μm. Maak met behulp van de stripperpipet een brug van medium tussen de druppel n.1 en n.2 om een geleidelijke verhoging van de concentratie van de CPA's te verkrijgen (figuur 1A).
  7. Incubeer de oöcyten in de eerste druppel gedurende 3 minuten. Voeg een derde druppel van 30 μL ES (n.3) toe. Breng na 3 minuten de oöcyten over in de tweede druppel ES en creëer een gemiddelde brug tussen druppels n.3 en n.2 (figuur 1B). Incubeer de oöcyten in druppel n.3 gedurende 3 minuten.
  8. Voeg tijdens de incubatie één druppel ES van 30 μL toe voor elke cryodevice die zal worden gebruikt (als 9 oöcyten cryopreserved moeten worden, plaats dan 3 druppels ES met 3 oöcyten in elke druppel ES). Verplaats de oöcyten in pure ES-oplossing en laat ze 6-9 minuten staan (totdat ze hun oorspronkelijke grootte na krimp herstellen) (figuur 1C).
  9. Bereid een centrale putschaal (60 x 15 mm) met 1 ml VS. Breng aan het einde van de eerste 6 minuten de oöcyten over om cryopreserved in de VS-oplossing te worden geserveerd, waarbij zo min mogelijk medium wordt vrijgegeven. Laat de oöcyten 1 minuut in VS staan en was ze zorgvuldig door ze van de bodem naar de bovenkant van de schaal te verplaatsen om het teveel aan ES te verwijderen.
  10. Plaats de cryodevice ongeveer 10 s voor het einde van de incubatieminuut onder de microscoop en pas de focus op de zwarte markering (d.w.z. de punt van de cryodevice) aan. Plaats de oöcyten op de cryodevice naast de zwarte markering met de minimale hoeveelheid VS (figuur 2A).
  11. Beweeg de stripperpipet uit de buurt van de oöcyten en verwijder het teveel aan VS-medium (figuur 2B) zodat de oöcyten bedekt blijven met een dunne laag medium (figuur 2C).
  12. Dompel de cryodevice snel in vloeibare stikstof en schud hem snel om luchtbellen van het oppervlak te verwijderen. Houd de beschermkap van de cryodevice vast met een pincet en vul deze met vloeibare stikstof; steek vervolgens de cryodevice erin terwijl u de propyleenstroken in vloeibare stikstof houdt.
  13. Bewaar de cryodevice in een visiotube die eerder is gelabeld met de informatie van de patiënt. Werk het laboratoriumblad bij.

7. Oöcyt opwarming

  1. Verwarm ongeveer 30 minuten voor de procedure de ontdooioplossing (TS), verdunningsoplossing (DS) en wasoplossing (WS) tot RT (25-27 °C). Keer elke flacon twee keer voorzichtig om om de inhoud ervan te mengen. Plaats 1 ml TS in een centrale petrischaal en verwarm deze ten minste 1 uur op 37 °C voordat u met de procedure begint.
  2. Label alle plastic benodigdheden met de naam en ID van de patiënt en het type oplossing. Vraag een getuige om de informatie van de patiënt over de cryodevice te bevestigen.
  3. Bereid voor elke cryodevice die moet worden opgewarmd een 6-putplaat voor met 200 μL DS in de eerste put en een gelijke hoeveelheid WS in de tweede en derde (respectievelijk WS1 en WS2). Voeg fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) of steriel water toe in het gebied buiten de putten om verdamping te voorkomen.
  4. Haal de TS-schotel uit de incubator en leg deze onder de microscoop. Pas de focus van de microscoop aan op het midden van de Petrischaal.
  5. Draai en verwijder voorzichtig de beschermkap van de cryodevice, terwijl u de propyleenstroken in vloeibare stikstof houdt. Breng de cryodevice van vloeibare stikstof zo snel mogelijk over in de TS om het risico van devitrificatie te voorkomen en start het aftellen (1 min).
  6. Lokaliseer de oöcyten door te focussen op de punt van de cryodevice (d.w.z. de zwarte markering). Laat met behulp van een stripperpipet de oöcyten los uit de cryodevice.
    OPMERKING: Probeer de oöcyten uit de cryodevice niet te aspireren; laat voorzichtig wat media los totdat ze in de TS komen.
  7. Breng de oöcyten met een kleine hoeveelheid TS over naar DS met behulp van een stripperpipet met een diameter van 170 μm (om een gradiënt te creëren) en laat ze 3 minuten in de DS staan. Verplaats de oöcyten op dezelfde manier naar WS1 en laat ze 5 minuten staan. Breng ten slotte de oöcyten gedurende 1 minuut over naar WS2.
  8. Breng de oöcyten over in een geschikt pre-geëquilibreerd IVF-kweekmedium en incubeer ze gedurende 1 uur voordat u doorgaat met intracytoplasmatische sperma-injectie (ICSI). Werk het laboratoriumblad bij.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Overzicht van het vruchtbaarheidsbehoudsprogramma in het centrum

Over een periode van 12 jaar (2008-2020) ondergingen 285 vrouwen ten minste één oöcytterugwinning die de vitrificatie van het hele cohort van verzamelde volwassen eieren met zich meebracht. De meeste van deze vrouwen (n =250) ondergingen een enkele retrieval, en 35 ondergingen meerdere retrievals. De redenen voor het ophalen van oöcyten voor eier vitrificatie zijn samengevat in 4 categorieën: medisch (behalve kan...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Klinische overwegingen

Hoewel de opkomende strategieën, zoals ovariële weefsel cryopreservatie en in vitro rijping zijn onderzocht, is oöcyt vitrification na COS de gouden standaardtechniek voor vruchtbaarheidsbehoud. In dit scenario moet het aantal teruggewonnen oöcyten en cryopreserved in de kortst mogelijke tijd worden gemaximaliseerd, omdat de meeste kankerpatiënten slechts baat kunnen hebben bij één eierstokcyclus voordat ze met hun kankerbehandeling(en) moeten beginnen....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets bekend te maken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Collectie
Apparatuur
Hot plateIVF TECH
Lab MarkersSigma Aldrich
Laminar Flow HoodIVF TECHGrade A luchtstroom
StereomicroscoopLeicaLeica M80
Thermometer
Testbuis verwarmer
Tri-gas incubatorPanasonicMCO-5M-PE02/CO2
VacuumpompCookK-MAR-5200
Verbruiksartikelen
CSCM (Complete enkele kweekset) mediumFujifilm Irvine Scientific90165IVF kweekmedium gesupplementeerd met HSA
Mineralolie voor embryocultuurFujifilm Irvine Scientific9305
Ovum aspiratienet (Single lumen)CookK-OSN-1730-B-60
Primaria DishCorning353803Corning Primaria Dish 100x20 mm stijl standaard celkweekbakje
Buisjes met ronde bodemFalcon352001Falcon 14ml Ronde Bodem Polystyreen Testbuis met snap-kap
Buisjes met ronde bodemFalcon352003Oocyte verzamelbuisjes/ Falcon 5ml 12x75 Ronde Bodem Polipropileen Testbuis met snap-kap
Rubberen bulbSigma AldrichZ111589-12EA
Steriele glazen Pasteur pipettenHunter ScientificPPB150-100PLPipette Pasteur Cotonate, 150mm, MEA e CE
Denudatie
Apparatuur
CO2 incubatorEppendorfGalaxy 14S
Flexipet instelbare handgreep setCookG18674Stripper  houder
Gilson PipetmanGilson66003p20
k-System IncubatorCoopersurgicalG210Invicell
Lab MarkersSigma Aldrich
Laminar Flow HoodIVF TECHGrade A luchtstroom
StereomicroscoopLeicaLeica M80
Verbruiksartikelen
Biopur epTIPS RackEppendorf30075331Micropipetten epTIPS Biopur 2-200 µl
Human Serum AlbuminethermoFisher Scietific9988
HyaluronidaseFujifilm Irvine Scientific9010180 IU/mL van hyaluronidase enzym in HEPES-gebufferd HTF
IVF kweekbakje (60 x 15mm)Corning353802Corning Primaria Falcon Dish 60X15mm TC Primaria standaard celkweekbakje
IVF bakje 4-kamerplaat met schuifdekselThermoFisher Scietific176740Multidishes 4 putjes (Nunc)
IVF éénkamerbakjeFalcon353653Falcon 60 x 15 mm TC behandeld centrum-wel IVF
Mineralolie voor embryocultuurFujifilm Irvine Scientific9305
Gemodificeerd HTF MediumFujifilm Irvine Scientific90126HEPES-Buffered medium
Rubberen bulbSigma AldrichZ111589-12EA1 mL voor Pasteur pipetten
Steriele glazen Pasteur pipettenHunter ScientificPPB150-100PLPipette Pasteur Cotonate, 150 mm, MEA e CE
stripping pipette tips (140 µm)CookK-FPIP-1140-10BS-6PIPETTE FLEXIPETS VOOR DENUDATIE
stripping pipette tips (130 µm )CookK-FPIP-1130-10BS-7PIPETTE FLEXIPETS VOOR DENUDATIE
stripping pipette tips (170 µm)CookK-FPIP-1170-10BS-5PIPETTE FLEXIPETS VOOR DENUDATIE
Vitrificatie
Apparatuur
Elektronische timer
Flexipet instelbare handgreep setCookG18674Stripper  houder
Gilson PipetmanGilsonF123601p200
Lab MarkersSigma Aldrich
Laminar Flow HoodIVF TECHGrade A luchtstroom
RVS container voor koelrekKitazatoVloeibare stikstof container voor vitrificatie
StereomicroscoopLeicaLeica M80
Verbruiksartikelen
Biopur epTIPS RackEppendorf30075331Micropipetten epTIPS Biopur 2-200 µL
Human Serum AlbumineFujifilm Irvine Scientific9988
IVF kweekbakje (60 x 15 mm)Corning353802Corning Primaria Falcon Dish 60 x 15 mm TC Primaria standaard celkweekbakje
IVF bakje 6-kamerOosafeOOPW-SW02OOSAFE  6 KAMERBAKJE MET STRAW HOUDER
Gemodificeerd HTF MediumFujifilm Irvine Scientific90126HEPES-Buffered medium
stripping pipette tips (170 µm)CookK-FPIP-1170-10BS-5PIPETTE FLEXIPETS VOOR DENUDATIE
Vitrificatie Bevriezing kitFujifilm Irvine Scientific90133-so2 Vialen van ES (Equilibratie Oplossing, 2 x 1 mL) en 2 Vialen van VS (Vitrificatie Oplossing, 2 x 1 mL)
VitrifitCoopersurgical Origio42782001AVitriFit  Box
Opwarming

Referenties

  1. Cobo, A., Diaz, C. Clinical application of oocyte vitrification: a systematic review and meta-analysis of randomized controlled trials. Fertility and Sterility. 96 (2), 277-285 (2011).
  2. Rienzi, L., et al. Oocyte, embryo and blastocyst cryopreservation in ART: systematic review and meta-analysis comparing slow-freezing versus vitrification to produce evidence for the development of global guidance. Human Reproduction Update. 23 (2), 139-155 (2017).
  3. Nagy, Z. P., Anderson, R. E., Feinberg, E. C., Hayward, B., Mahony, M. C. The Human Oocyte Preservation Experience (HOPE) Registry: evaluation of cryopreservation techniques and oocyte source on outcomes. Reproductive Biology and Endocrinology. 15 (1), (2017).
  4. Practice Committees of American Society for Reproductive, M., & Society for Assisted Reproductive, T. Mature oocyte cryopreservation: a guideline. Fertility and Sterility. 99 (1), 37-43 (2013).
  5. Lee, S. J., et al. American Society of Clinical Oncology recommendations on fertility preservation in cancer patients. Journal of Clinical Oncology. 24 (18), 2917-2931 (2006).
  6. Nakayama, K., Ueno, N. T. American Society of Clinical Oncology recommendations on fertility preservation should be implemented regardless of disease status or previous treatments. Journal of Clinical Oncology. 24 (33), 5334-5335 (2006).
  7. Martinez, F. Update on fertility preservation from the Barcelona International Society for Fertility Preservation-ESHRE-ASRM 2015 expert meeting: indications, results and future perspectives. Human Reproduction. 32 (9), 1802-1811 (2017).
  8. Lantsberg, D., Fernando, S., Cohen, Y., Rombauts, L. The role of fertility preservation in women with endometriosis: a systematic review. Journal of Minimally Invasive Gynecology. 27 (2), 362-372 (2020).
  9. Anderson, R. A., et al. Cancer treatment and gonadal function: experimental and established strategies for fertility preservation in children and young adults. Lancet Diabetes & Endocrinology. 3 (7), 556-567 (2015).
  10. Lambertini, M., et al. Cancer and fertility preservation: international recommendations from an expert meeting. BMC Medicine. 14, 1(2016).
  11. Kim, S. J., Kim, S. K., Lee, J. R., Suh, C. S., Kim, S. H. Oocyte cryopreservation for fertility preservation in women with ovarian endometriosis. Reproductive Biomedicine Online. 40 (6), 827-834 (2020).
  12. Loren, A. W., et al. Fertility preservation for patients with cancer: American Society of Clinical Oncology clinical practice guideline update. Journal of Clinical Oncology. 31 (19), 2500-2510 (2013).
  13. Peccatori, F. A., et al. Cancer, pregnancy and fertility: ESMO Clinical Practice Guidelines for diagnosis, treatment and follow-up. Annals of Oncology. 24, Suppl 6 160-170 (2013).
  14. Dondorp, W. J., De Wert, G. M. Fertility preservation for healthy women: ethical aspects. Human Reproduction. 24 (8), 1779-1785 (2009).
  15. Cil, A. P., Bang, H., Oktay, K. Age-specific probability of live birth with oocyte cryopreservation: an individual patient data meta-analysis. Fertilility and Steriityl. 100 (2), 492-499 (2013).
  16. Ubaldi, F. M., et al. Advanced maternal age in IVF: still a challenge? The present and the future of its treatment. Frontiers in Endocrinology. 10, 94(2019).
  17. Cimadomo, D., et al. Impact of maternal age on oocyte and embryo competence. Frontiers in Endocrinology. 9, 327(2018).
  18. Cobo, A., et al. Oocyte vitrification as an efficient option for elective fertility preservation. Fertility and Sterility. 105 (3), 755-764 (2016).
  19. Devroey, P., Polyzos, N. P., Blockeel, C. An OHSS-Free Clinic by segmentation of IVF treatment. Human Reproduction. 26 (10), 2593-2597 (2011).
  20. Sonigo, C., et al. Impact of letrozole supplementation during ovarian stimulation for fertility preservation in breast cancer patients. European Journal of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology X. 4, 100049(2019).
  21. Marklund, A., et al. Efficacy and safety of controlled ovarian stimulation using GnRH antagonist protocols for emergency fertility preservation in young women with breast cancer-a prospective nationwide Swedish multicenter study. Human Reproduction. 35 (4), 929-938 (2020).
  22. Kuwayama, M. Highly efficient vitrification for cryopreservation of human oocytes and embryos: the Cryotop method. Theriogenology. 67 (1), 73-80 (2007).
  23. Kuwayama, M., Vajta, G., Kato, O., Leibo, S. P. Highly efficient vitrification method for cryopreservation of human oocytes. Reproductive Biomedicine Online. 11 (3), 300-308 (2005).
  24. Bosch, E., et al. ESHRE guideline: ovarian stimulation for IVF/ICSI(dagger). Human Reproduction Open. 2020 (2), (2020).
  25. ESHRE Working Group on Ultrasound in ART. Recommendations for good practice in ultrasound: oocyte pick up(dagger). Human Reproduction Open. 2019 (4), 025(2019).
  26. Rienzi, L., et al. Failure mode and effects analysis of witnessing protocols for ensuring traceability during IVF. Reproductive Biomedicine Online. 31 (4), 516-522 (2015).
  27. Mazzilli, R., et al. Effect of the male factor on the clinical outcome of intracytoplasmic sperm injection combined with preimplantation aneuploidy testing: observational longitudinal cohort study of 1,219 consecutive cycles. Fertility and Sterility. 108 (6), 961-972 (2017).
  28. Polyzos, N. P., et al. Cumulative live birth rates according to the number of oocytes retrieved after the first ovarian stimulation for in vitro fertilization/intracytoplasmic sperm injection: a multicenter multinational analysis including approximately 15,000 women. Fertility and Steriityl. 110 (4), 661-670 (2018).
  29. Alteri, A., Pisaturo, V., Nogueira, D., D'Angelo, A. Elective egg freezing without medical indications. Acta Obstetricia et Gynecologica Scandinavica. 98 (5), 647-652 (2019).
  30. Mesen, T. B., Mersereau, J. E., Kane, J. B., Steiner, A. Z. Optimal timing for elective egg freezing. Fertility and Steriityl. 103 (6), 1551-1556 (2015).
  31. Doyle, J. O., et al. Successful elective and medically indicated oocyte vitrification and warming for autologous in vitro fertilization, with predicted birth probabilities for fertility preservation according to number of cryopreserved oocytes and age at retrieval. Fertility and Sterility. 105 (2), 459-466 (2016).
  32. Rienzi, L., et al. Significance of metaphase II human oocyte morphology on ICSI outcome. Fertility and Sterility. 90 (5), 1692-1700 (2008).
  33. Ubaldi, F. M., et al. Reduction of multiple pregnancies in the advanced maternal age population after implementation of an elective single embryo transfer policy coupled with enhanced embryo selection: pre- and post-intervention study. Human Reproduction. 30 (9), 2097-2106 (2015).
  34. Cakmak, H., Katz, A., Cedars, M. I., Rosen, M. P. Effective method for emergency fertility preservation: random-start controlled ovarian stimulation. Fertility and Sterility. 100 (6), 1673-1680 (2013).
  35. Moravek, M. B., et al. Long-term outcomes in cancer patients who did or did not pursue fertility preservation. Fertility and Sterility. 109 (2), 349-355 (2018).
  36. Vaiarelli, A., Venturella, R., Vizziello, D., Bulletti, F., Ubaldi, F. M. Dual ovarian stimulation and random start in assisted reproductive technologies: from ovarian biology to clinical application. Current Opinion in Obstetrics and Gynecology. 29 (3), 153-159 (2017).
  37. Vaiarelli, A., Cimadomo, D., Ubaldi, N., Rienzi, L., Ubaldi, F. M. What is new in the management of poor ovarian response in IVF. Current Opinion in Obstetrics and Gynecology. 30 (3), 155-162 (2018).
  38. Venturella, R., et al. State of the art and emerging drug therapies for female infertility. Gynecological Endocrinology. 35 (10), 835-841 (2019).
  39. Venturella, R., et al. A modern approach to the management of candidates for assisted reproductive technology procedures. Minerva Ginecologica. 70 (1), 69-83 (2018).
  40. Ferreiro, E., de Uralde, B. L., Abreu, R., Garcia-Velasco, J. A., Munoz, E. Aromatase inhibitors for ovarian stimulation in patients with breast cancer. Current Drug Targets. 21 (9), 910-921 (2020).
  41. Oktay, K., et al. Letrozole reduces estrogen and gonadotropin exposure in women with breast cancer undergoing ovarian stimulation before chemotherapy. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 91 (10), 3885-3890 (2006).
  42. Meirow, D., et al. Tamoxifen co-administration during controlled ovarian hyperstimulation for in vitro fertilization in breast cancer patients increases the safety of fertility-preservation treatment strategies. Fertility and Steriity. 102 (2), 488-495 (2014).
  43. Friedler, S., Koc, O., Gidoni, Y., Raziel, A., Ron-El, R. Ovarian response to stimulation for fertility preservation in women with malignant disease: a systematic review and meta-analysis. Fertility and Steriity. 97 (1), 125-133 (2012).
  44. Tsampras, N., Gould, D., Fitzgerald, C. T. Double ovarian stimulation (DuoStim) protocol for fertility preservation in female oncology patients. Human Fertility. 20 (4), 248-253 (2017).
  45. Vaiarelli, A., et al. Double stimulation in the same ovarian cycle (DuoStim) to maximize the number of oocytes retrieved from poor prognosis patients: a multicenter experience and SWOT analysis. Frontiers in Endocrinology. 9, 317(2018).
  46. Cimadomo, D., et al. Luteal phase anovulatory follicles result in the production of competent oocytes: intra-patient paired case-control study comparing follicular versus luteal phase stimulations in the same ovarian cycle. Human Reproduction. 33 (8), 1442-1448 (2018).
  47. Rienzi, L., Ubaldi, F. M. Oocyte versus embryo cryopreservation for fertility preservation in cancer patients: guaranteeing a women's autonomy. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 32 (8), 1195-1196 (2015).
  48. Oktay, K., Harvey, B. E., Loren, A. W. Fertility preservation in patients with cancer: ASCO clinical practice guideline update summary. JCO Oncology Practice. 14 (6), 381-385 (2018).
  49. Iussig, B., et al. A brief history of oocyte cryopreservation: Arguments and facts. Acta Obstetricia et Gynecologica Scandinavica. 98 (5), 550-558 (2019).
  50. Best, B. P. Cryoprotectant toxicity: facts, issues, and questions. Rejuvenation Research. 18 (5), 422-436 (2015).
  51. Fuller, B., Paynter, S. Fundamentals of cryobiology in reproductive medicine. Reproductive Biomedicine Online. 9 (6), 680-691 (2004).
  52. Konc, J., Kanyo, K., Kriston, R., Somoskoi, B., Cseh, S. Cryopreservation of embryos and oocytes in human assisted reproduction. BioMed Research International. 2014, 307268(2014).
  53. Erstad, B. L. Osmolality and osmolarity: narrowing the terminology gap. Pharmacotherapy. 23 (9), 1085-1086 (2003).
  54. Sunde, A., et al. Time to take human embryo culture seriously. Human Reproduction. 31 (10), 2174-2182 (2016).
  55. Swain, J. E., Cabrera, L., Xu, X., Smith, G. D. Microdrop preparation factors influence culture-media osmolality, which can impair mouse embryo preimplantation development. Reproductive Biomedicine Online. 24 (2), 142-147 (2012).
  56. Wale, P. L., Gardner, D. K. The effects of chemical and physical factors on mammalian embryo culture and their importance for the practice of assisted human reproduction. Human Reproduction Update. 22 (1), 2-22 (2016).
  57. Seki, S., Mazur, P. The dominance of warming rate over cooling rate in the survival of mouse oocytes subjected to a vitrification procedure. Cryobiology. 59 (1), 75-82 (2009).
  58. Karlsson, J. O. A theoretical model of intracellular devitrification. Cryobiology. 42 (3), 154-169 (2001).
  59. Jin, B., et al. Equilibrium vitrification of mouse embryos. Biololgy of Reproduction. 82 (2), 444-450 (2010).
  60. Mazur, P. Equilibrium, quasi-equilibrium, and nonequilibrium freezing of mammalian embryos. Cell Biophysics. 17 (1), 53-92 (1990).
  61. Parmegiani, L., et al. "Universal Warming" protocol for vitrified oocytes to streamline cell exchange for transnational donation programs: a multi-center study. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 37 (6), 1379-1385 (2020).
  62. Vajta, G., Rienzi, L., Ubaldi, F. M. Open versus closed systems for vitrification of human oocytes and embryos. Reproductive Biomedicine Online. 30 (4), 325-333 (2015).
  63. Cai, H., et al. Open versus closed vitrification system of human oocytes and embryos: a systematic review and meta-analysis of embryologic and clinical outcomes. Reproductive Biology & Endocrinology. 16 (1), 123(2018).
  64. Parmegiani, L., et al. Sterilization of liquid nitrogen with ultraviolet irradiation for safe vitrification of human oocytes or embryos. Fertility and Sterility. 94 (4), 1525-1528 (2010).
  65. Parmegiani, L., et al. Efficiency of aseptic open vitrification and hermetical cryostorage of human oocytes. Reproductive Biomedicine Online. 23 (4), 505-512 (2011).
  66. Cobo, A., et al. Storage of human oocytes in the vapor phase of nitrogen. Fertility and Sterility. 94 (5), 1903-1907 (2010).
  67. Eum, J. H., et al. Long-term liquid nitrogen vapor storage of mouse embryos cryopreserved using vitrification or slow cooling. Fertility and Sterility. 91 (5), 1928-1932 (2009).
  68. Fabozzi, G., et al. Which key performance indicators are most effective in evaluating and managing an in vitro fertilization laboratory. Fertility and Sterility. 114 (1), 9-15 (2020).
  69. Dessolle, L., et al. Learning curve of vitrification assessed by cumulative summation test for learning curve (LC-CUSUM). Fertility and Sterility. 92 (3), 943-945 (2009).
  70. Alpha Scientists In Reproductive Medicine. The Alpha consensus meeting on cryopreservation key performance indicators and benchmarks: proceedings of an expert meeting. Reproductive Biomedicine Online. 25 (2), 146-167 (2012).
  71. Edgar, D. H., Gook, D. A. A critical appraisal of cryopreservation (slow cooling versus vitrification) of human oocytes and embryos. Human Reproduction Update. 18 (5), 536-554 (2012).
  72. Edgar, D. H., Archer, J., Bourne, H. The application and impact of cryopreservation of early cleavage stage embryos in assisted reproduction. Human Fertility. 8 (4), 225-230 (2005).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Opwarmen van o cytenblootstelling aan cryoprotectantiaevaluatie van de ovariale reservestimulatieprotocolo cytaspiratiedenudatieprocedurevitrificatielosutieontdooiloplossing

Gerelateerde artikelen