Cryo-letsel geïnduceerde hartregeneratie in de axolotl- en echocardiografie en onbevooroordeelde kwantitatieve histologie om regeneratieve progressie te evalueren

Samenvatting

Hier presenteren we een operatieprotocol om cryoletsel aan het ventriculaire myocardium van de axolotl te induceren. Daarnaast presenteren we een protocol om de infarctfractie tijdens het regeneratieve proces niet-invasief te schatten met echocardiografie en een protocol om de infarctfractie in het uitgesneden hart nauwkeurig te meten met onbevooroordeelde kwantitatieve histologie.

Samenvatting

De urodele amfibieën, salamanders en salamanders vertegenwoordigen de fylogenetische groep die het dichtst bij de zoogdieren staat die in staat is om volledige myocardiale regeneratie uit te voeren na ventriculaire resectie. Het resectiemodel heeft een basiskennis gegenereerd van de processen die betrokken zijn bij hartherstel. Het model heeft echter geen goede relatie met klinische situaties waarin weefselbeschadiging, apoptose, necrose, fibrose en hypertrofie allemaal belangrijke nadelige gevolgen zijn van door ischemie geïnduceerde myocardinfarcten in plaats van weefselverwijdering. Aan de andere kant lijkt cryoinjury-geïnduceerd myocardinfarct meer op ischemie-geïnduceerd myocardinfarct. Hier geven we een gedetailleerde beschrijving van de cryoinjury-procedure in de axolotl (Ambystoma mexicanum), die een hulpmiddel biedt voor het onderzoeken van basismechanismen bij hartherstel in een tetrapod-model. Daarnaast bieden we kwantitatieve methoden voor het niet-invasief schatten van de infarctgrootte in vivo met echocardiografie en voor het nauwkeurig meten van de infarctgrootte met onbevooroordeelde kwantitatieve histologie ex vivo.

Inleiding

Ischemische hartziekte is wereldwijd een van de belangrijkste doodsoorzaken ^1,2. Door ischemie geïnduceerd myocardinfarct resulteert in wijdverspreide celdood in cardiomyocyten³. Hoewel snelle medische interventie het risico op onmiddellijk overlijden kan verminderen, resulteert de daaruit voortvloeiende fibrotische respons die mensen delen met traditionele modeldieren van zoogdieren (muis, rat, konijn, varken, enz.) in de vorming van littekenweefsel dat uiteindelijk kan leiden tot harthypertrofie, hartritmestoornissen en hartfalen⁴. In tegenstelling tot zoogdieren is hartregeneratie goed ingeburgerd in sommige niet-amnionische diermodellen zoals zebravissen⁵ en salamanders⁶. Traditioneel is hartregeneratie bij deze soorten bestudeerd na gedeeltelijke ventriculaire resectie of knijpen 5,6,7,8,9,10. In 2011 ontwikkelden drie groepen echter onafhankelijk van elkaar een cryoinjury-geïnduceerde myocardinfarcttechniek bij zebravissen 11,12,13. De cryoinjury-techniek resulteert in necrose en apoptose in een groot deel van het hartventrikel van de zebravis en een eerste ophoping van fibrotisch weefsel dat de pathologische ontwikkeling van het hart van zoogdieren na een ischemisch infarct nauwkeuriger modelleert in vergelijking met ventriculaire resectie 11,12,13. Bovendien hebben methodologische vergelijkingen van cryoinjury-geïnduceerd myocardinfarct met ischemie-geïnduceerd myocardinfarct door kransslagaderligatie bij de muis en het varken bewezen dat de cryoinjury-techniek een nuttig alternatief is in diermodellen van zoogdieren ^14,15. Geïnspireerd door de methoden die betrokken zijn bij het cryoletselmodel van de zebravis^16,17 hebben we een soortgelijk model ontwikkeld in de axolotl¹⁸, een amfibie die bekend staat om zijn regeneratieve capaciteiten¹⁹, waarmee onderzoek kan worden gedaan naar de mechanismen die betrokken zijn bij hartherstel in deze tetrapod na weefselbeschadiging in plaats van weefselverwijdering.

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor het uitvoeren van cryoletsel geïnduceerd myocardinfarct in de axolotl. We leggen speciale nadruk op snelle en minimaal invasieve cruciale stappen die de overleving, het herstel en de experimentele reproduceerbaarheid vergroten. Daarnaast geven we instructies voor geschikte technieken voor het evalueren van anatomische regeneratie in vivo met behulp van echocardiografie en ex vivo met behulp van onbevooroordeelde op histologie gebaseerde kwantitatieve histologie.

Cryoinjury-geïnduceerd myocardinfarct in de axolotl kan worden toegepast om de basismechanismen te onderzoeken die betrokken zijn bij myocardiale regeneratie in deze tetrapod. De axolotl is tolerant voor door cryoletsel geïnduceerd myocardinfarct, dat ten minste 45% van het ventrikel aantast, wat resulteert in een afname van het slagvolume en het hartminuutvolume zonder enige gedragsveranderingen in zijn relatief lome levensstijl, maar ernstigere verwondingen zullen mogelijk leiden tot een verminderde diergezondheid.

Kortom, om cryoletsel op te wekken, wordt een ventrale incisie gemaakt op de thorax van een verdoofde axolotl. Het ventrikel wordt benaderd met behulp van stompe dissectie en een voorgekoelde cryosonde wordt gedurende 10 s aangebracht om cryoletsel te induceren. De ventrale incisie wordt gehecht en het dier herstelt snel zonder tekenen van gedragsveranderingen nadat het bewustzijn is herwonnen. Controle-/schijndieren krijgen een vergelijkbare behandeling, maar ervaren een niet-gekoelde cryosonde. De hartprestaties kunnen worden gecontroleerd met behulp van echocardiografie (hoogfrequente echografiesystemen nodig, ≥20 MHz) zoals uitputtend beschreven op gezonde axolotlharten eerder²⁰, en de infarctfractie kan niet-invasief en herhaaldelijk worden geschat tijdens het regeneratieve proces. Harten met een infarct kunnen op elk moment tijdens het 3 maanden durende regeneratieve proces worden geoogst, gecryosectieerd voor histologie en gekleurd met behulp van standaardprocedures (bijv. eosine en hematoxyline of Masson's trichrome kleuring). Met name de trichrome kleuring van Masson maakt een duidelijk onderscheid mogelijk tussen infarct en gezonde delen van het ventrikel. De infarctfractie van het ventrikel wordt bepaald met behulp van stereologische technieken die eerder zijn beschreven voor cardiale studies²¹.

Protocol

Dit protocol voldoet aan alle institutionele (Universiteit van Aarhus) en nationale (Deense Nationale Dierexperimenten Inspectie protocol# 2015−15−0201−00615) voorschriften en richtlijnen voor dierenverzorging.

1. Voorbereiding van cryoprobe

1. Knip drie strengen koperdraad met een diameter van 1 mm in stukken van 10 cm.
2. Rol koperen strengen op tot één snaar.
3. Smelt met een gasbrander het ene uiteinde van de koperen draad tot een bolvormig uiteinde met een diameter van 2 mm.
   OPMERKING: Koper heeft een hoge thermische geleidbaarheid (401 W ^{m-1 K-1} bij 0 °C) en kan worden gegoten bij gemakkelijk beheersbare temperaturen (smeltpunt 1084,6 °C), maar een koperen oppervlak heeft de neiging om na verloop van tijd te corroderen, vooral als het in contact komt met bloed, wat de thermische geleidbaarheid aanzienlijk verlaagt. Een cryosonde op basis van koper moet dus af en toe worden gepolijst. Alternatieve, stabielere metalen die ook voor cryosondes kunnen worden gebruikt, zijn zilver (thermische geleidbaarheid 428 W ^{m-1 K-1} bij 0 °C, smeltpunt 961,8 °C) en goud (thermische geleidbaarheid 318 W ^{m-1 K-1} bij 0 °C, smeltpunt 1064,2 °C).
4. Verwijder de zuiger uit een spuit van 2 ml en trek de zachte rubberen kop eraf.
5. Steek het niet-bolvormige uiteinde van de koperen draad door de spuit en bind deze vast aan het pistool
6. Plaats de zuiger terug op zijn plaats in de spuit (Figuur 1A).
   NOTITIE: Wanneer de cryosonde niet in gebruik is, moet de koperen draad worden beschermd door de zuiger volledig naar achteren te trekken. Tijdens gebruik wordt de zuiger helemaal naar binnen geduwd om de koperen snaar bloot te stellen aan het koelbad.

2. Cryoletsel geïnduceerd myocardinfarct

1. Verdoof axolotl door het onder te dompelen in 200 mg/L benzocaïne verdovingsmiddel. Dertig minuten onderdompeling levert ~2,5 uur volledige anesthesie op.
   OPMERKING: Benzocaïne is onoplosbaar in water en moet eerst worden opgelost in 3 ml (per 200 mg benzocaïne) aceton die vervolgens aan het waterbad wordt toegevoegd. Langdurige onderdompeling in benzocaïne kan het herstel belemmeren, daarom moet de tijd in benzocaïne zorgvuldig worden gecontroleerd.
2. Plaats de axolotl met de buikkant naar boven op een operatieschaal (hoofd naar links voor een rechtshandige chirurg). Immobiliseer door alle lichaamsdelen behalve de thorax in te kapselen in weefseldoekjes gedrenkt in verdovende oplossing (Figuur 1B).
   OPMERKING: Het omhullen van het dier in natte weefseldoekjes zorgt voor een vochtige omgeving die cruciaal is voor een in het water levende amfibie en elimineert de noodzaak van dierenartszalf op de ogen. Gebruik geautoclaveerde instrumenten in de volgende stappen om steriliteit tijdens de operatie te garanderen.
3. Gebruik een iridectomieschaar om een longitudinale incisie van ~1 cm in de huid te maken, iets tot aan de middellijn van de thorax (Figuur 1C).
4. Gebruik een tang om de kraakbeenplaten van de borstgordel los te maken.
   OPMERKING: De borstgordel is een delicate structuur en er moet voor worden gezorgd dat de elementen niet worden beschadigd, omdat dit de latere wondgenezing en de voortbeweging en het welzijn van dieren kan belemmeren.
5. Open het blootliggende hartzakje voorzichtig met een incisie zonder de onderliggende hartstructuren te beschadigen. Voordat pericardiale vloeistof weglekt, zuigt u dit op in een spuit van 1 ml met een stompe naald van 2 gauge (Figuur 1D).
6. Plaats een stompe tang met een vaste opening (~1 cm) in de wond om de wondranden en kraakbeenplaten uit elkaar te houden (Figuur 1E).
7. Plaats de cryosonde in vloeistof N₂ met de koperdraad gedurende ten minste 2 minuten blootgesteld.
   OPMERKING: Als de massa van de koperdraad te klein is (d.w.z. te kort) of als deze onvoldoende wordt gekoeld, kan dit een ongewenste onvolledige transmurale cryobeschadiging tot gevolg hebben.
8. Veeg het blootgestelde ventrikel voorzichtig af met een wattenstaafje of stevig opgerolde tissuedoekjes om er zeker van te zijn dat er geen vloeistof op het ventrikeloppervlak aanwezig is (Figuur 1F).
9. Verwijder de cryoprobe die is afgekoeld tot -196 °C uit de vloeistof N₂ en breng deze rechtstreeks aan op het blootgestelde ventrikel (Figuur 1H). Het zal zich hechten aan het ventrikel. De plaatsing van de cryosonde moet aan de laterale zijde van het ventrikel in de richting van de top plaatsvinden om schade aan andere hartstructuren te voorkomen en om daaropvolgende transversale secties voor microscopie mogelijk te maken die zowel gezond als infarctmyocardium bevatten. Breng na 10 s de eerder verzamelde pericardiale vloeistof aan op de cryosondepunt (Figuur 1I). Hierdoor wordt de sonde ontdooid en kan deze loskomen van het ventrikel.
   OPMERKING: Het aanbrengen van de cryosonde op een ventrikel met veel water resulteert in ofwel een onvolledig cryo-infarct, als de sonde te snel wordt verwarmd, of te uitgebreide myocardiale schade, als een dunne waterlaag die het volledige oppervlak van het ventrikel bedekt, onmiddellijk wordt bevroren. Geen van beide situaties is wenselijk. In het geval van een succesvolle inductie van cryoletsel verschijnt er een kleine rode cirkelvormige zwelling op het ventrikel (Figuur 1J). Bij het hanteren van schijndieren wordt een niet-gekoelde cryosonde gedurende 10 s op dezelfde manier geplaatst (Figuur 1G).
10. Plaats het hartzakje bovenop het ventrikel, verwijder de tang die de wond open hield en herschik de kraakbeenplaten van de borstgordel.
    OPMERKING: Bij het uitvoeren van een daaropvolgende echocardiografie om de hartfunctie te evalueren, is het van cruciaal belang dat alle luchtbellen, zelfs minuscule belletjes die onder de kraakbeenplaten kunnen voorkomen, worden verwijderd, aangezien deze beeldvormingsartefacten veroorzaken. Deze belletjes kunnen worden verwijderd door voorzichtig op het weefsel te drukken of door geautoclaveerde amfibieënoplossing (6,6 g/L NaCl, 0,15 g/L KCl, 0,15 g/L CaCl₂, 0,2 g/L NaHCO₃ in gedestilleerd water) aan het wondoppervlak toe te voegen om de luchtbellen op te lossen.
11. Hecht de huid (3-5 steken) met oplosbare draad (6-0) (Figuur 1K).
12. Bedek het operatiegebied met natte weefseldoekjes die boven de wond worden getild en laat vervolgens weken met een verdovende oplossing.
13. Plaats de operatieschaal met het dier gedurende 2 uur op ijs om de eerste vorming van een wondepidermis mogelijk te maken, waarbij de wondranden worden afgedicht voordat het dier wordt blootgesteld aan zijn niet-steriele wateromgeving.
14. Breng het dier over naar een schone bak met aquariumwater. Het dier zou tegen die tijd weer bij bewustzijn moeten zijn. Observeer het dier totdat het weer volledig bij bewustzijn is en gecoördineerde bewegingen heeft. Stop twee dagen na de operatie met voeren en water verversen en houd de axolotl alleen in zijn eigen aquarium om de wond te kunnen sluiten voordat de verstoringen opnieuw worden geïntroduceerd.
    OPMERKING: Nadat ze weer bij bewustzijn zijn gekomen, hebben de meeste axolotls de wens om lucht te slikken. Om dit proces te vergemakkelijken en de benodigde hoeveelheid beweging te beperken, kan het nuttig zijn om het waterpeil in het aquarium kort na de operatie gedurende 1-2 dagen na de operatie te verlagen. Een lage concentratie benzocaïne (20 mg/L) kan 24 uur na de operatie als pijnstiller worden gebruikt.

3. Niet-invasieve meting van de infarctfractie met echocardiografie

1. Verdoof axolotl zoals beschreven in stap 2.1.
2. Plaats het dier in rugligging in een kleine container met 3-5 mm anesthesieoplossing die het ventrale oppervlak bedekt.
3. Plaats de ultrasone transducer langs de lange as van het dier, iets rechts van de middellijn van het thoracale gebied.
4. Voor een tweedimensionale schatting van de infarctfractie [IF(echografie, 2D)], vertaalt u de transducer totdat de infarctzone en het ventrikel maximaal lijken op de B-modus (Figuur 2A-D, aanvullend materiaal 1-2).
5. Verkrijg ≥3 hartcycli met > 50 frames/s.
6. Meet de dwarsdoorsnede van het ventrikel (CSAv) en van de infarctzone (CSAi) aan het einde van de diastole en schat de tweedimensionale infarctfractie door de vorm van een sferisch ventrikel en een hemisferisch infarctgebied aan te nemen met behulp van de vergelijking:
   (1)
   OPMERKING: Om de geometrische aannames van de vorm van het ventrikel en de overtredingszone te evalueren, kan de transducer 90° worden gedraaid om de korte asweergave van het hart weer te geven (Figuur 2EF, aanvullend materiaal 3).
7. Voor een driedimensionale schatting van de infarctfractie plaatst u de transducer naar links of rechts totdat slechts een klein deel van het ventrikel zichtbaar is aan het einde van de ventriculaire diastole.
8. Beweeg de transducer in stappen (z) van 0,5 mm (voor kleine dieren ≤ 20 g) of 1 mm (grote dieren, lichaamsgewicht > 20 g) over het ventrikel en verkrijg ten minste 3 hartcycli per stap/plak.
   OPMERKING: Voor een redelijke precisie moeten 8 – 12 plakjes (n) worden verkregen.
9. Meet CSAv en CSAi aan het einde van de diastole voor elk plakje (j) en schat de driedimensionale infarctfractie [IF (echografie, 3D)] zonder geometrische aannames van de vorm van het ventrikel en de breuk met behulp van de vergelijking:
   (2)
   OPMERKING: Zowel tweedimensionale als driedimensionale acquisitie kunnen worden gebruikt om de hartfunctie (slagvolume en hartminuutvolume) geometrisch te meten, zoals beschreven in secties 3 en 6 van Dittrich et al. (2018)²⁰. Evenzo kunnen gepulseerde golfsnelheid-verworven snelheidstijdintegralen (Figuur 2G) ook worden gebruikt om de hartfunctie te meten, zoals beschreven in sectie 3 in Dittrich et al. (2018)²⁰.
10. Extraheer interessegebieden van getekende CSAv en CSAi in stap 3.9 als binaire maskers met z-afstand tussen plakjes om het ventrikel en de infarctzone aan het einde van de diastole en de eindsystole driedimensionaal te modelleren (Figuur 2H, aanvullend materiaal 4).

4. Onbevooroordeelde kwantitatieve histologie om infarctfractie te meten

1. Verken het hart van een verdoofde axolotl beschreven in stap 2.2 – 2.6.
2. Injecteer met een spuit van 1 ml uitgerust met een naald van 26 gauge langzaam 5 μl/g lichaamsgewicht van 1000 IE/ml gehepariniseerde amfibie Ringer-oplossing in de sinus venosus en wacht 2 minuten om het antistollingsmiddel in de bloedsomloop te laten verspreiden.
3. Euthanaseren door onthoofding en hersenpiding en snijdsel het hele hart weg door eerst de instroomvaten door te snijden en vervolgens het uitstroomkanaal.
4. Breng het hart over door het voorzichtig bij het uitstroomkanaal op te tillen naar een 60 × 15 mm² petrischaaltje met amfibieënoplossing van Ringer.
5. Spoel onder vergroting het resterende bloed in het hart weg door de sinus venosus voorzichtig te vullen met 100 IE/ml gehepariniseerde Ringer-oplossing.
   OPMERKING: Hoewel prefixatie van het hart kan worden uitgevoerd door het hart te perfunderen met gebufferde formaline of paraformaldehyde, is dit niet nodig, aangezien het doorsnijden bij vriestemperatuur wordt uitgevoerd. Vervolgens kan de bevestiging van de secties op glasplaatjes worden uitgevoerd. Een volledig gewassen hart ziet er bleek en witachtig uit en bevat geen sporen van rode bloedcellen. Kleine bloedstolsels op het oppervlak van ventrikel en atria zullen zich waarschijnlijk vormen. Ze hebben geen invloed op de precisie in de daaropvolgende kwantitatieve histologieprocedure.
6. Breng het hart over op pluisvrij tissuepapier om gedurende 1 minuut te deppen.
7. Bereid een cryomold van voldoende grootte voor door een enkele druppel optimale snijtemperatuurverbinding aan te brengen en het hart naar de druppel over te brengen. Knijp het hart voorzichtig naar de bodem.
8. Breng meer optimale snijtemperatuurcompound aan om de cryomold te vullen en zorg ervoor dat het ventrikel op de bodem blijft. Laat de vorm 5 minuten staan om de optimale snijtemperatuurverbinding in het monster te laten verdelen.
9. Vries de mal snel in door deze op een deksel van een pipetpuntdoos te plaatsen die op vloeibare stikstof drijft.
   OPMERKING: Voor een meer gecontroleerde snelle bevriezing kunnen harten 1 uur per nacht worden bewaard in een 10-30% sucrose-oplossing en kan snel invriezen worden uitgevoerd met behulp van met vloeibare stikstof gekoeld isopentaan (2-methylbutaan). Onze ervaring is dat het eindresultaat niet duidelijk anders is.
10. Tempereer de cryomold in een cryostaat die is ingesteld op -18 tot -22 °C gedurende ten minste 1 uur voordat u hem in secties snijdt.
11. Doorsnede het monster met een plakdikte van 10 μm en verzamel elke 10e^{plak om} een plaatdikte (t) van 100 μm te verkrijgen. Ga door met doorsnijden totdat het hele hart is doorgesneden.
    OPMERKING: Er kunnen verschillende plak- en plaatdiktes worden gebruikt, maar het is belangrijk dat het verzamelen van plakjes begint op het punt waar het mes het ventrikel raakt en dat het hele hart wordt doorgesneden met ten minste 10-12 gelijkmatig verdeelde platen. Er kan meer dan één plak per plaat worden verzameld om dubbele sets te leveren.
12. Kleurt weefselsecties met standaardprotocollen voor hematoxyline en eosine of Masson's Trichrome om een duidelijk onderscheid te maken tussen epicardium, myocardium, kleppen en infarctzone.
13. Digitaliseer de weefselsectie met behulp van een camera, microscoop of diascanner met voldoende vergroting om de getrabeculeerde structuur van het axolotlventrikel duidelijk te onthullen (Figuur 2I).
14. Laad de afbeeldingsstapel in ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/index.html) en initialiseer de plug-in voor de cellenteller (https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html).
15. Voer een multifunctionele rastermacro (https://imagej.nih.gov/ij/macros/Multipurpose_grid.txt) uit en genereer een puntraster met een voldoende rasterdichtheid.
    OPMERKING: De dichtheid van het raster (rastergebied) is afhankelijk van de steekproefgrootte en morfologie. Om een gewenste precisie te bieden, moeten ten minste 100-200 snijpunten van rasterpunten en elk van de interessante structuren worden gewaarborgd.
16. Tel het aantal snijpunten tussen het puntraster en de interessante structuren met behulp van de plug-in voor de cellenteller (Figuur 2I, vergroting aan de rechterkant).
    OPMERKING: Voor de nauwkeurigheid is het belangrijk om alleen die snijpunten op te nemen die precies op het richtpunt van het dradenkruis verschijnen.
17. Bereken de infarctfractie uit het vooraf gedefinieerde puntrastergebied [Ai(p) en Av(p)], de plaatdikte en het aantal puntrastersnijpunten op elke plaat (P_j) met infarct myocardium en totaal ventriculair myocardium met behulp van de formule:
    (3)

Resultaten

Bij axolotls met een lichaamsgewicht van 11,8 ± 1,3 g en een totale lengte van 11,8 ± 0,5 cm, resulteert de cryoletselprocedure uitgevoerd met een cryosonde met een diameter van 2 mm (diameter) in een infarct dat 45,4 ± 14,2% van het ventriculaire myocardium beslaat 7 dagen na het letsel waarin de infarctzone volledig is ontwikkeld [Figuur 2I, vergelijk het gedeelte van een gezonde hartpre-overtreding (boven) en 7 dagen na de overtreding (onder)]. De procedure heeft een sterftecijfer van 2,2% (2/90 dieren). De procedure resulteert in een goed gedefinieerde letselzone die kan worden gevisualiseerd, gekwantificeerd en gemodelleerd met niet-invasieve echocardiografie (Figuur 2C-H, aanvullend materiaal 1-4). Aanvankelijk heeft door cryoletsel geïnduceerd myocardinfarct een significante invloed op de hartfunctie, waardoor het slagvolume wordt verminderd tot 62,2% en het hartminuutvolume tot 73,9% 7 dagen na het letsel ten opzichte van vóór het letsel met een geleidelijk herstel van vorm en functie gedurende drie maanden (gegevens niet weergegeven). Er worden geen gedragsveranderingen na myocardiale cryobeschadiging waargenomen bij de relatief rustige axolotl.

Figuur 1: Procedure voor cryo-infarct. A, een op maat gemaakte cryosonde wordt gemaakt door drie koperdraden op te rollen, de punt in een bol te smelten en de draad aan de zuiger van een spuit van 2,5 ml te bevestigen. B-L, de cryo-infarctprocedure. Na het omhullen van alle lichaamsdelen behalve de operatiezone in natte weefseldoekjes (B), wordt een ventrale incisie op de thorax iets rechts van de middellijn (weergegeven op B) uitgevoerd met een iridectomieschaar (C) en wordt de borstgordel bevrijd door stompdissectie. Het hartzakje wordt voorzichtig geopend met een incisie en de pericardiale vloeistof wordt met behulp van een stompe naald van 23 gauge (D) in een spuit van 1 ml opgezogen. Het ventrikel wordt blootgelegd en de wond wordt opengehouden met een tang met een vooraf gedefinieerde openingsbreedte (E) en alle resterende vloeistof op het ventrikel wordt weggeveegd (F). Voor schijnchirurgie wordt een niet-gekoelde cryoprobe (G) op dezelfde manier aangebracht als bij cryoletsel, waarbij de cryoprobe gekoeld in vloeibare stikstof (-196 °C) wordt aangebracht op de laterale wand van het ventrikel in de richting van de top (H). Na 10 s wordt de pericardiale vloeistof opnieuw op de cryosonde aangebracht om deze uit het ventrikel (I) vrij te maken. Dit levert een duidelijk afgebakende cryoletselzone (J) op. Ten slotte worden het hartzakje en de borstgordel bovenop het hart gelegd en wordt de huid gehecht (3-5 steken) met een oplosbare hechting (K). Het dier wordt 2 uur op ijs gelaten om het wondgenezingsproces (L) op gang te brengen. De schedel is naar links gericht op BL en vertegenwoordigt de oriëntatie van het dier voor een chirurg met een dominante rechterhand. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Verwachte resultaten. A en B, B-modus lange as beelden van gezond axolotellventrikel in diastole (A) en systole (B). C en D, B-modus lange as beelden van cryogewond (2 dagen na letsel) axolotlventrikel in diastole (C) en systole (D). E en F, B-modus korte asbeelden van cryogewond (2 dagen na letsel) axolotlventrikel in diastole (E) en systole (F). G, Pulsgolf Doppler verwierf snelheidstijdintegralen van pre (boven) en 2-daagse post-infarct hart (onder). H, Modellering van pre-infarct en 2-daagse post-infarct hart door driedimensionale echografie. I, representatieve transversale histologie doorsnijdt de axolotlventrikel 4 dagen na de schijnvertoning (boven) en 7 dagen na het infarct (onder) gekleurd met Masson's Trichrome. Vergroting aan de rechterkant toont een puntraster voor stereologische meting van de infarctfractie. Punten gemarkeerd door blauwe en rode cirkels vertegenwoordigen het snijpunt met gezond (blauwe cirkels) en infarct (rode cirkels) weefsel. Craniaal is naar rechts in A-D en dieren rechts is naar links in E-F, wat de conventionele weergave van echocardiografische beelden vertegenwoordigt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullend materiaal 1: Lange as, gezond ventrikel pre-infarct, B-modus (zie figuur 2A-B). Klik hier om deze video te downloaden.

Aanvullend materiaal 2: Lange as, infarct ventrikel (2 dagen na infarct), B-modus (zie figuur 2C-D). Klik hier om deze video te downloaden.

Aanvullend materiaal 3: As met korte as, infarct ventrikel (2 dagen na infarct), B-modus (zie figuur 2E-F). Klik hier om deze video te downloaden.

Aanvullend materiaal 4: Driedimensionale interactieve modellen van hetzelfde hart zoals te zien in figuur 2A-H en aanvullend materiaal 1-3 voor en na het infarct. Start het interactieve PDF-bestand in Adobe Acrobat Reader 9 of hoger. Klik op het model om de 3D-functie te activeren. Draai, zoom en pan het model met behulp van de cursor. In de modelboom aan de linkerkant van het scherm kunnen alle segmenten worden geactiveerd/gedeactiveerd of transparant worden gemaakt. De modelstructuur is opgebouwd uit een hiërarchie die verschillende sublagen bevat die kunnen worden geopend (door + te selecteren). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Om experimentele variatie tot een minimum te beperken, moet de chirurgische procedure van de cryoverwonding steriele procedures volgen en moet chirurgische training worden gegeven aan een aantal dieren voordat wordt geprobeerd dieren te gebruiken voor specifieke regeneratieve experimenten. Met training kan de cryoinjury-procedure worden uitgevoerd op een groot aantal axolotl-groottes en leeftijden, van juvenielen (5 g, 7 cm) tot grote volwassenen (100 g, 25 cm). Het is van cruciaal belang dat de cryosonde voldoende groot is en voldoende wordt gekoeld om een robuuste en herhaalbare cryobeschadiging van het axolotlventrikel te bieden. Voor zeer kleine dieren (5-8 g, 7-9 cm) kan de cryosonde met een kleinere diameter worden geconstrueerd. Hoewel het absoluut noodzakelijk is dat het cryoinjury-protocol wordt uitgevoerd met behulp van een anestheticum met pijnstillende eigenschappen zoals benzocaïne en MS-222 (of met de aanvullende toepassing van een secundair analgeticum), kan de follow-up echocardiografie worden uitgevoerd met andere anesthetica met slechts beperkte analgetische eigenschappen, zoals propofol, waarvan is beschreven dat het de hartfunctie minder beïnvloedt dan benzocaïne en MS-222 in de axolotl²².

De cryoinjury-procedure is beperkt in die zin dat het geen door ischemie geïnduceerd myocardinfarct door occlusie van de kransslagader veroorzaakt op dezelfde manier als procedures voor het afbinden van de kransslagader die meer lijken op klinische gevallen van myocardinfarct bij mensen. De op ligatie gebaseerde methode is echter niet toepasbaar in het getrabeculeerde amfibieënhart met zeer weinig coronair vaatstelsel en een grotendeels luminale zuurstoftoevoer. Ook is beschreven dat cryoinjury-geïnduceerd myocardinfarct de meeste pathologische gevolgen van door ischemie geïnduceerde myocardinfarcten samenvat^14,16. De letselzone die wordt gegenereerd door cryoletsel is sterk gelokaliseerd in het weefsel in de buurt van de cryosonde en hoewel dit niet lijkt op een complex en vertakt infarct als gevolg van coronaire blokkade, is het voordelig in een experimentele setting omdat de grenszone tussen gezond en infarctweefsel gemakkelijk kan worden herkend en de progressie van nieuw gevormde cardiomyocyten kan worden bestudeerd.

De axolotl is een aanzienlijk groter dier dan de zebravis met een ingewikkelder cardiovasculair systeem, inclusief een hart dat bestaat uit drie kamers (twee atria, één ventrikel) en een functionele, maar niet anatomische, scheiding van de bloedstroom in zuurstofrijke en zuurstofarme stromen²³ in vergelijking met het hart- en seriële stroomsysteem met twee kamers dat bij teleosten wordt aangetroffen. De cryoinjury-procedure die eerder bij de zebravis is beschreven, omvat geen postoperatieve hechting van het ingesneden ventrale oppervlak ^16,17. Dit is nodig in de axolotl om onnodige blootstelling van het hart aan het niet-steriele aquatische milieu in de laboratoriumhabitat van het dier te voorkomen.

Onbevooroordeelde, op stereologie gebaseerde kwantitatieve histologie wordt momenteel ondergerapporteerd in het regeneratieve veld, waarin de meeste kwantitatieve metingen van de infarctfractie berusten op gebied, tekening op histologische sectie in de zone midden van het infarct, en in sommige gevallen twee aangrenzende secties²⁴. Aangezien het concept van stereologie kan worden toegepast in histologisch onderzoek in elke modelsoort om robuustere en onbevooroordeelde metingen te verkrijgen, stellen we voor dat deze vrij beschikbare methode wordt opgenomen in kwantitatieve evaluaties van hartregeneratie, niet alleen in de axolotl, maar in alle regeneratieve soorten.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
S&T Scissor SAS-15	S&T AG - Microsurgical Instruments		Iridectome schaar
Vevo 2100	Fujifilm, VisualSonics		Hoge frequentie echografie scanner