In de huidige studie wordt de expressie neergehaald van twee stroomafwaartse signaalcomponenten van de PERK-route, de cytoprotectieve calcineurine en de pro-apoptotische CHOP, door specifieke shRNA's te gebruiken. Op tegenovergestelde manieren moduleren deze de gevoeligheid van primaire corticale neuronen voor neurietatrofie na inductie van endoplasmatische reticulumstress.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Moleculaire modulatie door lentivirus-geleverde specifieke shRNA's in endoplasmatisch reticulum gestreste neuronen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De accumulatie van ongevouwen eiwitten in het endoplasmatisch reticulum (ER), veroorzaakt door een stressconditie, activeert de ongevouwen eiwitrespons (UPR) door de activering van gespecialiseerde sensoren. UPR probeert eerst de homeostase te herstellen; Maar als de schade aanhoudt, induceert de signalering apoptose.
Er is steeds meer bewijs dat aanhoudende en onopgeloste ER-stress bijdraagt aan veel pathologische aandoeningen, waaronder neurodegeneratieve ziekten. Omdat de UPR het lot van de cel regelt door te schakelen tussen cytoprotectieve en apoptotische processen, is het essentieel om de gebeurtenissen te begrijpen die deze overgang definiëren, evenals de elementen die betrokken zijn bij de modulatie ervan.
Onlangs hebben we aangetoond dat abnormale GM2-ganglioside-accumulatie uitputting van ER Ca2 + -inhoud veroorzaakt, wat op zijn beurt PERK (PKR-like-ER kinase), een van de UPR-sensoren, activeert. Bovendien neemt PERK-signalering deel aan de neurietatrofie en apoptose geïnduceerd door GM2-accumulatie. In dit opzicht hebben we een experimenteel systeem opgezet dat ons in staat stelt om de expressie van downstream PERK-componenten moleculair te moduleren en zo de kwetsbaarheid van neuronen om neuritische atrofie te ondergaan te veranderen.
We voerden knockdown van calcineurine (cytoprotectief) en CHOP (pro-apoptotisch) expressie uit in corticale neuronale culturen van ratten. Cellen werden geïnfecteerd met lentivirus-geleverd specifiek shRNA en vervolgens behandeld met GM2 op verschillende tijdstippen, gefixeerd en immunogekleurd met anti-MAP2 (microbuis-geassocieerd eiwit 2) antilichaam. Later werden celbeelden opgenomen met behulp van een fluorescentiemicroscoop en werd de totale neurietuitgroei geëvalueerd met behulp van de beeldverwerkingssoftware ImageJ in het publieke domein. De remming van de expressie van die PERK-signaleringscomponenten maakte het duidelijk mogelijk om de neuritische atrofie veroorzaakt door ER-stress te versnellen of te vertragen.
Deze benadering kan worden gebruikt in celsysteemmodellen van ER-stress om de kwetsbaarheid van neuronen voor neurietatrofie te evalueren.
Inleiding
Endoplasmatisch reticulum (ER) stress wordt gedefinieerd als elke verstoring die het eiwitvouwvermogen in het organel in gevaar brengt. De accumulatie van ongevouwen eiwitten in het ER-lumen activeert een transductiecascadesignaal dat de ongevouwen eiwitrespons (UPR) wordt genoemd. Deze complexe signaalroute wordt georkestreerd door drie stresssensoren: PERK (protein kinase RNA [PKR]-like ER kinase), IRE1 (inositol-vereisend enzym 1) en ATF6 (geactiveerde transcriptiefactor 6). Allemaal samen proberen ze de homeostase te herstellen. Maar als stress aanhoudt, induceert UPR uiteindelijk celdood door apoptose1.
PERK, ee....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De dierprocedures worden uitgevoerd volgens goedgekeurde protocollen van de National Institute of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. De goedkeuring om de studie uit te voeren wordt verleend door de Animal Care and Ethics Committee (CICUAL) van INIMEC-CONICET-UNC (Resolutienummers 014/2017 B en 006/2017 A).
1. Primaire corticale neuronculturen bij ratten
- Verdoof E18 Wistar zwangere ratten in een CO 2-kamer met een mengsel van 80% CO 2/20% O2 gedurende 60 s blootstelling en offer vervolgens door de halswervels te ontwrichten.
- Voer de volgende stappen uit in een laminai....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Hier gaan we in op de vraag of het uitschakelen van twee PERK downstream-componenten de overgangsfase van UPR in een ER-stresscelmodel beïnvloedt. Om dit te bereiken, leggen we het CN-Aα-gen en het CHOP-gen het zwijgen op door twee specifieke shRNA-sequenties voor elk (tabel 1) in primaire neuroncelkweek gedurende 1 dag10. De expressie wordt geanalyseerd door Western blotting (figuur 1 en figuur 2). Een d.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
We beschrijven een experimenteel systeem dat moleculaire modulatie van de overgang van overleving naar apoptotische UPR-fasen mogelijk maakt in een neuronaal celmodel.
Voor een goede analyse van neurietatrofie is het essentieel om primaire neuronculturen te verkrijgen met talrijke, lange, sterk vertakte processen 9,11. Dit vergemakkelijkt het onderzoek van neuronprocesuitbreiding, waardoor de duidelijke verschillen tussen behandelingen.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen.
Dankbetuigingen
We danken Dr. Gonzalo Quasollo voor zijn onschatbare hulp bij beeldvorming en Dr. Andrea Pellegrini voor technische ondersteuning van celkweek.
Dit onderzoek werd ondersteund door subsidies van: het National Institute of Health, USA (#RO1AG058778-01A1, Subaward Agreement No 165148/165147 tussen UTHSCSA-Instituto Investigación Médica M y M Ferreyra) en van het National Agency of Agencia Nacional de Scientific and Technological Promotion, Argentinië (ANPCyT, PICT 2017 #0618).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
```html
```
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor 488 anti-Mouse | Thermo Fisher Scientific | #R37120 | |
| anti-CHOP | Thermo Fisher | # MA1 - 250 | |
| Anti-CN-Aα | Millipore | # 07-067 | |
| Anti-GM2 | Matreya | #1961 | |
| anti-MAP2 | Sigma Aldrich | # M2320 | |
| anti-β-actin | Thermo Fisher | # PA1 - 183 | |
| aprotinin | Santa Cruz Biotechnology | #3595 | |
| Axiovert 200 epifluorescence microscope | Zeiss | ||
| B27 supplement | Life Technologies | #17504944 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Life Technologies | #11966025 | |
| EcoRI | Promega | #R6011 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Life Technologies | #16000044 | |
| Fine-tippeds forceps style #5 | Dumont | ||
| Forcep style #3 | Dumont | ||
| HEK 293 | ATCC | #CRL-1573 | |
| IRDye 680 CW secundair antilichaam | LI-COR Biosciences | #92632221 | |
| IRDye 680 secundair antilichaam | LI-COR Biosciences | #92632220 | |
| IRDye 800 CW secundair antilichaam | LI-COR Biosciences | #92632210 | |
| IRDye 800 CW secundair antilichaam | LI-COR Biosciences | #92632211 | |
| lentiviral envelop plasmid pMD2.G | Addgene | #12259 | |
| lentiviral packing plasmid psPAX2 | Addgene | #12260 | |
| lentiviral vector pLKO.3G | Addgene | #14748 | |
| Leupeptine hemisulfaat | Santa Cruz Biotechnology | #295358 | |
| Lipofectamine LTX & Plus Reagens (plasmide transfectiereagens) | Life Technologies | #A12621 | |
| MISSION shRNA | Sigma Aldrich | ||
| Monosialoganglioside GM2 | Matreya | #1502 | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ||
| Neurobasal Medium | Life Technologies | #21103049 | |
| Nitrocellulose membraan 0.45 µm | BIO-RAD | #1620115 | |
| Odyssey infrarood beeldvormingssysteem | LI-COR Bioscience | ||
| OneShot Top 10 | Life Technology | #C404010 | |
| Opti-MEM (Gereduceerd serum media) | Life Technologies | #105802 | |
| PacI | BioLabs | #R0547S | |
| penicilline-streptomycine | Life Technologies | #15140122 | |
| Pepstatin A | Santa Cruz Biotechnology | #45036 | |
| fenylmethylsulfonylfluoride | Santa Cruz Biotechnology | #329-98-6 | |
| Poly-L-lysine | sigma aldrich | P#2636 | |
| Rechte scherpe kleine veerschaar | Fine Science Tools | ||
| T4 DNA Ligase | Promega | #M1801 | |
| Trypsin-EDTA 0.25 % | Life Technologies | #25200056 | |
| Vibra-Cell Ultrasonic Liquid Processor (VCX 130) | Sonics | ||
| Wizard plus SV Minipreps DNA-zuiveringssysteem | Promega | #A1330 |
Referenties
- Schroder, M., Kaufman, R. J. The mammalian unfolded protein response. Annual Review of Biochemistry. 74, 739-789 (2005).
- Cui, W., Li, J., Ron, D., Sha, B. The structure of the PERK kinase domain suggests the mechanism for its act....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
