In de huidige studie wordt de expressie neergehaald van twee stroomafwaartse signaalcomponenten van de PERK-route, de cytoprotectieve calcineurine en de pro-apoptotische CHOP, door specifieke shRNA's te gebruiken. Op tegenovergestelde manieren moduleren deze de gevoeligheid van primaire corticale neuronen voor neurietatrofie na inductie van endoplasmatische reticulumstress.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Moleculaire modulatie door lentivirus-geleverde specifieke shRNA's in endoplasmatisch reticulum gestreste neuronen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De accumulatie van ongevouwen eiwitten in het endoplasmatisch reticulum (ER), veroorzaakt door een stressconditie, activeert de ongevouwen eiwitrespons (UPR) door de activering van gespecialiseerde sensoren. UPR probeert eerst de homeostase te herstellen; Maar als de schade aanhoudt, induceert de signalering apoptose.
Er is steeds meer bewijs dat aanhoudende en onopgeloste ER-stress bijdraagt aan veel pathologische aandoeningen, waaronder neurodegeneratieve ziekten. Omdat de UPR het lot van de cel regelt door te schakelen tussen cytoprotectieve en apoptotische processen, is het essentieel om de gebeurtenissen te begrijpen die deze overgang definiëren, evenals de elementen die betrokken zijn bij de modulatie ervan.
Onlangs hebben we aangetoond dat abnormale GM2-ganglioside-accumulatie uitputting van ER Ca2 + -inhoud veroorzaakt, wat op zijn beurt PERK (PKR-like-ER kinase), een van de UPR-sensoren, activeert. Bovendien neemt PERK-signalering deel aan de neurietatrofie en apoptose geïnduceerd door GM2-accumulatie. In dit opzicht hebben we een experimenteel systeem opgezet dat ons in staat stelt om de expressie van downstream PERK-componenten moleculair te moduleren en zo de kwetsbaarheid van neuronen om neuritische atrofie te ondergaan te veranderen.
We voerden knockdown van calcineurine (cytoprotectief) en CHOP (pro-apoptotisch) expressie uit in corticale neuronale culturen van ratten. Cellen werden geïnfecteerd met lentivirus-geleverd specifiek shRNA en vervolgens behandeld met GM2 op verschillende tijdstippen, gefixeerd en immunogekleurd met anti-MAP2 (microbuis-geassocieerd eiwit 2) antilichaam. Later werden celbeelden opgenomen met behulp van een fluorescentiemicroscoop en werd de totale neurietuitgroei geëvalueerd met behulp van de beeldverwerkingssoftware ImageJ in het publieke domein. De remming van de expressie van die PERK-signaleringscomponenten maakte het duidelijk mogelijk om de neuritische atrofie veroorzaakt door ER-stress te versnellen of te vertragen.
Deze benadering kan worden gebruikt in celsysteemmodellen van ER-stress om de kwetsbaarheid van neuronen voor neurietatrofie te evalueren.
Inleiding
Endoplasmatisch reticulum (ER) stress wordt gedefinieerd als elke verstoring die het eiwitvouwvermogen in het organel in gevaar brengt. De accumulatie van ongevouwen eiwitten in het ER-lumen activeert een transductiecascadesignaal dat de ongevouwen eiwitrespons (UPR) wordt genoemd. Deze complexe signaalroute wordt georkestreerd door drie stresssensoren: PERK (protein kinase RNA [PKR]-like ER kinase), IRE1 (inositol-vereisend enzym 1) en ATF6 (geactiveerde transcriptiefactor 6). Allemaal samen proberen ze de homeostase te herstellen. Maar als stress aanhoudt, induceert UPR uiteindelijk celdood door apoptose1.
PERK, een ER-transmembraaneiwit, leidt bij ER-stress de fosforylering van eukaryote initiatiefactor-2 alfa (eIF2α), waardoor de wereldwijde eiwitsynthese en dus de eiwitbelasting in het ER2 wordt verminderd. We toonden aan dat calcineurine A/B (CNA/B), een heterodimeer Ca2+ fosfatase, het cytosolische domein van PERK direct bindt, waardoor de autofosforylering toeneemt en de remming van eiwittranslatie en cel levensvatbaarheid aanzienlijk wordt verbeterd 3,4. Interessant is dat CNA / B overvloedig aanwezig is in het zoogdierbrein, waarbij twee isovormen van de subeenheid A van CN worden onderscheiden: α en β.
Onder aanhoudende ER-stress is de PERK-signaleringsroute de enige UPR-tak die geactiveerd blijft, waardoor zowel de pro-overlevings- als de apoptotische respons wordt bemiddeld. In de chronische fase is een belangrijke stroomafwaartse gebeurtenis de inductie van de transcriptiefactor, CHOP (CCAAT/enhancer binding protein homologe protein)5. Chronische ER-stress wordt ook steeds meer erkend als een gemeenschappelijke bijdrage aan een uitgebreid scala aan pathologische aandoeningen, waaronder neurodegeneratieve ziekten6. Het is belangrijk om te begrijpen hoe UPR cytoprotectieve signalering kan vergemakkelijken in plaats van celdood 7. Op dit moment is er echter weinig bekend over het exacte mechanisme dat de overgang tussen deze twee UPR-fasen regelt.
Onlangs ontdekten we dat ganglioside GM2 zich in gekweekte neuronen ophoopt in ER-membranen en luminale calciumdepletie induceert. Dit activeert op zijn beurt PERK-signalering, die neurietatrofie en apoptose 8 bemiddelt. In deze studie wordt de GM2-opbouw in gekweekte neuronen gebruikt als een celsysteemmodel van ER-stress-geïnduceerde neurietatrofie. In het bijzonder worden twee PERK-factorexpressies gemanipuleerd, CN-Aα en CHOP, die de overgang tussen vroege / beschermende gebeurtenissen en een chronische / apoptotische fase schakelen. Om dit te bereiken, worden de respectievelijke genen tot zwijgen gebracht; zo zijn primaire corticale neuronculturen geïnfecteerd met lentivirus-geleverd specifiek shRNA. Western blot-analyse onthult een significante vermindering van CN-Aα- en CHOP-expressieniveaus in vergelijking met de controlecellen, die zijn geïnfecteerd met lentivirus dat een gecodeerd shRNA draagt. Na deze behandeling worden neuronen onderworpen aan verschillende incubatietijden van exogene GM2, gefixeerd en immunogekleurd met anti-microtubule geassocieerd eiwit 2 (MAP2) antilichaam9. Beelden worden verkregen met een epifluorescentiemicroscoop. De totale uitgroei van neuriet wordt geëvalueerd ten opzichte van het totale celaantal.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De dierprocedures worden uitgevoerd volgens goedgekeurde protocollen van de National Institute of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. De goedkeuring om de studie uit te voeren wordt verleend door de Animal Care and Ethics Committee (CICUAL) van INIMEC-CONICET-UNC (Resolutienummers 014/2017 B en 006/2017 A).
1. Primaire corticale neuronculturen bij ratten
- Verdoof E18 Wistar zwangere ratten in een CO 2-kamer met een mengsel van 80% CO 2/20% O2 gedurende 60 s blootstelling en offer vervolgens door de halswervels te ontwrichten.
- Voer de volgende stappen uit in een laminaire flowkap. Extraheer encephalon uit de embryo's met een tangstijl # 3 en rechte scherpe kleine veerschaar (Table of Materials) naar Hanks-oplossing in celkweekschalen.
- Ontleed het weefsel onder een vergrootglas van 20x, met behulp van twee tangen met een fijne punt # 5, die de frontale cortex van de hersenvliezen scheiden. Breng de frontale cortex over naar een conische buis van 15 ml en incubeer het weefsel met 3-4 ml Trypsine-EDTA (0,25%) gedurende 15 minuten, bij 37 °C voor chemische vertering.
- Verdun het na de spijsvertering met 3-4 ml Dulbecco's gemodificeerde arendmedium (DMEM) plus 10% foetaal kalfsserum (FCS). Was het vervolgens 3 keer met Ca 2+/Mg2+ vrije Hanks Balanced Salt oplossing en 0,1% glucose door centrifugeren (3000 g gedurende 5 min).
- Dissocieer het weefsel 10 keer mechanisch door op en neer te pipetteren met behulp van een 1000 μL tip, in DMEM plus 10% FCS (Table of Materials). Centrifugeer vervolgens het homogenaat op 100 x g gedurende 1 minuut, verzamel het supernatant en vul het resterende volume aan tot 1000 μL.
- Plaats de celsuspensie op celkweekschalen met een dichtheid van 520 cel/mm 2 met2 ml DMEM met 10% FCS, 1% penicilline/streptomycine en 1% van een essentieel aminozuuradditief (zie materiaaltabel). Incubeer vervolgens bij 37 °C in een bevochtigde omgeving met 5% CO 2 gedurende2 uur.
- Verwijdering van organisch materiaal en poly-L-lysine coating van celkweekschalen
- Verwijder het organische materiaal door het glasmateriaal in een reactiekamer te plaatsen en voeg 96% ethylalcohol toe om het materiaal ongeveer te bedekken. Voeg vervolgens druppelsgewijs 68% (w/v) salpeterzuur toe totdat er bruingroene bubbels beginnen te verschijnen. Zodra dit gebeurt, bedekt u de container gedeeltelijk en laat u de reactie doorgaan totdat de explosie ophoudt.
OPMERKING: Verwijder het organische materiaal onder een gaswinningscabine om blootstelling aan schadelijke gassen te voorkomen. - Spoel de glazen vóór de poly-L-lysinecoating ongeveer tien keer af met steriel Mili-Q-water. Incubeer vervolgens de kweekglazen en -schalen met 0,1 μg/μL poly-L-lysine gedurende 4 uur voordat u ze gebruikt. Spoel de glazen na incubatie ongeveer tien keer af met steriel Mili-Q water.
- Verwijder het organische materiaal door het glasmateriaal in een reactiekamer te plaatsen en voeg 96% ethylalcohol toe om het materiaal ongeveer te bedekken. Voeg vervolgens druppelsgewijs 68% (w/v) salpeterzuur toe totdat er bruingroene bubbels beginnen te verschijnen. Zodra dit gebeurt, bedekt u de container gedeeltelijk en laat u de reactie doorgaan totdat de explosie ophoudt.
- Verwijdering van organisch materiaal en poly-L-lysine coating van celkweekschalen
- Om neurale celdifferentiatie mogelijk te maken, verander je het medium voor een serumvrij neurobasaal medium, met het serumvrije supplement (Table of Materials). Houd de culturen op 37 °C met 5% CO2 tot de behandeling.
2. Lentivirus productie
OPMERKING: De oligonucleotiden die de sequenties bevatten die gericht zijn op de 3'UTR's van de CN-Aα-isovorm of CHOP en met de niet-gerichte sequenties (scrambles) zijn vermeld in tabel 1.
- Meng voor het gloeien twee enkelstrengs oligonucleotiden met complementaire sequenties in gelijke molaire hoeveelheden, met behulp van gloeibuffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,5-8,0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA).
- Verwarm gedurende 2 minuten op 95 °C en koel vervolgens langzaam af door monsters van het warmteblok of waterbad over te brengen naar een bench-top bij kamertemperatuur. Verdun het resulterende product [kort haarspeld-RNA (shRNA) met cohesieve uiteinden] tot een eindconcentratie van 0,5 μM, aliquoteer ze en bewaar ze bij -20 °C.
- Kloon de shRNA-insert in lentivirale vector pLKO.3G, met GFP als groene fluorescerende marker. Verwerk hiervoor 1 μg vector met EcoRI- en PacI-restrictie-enzymen door het volgende in een steriele buis te mengen: 2 μL 10x restrictie-enzymbuffer (100 mM bis-Tris propaan-HCl, pH 6,5, 100 mM MgCl2, 1 mg/ml runderserumalbumine), 1 μl 1 μg/μL pLKO.3G, 0,5 μL 10 E/μL ECoRI, 0,5 μl PacI (10 E/μl) en 16 μl steriel geïoniseerd water.
- Meng voorzichtig door te pipetteren. Incubeer de reactie gedurende 3-4 uur bij 37 °C.
OPMERKING: Nachtelijke verteringen zijn over het algemeen onnodig en kunnen leiden tot DNA-afbraak.
- Meng voorzichtig door te pipetteren. Incubeer de reactie gedurende 3-4 uur bij 37 °C.
- Meng voor ligatie de verteerde vector en breng deze in een molaire verhouding van 3:1 en incuber deze met de T4-ligase- en ligasebuffer (geleverd door de fabrikant) gedurende een nacht bij 16 °C.
OPMERKING: Op dit punt kan de ligatiereactie worden bewaard bij 4 °C tot verder gebruik. - Transformeer DH5α-competente cellen (materiaalopgave) of een andere geschikte E. coli-stam met de ligatiereactie als volgt.
- Meng competente E. coli met het totale volume van de ligatiereactie en koel het gedurende 15 minuten op ijs, plaats het gedurende 2 minuten in een bad van 42 °C en koel het vervolgens opnieuw gedurende 15 minuten op ijs.
- Breng het totale volume dat onderhevig is aan een hitteschok over naar een buis van 15 ml en vul het volume aan tot 1000 μl met vloeibaar medium Luria-Bertani (LB) dat eerder op 37 °C is gehouden. Schud de bacteriën gedurende 90 minuten bij 37 °C in een orbitale shaker bij ongeveer 330 tpm.
- Centrifugeer ze gedurende 5 minuten bij 5.000 x g bij 4 °C en gooi 900 μL supernatant weg. Gebruik het resterende supernatant om de pellet te resuspenderen. Verdeel de bacteriesuspensie gelijkmatig over een vaste ampicilline (100 μg / ml) LB-plaat.
- Incubeer 's nachts bij 37 °C en controleer vervolgens de bacteriegroei. Op dit punt kunnen de bacteriën gedurende 4-5 dagen bij 4 °C worden bewaard.
- Kies een enkele kolonie om over te brengen in een buis van 50 ml met 10 ml LB vloeibaar medium en ampicilline (100 μg / ml). Schud de bacteriën AAN bij 37 °C bij ongeveer 330 tpm.
- Centrifugeer de cultuur om de bacteriën gedurende 5 minuten bij 4 °C bij 5.000 x g te pelleteren, gooi het supernatant weg en bewaar de bacteriële pellet. Deze kan bewaard worden bij -20 °C.
- Zuiver het plasmide met een DNA-zuiveringskit van bacteriekorrels volgens de instructies van de fabrikant (Materiaaltabel). Bereken de DNA-concentratie door de absorptie bij 260 nm te meten en te vermenigvuldigen met de verdunningsfactor, met behulp van de volgende relatie: A260 van 1,0 = 50 μg/ml zuiver dubbelstrengs (ds) DNA.
3. Lentivirus infectie
OPMERKING: Voer de lentivirusgeneratieprocedure uit in een laminaire stroomkap van klasse II.
- Zaad 24 uur vóór transfectie 1-5 × 106 HEK 293 cellen in kweekschalen met een diameter van 100 mm in 8 ml groeimedium en incuber ze bij 37 °C, 5% CO2 gedurende een nacht.
- Meng 14 μg pKLO.3G-vector met specifieke insert, 10,5 μg verpakkingsplasmide psPAX en 3,5 μg enveloppeplasmide pMD2.G (Materiaalopgave). Verdun 45 μl plasmidetransfectiereagens (materiaaltabel) in 700 μl gereduceerde serummedia (materiaaltabel) en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Combineer vervolgens het DNA-mengsel met het verdunde plasmidetransfectiereagens, meng voorzichtig en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
- Verander ondertussen voor verse DMEM het medium van de kweekschaal van HEK 293-celculturen (70% confluent op het moment van transfectie). Voeg vervolgens druppelsgewijs het volledige volume van de DNA-oplossing toe. Rock het gerecht zachtjes. Het is niet nodig om na transfectie medium toe te voegen/te veranderen.
- Incubeer de cellen bij 37 °C, 5% CO2 gedurende 48 h- 72 h om shRNA's hun optimale transductie te laten bereiken die wordt gecontroleerd door GFP-fluorescentie met behulp van een fluorescentiemicroscoop. Verzamel daarna het medium met lentivirus en bewaar bij 4 °C.
- Filtraat viraal supernatant met een nylonmembraan van 0,45 μm. Aliquot de doorstroming in 1 ml. Vervolgens centrifugeren op 17.000 x g gedurende 4 uur. Gooi het supernatant weg en bewaar de pellet. Laat de onzichtbare pellet drogen en bewaar na droging bij - 80 °C.
- Voer virale titratie uit door fluxcytometrie. Zaai 4 x 105 HEK 293 cellen in 24-putplaten en incubeer bij 37 °C gedurende 24 uur. Resuspensie vervolgens de virale deeltjes in 200 μL DMEM-kweekmedium (tabel met materialen) en voeg 0,05, 0,02 en 0,005 μl toe aan elk putje.
- Incubeer virale infectie gedurende 72 uur, verwijder medium en trypsinize (0,05% trypsine, 1 ml) gedurende 3 minuten. Voeg 1 ml DMEM toe in 10% FCS-oplossing en centrifugeer gedurende 5 minuten op 500 x g. Gooi het supernatant weg en was de pellet twee keer met PBS.
- Resuspendeer de pellet met 100 μL PBS en fixeer de cellen met 100 μL 2% paraformaldehyde (PFA) in PBS. Analyseer de cellen met een fluxcytometer en bepaal het percentage GFP-fluorescerende cellen. Verzamel deze gegevens om virale titratie te berekenen met behulp van de volgende formule:
Virale titratie
4. Primaire neuronculturen gestrest met ganglioside GM2-accumulatie en immunocytochemie met behulp van anti-MAP2-antilichaam
- Infecteer de primaire corticale neuronculturen (15 dagen in vitro) met specifieke shRNA-oligonucleotiden gericht op de 3' UTR's van CN-Aα of CHOP en incuber ze bij 37 °C met 5% CO2 gedurende 1 dag.
OPMERKING: Primaire corticale neuronculturen van 7-8 dagen in vitro kunnen ook worden gebruikt als de cellen een hoge neurietgroei vertonen.- Bereid een 500 μM stamoplossing van ganglioside GM2 in ethanol en soniceer het gedurende 1 uur.
- Voeg GM2-stamoplossing toe aan het medium van de kweekschaal in een eindconcentratie van 2 μM. Laat incuberen bij 37 °C met 5% CO2 gedurende 16, 24 en 48 uur.
- Gebruik sommige culturen om cellulair homogenaat voor western blot-analyse te bereiden (voor antilichaamspecificatie, zie de tabel met materialen).
- Volg stap 1.4. en 1.5. en fixeer de cellen vervolgens met 4% PFA en 120 mM sucrose in PBS gedurende 20 minuten bij 37 °C en was het vervolgens met PBS. Voer deze procedure uit op een antislipmembraan in een natte kamer. Voeg daarna de permeabilisatieoplossing (0,2% Triton X-100 in PBS) gedurende 5 minuten toe en was met PBS.
- Gebruik 5% BSA verdund in PBS gedurende 45 minuten om blokkering mogelijk te maken en incubeer vervolgens met anti-MAP2-antilichaam, verdund 1:800 in blokkerende oplossing, bij 4 °C gedurende een nacht.
- Aan het einde van de incubatietijd tweemaal wassen met PBS en incuberen met secundair antilichaam (materiaaltabel) gedurende 1 uur. Was vervolgens de cellen met PBS en monteer de bril op dia's met behulp van een waterig montagemedium (Table of Materials).
5. Neuriet atrofie analyse
- Verkrijg beelden met een 20x luchtlens (NA 0.8) met behulp van een epifluorescentie-omgekeerde microscoop uitgerust met een CCD-camera. Analyseer afbeeldingen met ImageJ-plug-ins. Laad hiervoor de afbeelding in ImageJ en trek de achtergrond af door op Proces | Achtergrond aftrekken.
- Klik op afbeelding | Aanpassen | Drempel of typ de volgende toetsen: Ctrl (of Cmd) + Shift + T. Er verschijnt een venster om minimumwaarden aan te passen, waardoor pad- en soma-traceringen kunnen worden onderscheiden. Klik op de binaire afbeelding (neurieten en soma's zijn wit gekleurd). Gebruik op deze afbeelding selectie uit de vrije hand om soma's te verwijderen; Het geselecteerde Soma-gebied wordt weer zwart.
- Selecteer traceringen en klik op Bewerken | Selectie | Selectie maken. Haal de ROI door op Ctrl (of Cmd) en T-toetsen van de selectie te klikken en deze te behouden. Open de originele afbeelding, klik vervolgens op het ROI-beheerpaneel en selecteer de bijbehorende ROI, eerder verkregen. Klik vervolgens op de originele afbeelding.
- Zodra de ROI op de afbeelding is traceerd, typt u Ctrl (of Cmd) en M-toetsen (Analyseren | Meten). Er springt een raam open; Kopieer de gemiddelde waarde (willekeurige eenheden a.u.) om statistische analyse te verwerken.
OPMERKING: Om waarden als μm te verkrijgen, klikt u op Analyseren | Stel schaal in. Er verschijnt een venster om waarden in te stellen. Zorg ervoor dat u de juiste schaal toevoegt (Analyseren | Set Scale) afhankelijk van de kenmerken van de gebruikte microscoop.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Hier gaan we in op de vraag of het uitschakelen van twee PERK downstream-componenten de overgangsfase van UPR in een ER-stresscelmodel beïnvloedt. Om dit te bereiken, leggen we het CN-Aα-gen en het CHOP-gen het zwijgen op door twee specifieke shRNA-sequenties voor elk (tabel 1) in primaire neuroncelkweek gedurende 1 dag10. De expressie wordt geanalyseerd door Western blotting (figuur 1 en figuur 2). Een d...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
We beschrijven een experimenteel systeem dat moleculaire modulatie van de overgang van overleving naar apoptotische UPR-fasen mogelijk maakt in een neuronaal celmodel.
Voor een goede analyse van neurietatrofie is het essentieel om primaire neuronculturen te verkrijgen met talrijke, lange, sterk vertakte processen 9,11. Dit vergemakkelijkt het onderzoek van neuronprocesuitbreiding, waardoor de duidelijke verschillen tussen behandelingen...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen.
Dankbetuigingen
We danken Dr. Gonzalo Quasollo voor zijn onschatbare hulp bij beeldvorming en Dr. Andrea Pellegrini voor technische ondersteuning van celkweek.
Dit onderzoek werd ondersteund door subsidies van: het National Institute of Health, USA (#RO1AG058778-01A1, Subaward Agreement No 165148/165147 tussen UTHSCSA-Instituto Investigación Médica M y M Ferreyra) en van het National Agency of Agencia Nacional de Scientific and Technological Promotion, Argentinië (ANPCyT, PICT 2017 #0618).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
```html
```
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor 488 anti-Mouse | Thermo Fisher Scientific | #R37120 | |
| anti-CHOP | Thermo Fisher | # MA1 - 250 | |
| Anti-CN-Aα | Millipore | # 07-067 | |
| Anti-GM2 | Matreya | #1961 | |
| anti-MAP2 | Sigma Aldrich | # M2320 | |
| anti-β-actin | Thermo Fisher | # PA1 - 183 | |
| aprotinin | Santa Cruz Biotechnology | #3595 | |
| Axiovert 200 epifluorescence microscope | Zeiss | ||
| B27 supplement | Life Technologies | #17504944 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Life Technologies | #11966025 | |
| EcoRI | Promega | #R6011 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Life Technologies | #16000044 | |
| Fine-tippeds forceps style #5 | Dumont | ||
| Forcep style #3 | Dumont | ||
| HEK 293 | ATCC | #CRL-1573 | |
| IRDye 680 CW secundair antilichaam | LI-COR Biosciences | #92632221 | |
| IRDye 680 secundair antilichaam | LI-COR Biosciences | #92632220 | |
| IRDye 800 CW secundair antilichaam | LI-COR Biosciences | #92632210 | |
| IRDye 800 CW secundair antilichaam | LI-COR Biosciences | #92632211 | |
| lentiviral envelop plasmid pMD2.G | Addgene | #12259 | |
| lentiviral packing plasmid psPAX2 | Addgene | #12260 | |
| lentiviral vector pLKO.3G | Addgene | #14748 | |
| Leupeptine hemisulfaat | Santa Cruz Biotechnology | #295358 | |
| Lipofectamine LTX & Plus Reagens (plasmide transfectiereagens) | Life Technologies | #A12621 | |
| MISSION shRNA | Sigma Aldrich | ||
| Monosialoganglioside GM2 | Matreya | #1502 | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ||
| Neurobasal Medium | Life Technologies | #21103049 | |
| Nitrocellulose membraan 0.45 µm | BIO-RAD | #1620115 | |
| Odyssey infrarood beeldvormingssysteem | LI-COR Bioscience | ||
| OneShot Top 10 | Life Technology | #C404010 | |
| Opti-MEM (Gereduceerd serum media) | Life Technologies | #105802 | |
| PacI | BioLabs | #R0547S | |
| penicilline-streptomycine | Life Technologies | #15140122 | |
| Pepstatin A | Santa Cruz Biotechnology | #45036 | |
| fenylmethylsulfonylfluoride | Santa Cruz Biotechnology | #329-98-6 | |
| Poly-L-lysine | sigma aldrich | P#2636 | |
| Rechte scherpe kleine veerschaar | Fine Science Tools | ||
| T4 DNA Ligase | Promega | #M1801 | |
| Trypsin-EDTA 0.25 % | Life Technologies | #25200056 | |
| Vibra-Cell Ultrasonic Liquid Processor (VCX 130) | Sonics | ||
| Wizard plus SV Minipreps DNA-zuiveringssysteem | Promega | #A1330 |
Referenties
- Schroder, M., Kaufman, R. J. The mammalian unfolded protein response. Annual Review of Biochemistry. 74, 739-789 (2005).
- Cui, W., Li, J., Ron, D., Sha, B. The structure of the PERK kinase domain suggests the mechanism for its activation. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 67, 423-428 (2011).
- Bollo, M., et al. Calcineurin interacts with PERK and dephosphorylates calnexin to relieve ER stress in mammals and frogs. PLoS One. 5, 11925(2010).
- Chen, Y., Holstein, D. M., Aime, S., Bollo, M., Lechleiter, J. D. Calcineurin beta protects brain after injury by activating the unfolded protein response. Neurobiology of Disease. 94, 139-156 (2016).
- Harding, H. P., et al. An integrated stress response regulates amino acid metabolism and resistance to oxidative stress. Molecular Cell. 11, 619-633 (2003).
- Hetz, C., Saxena, S. ER stress and the unfolded protein response in neurodegeneration. Nature Reviews Neurology. 13, 477-491 (2017).
- Lin, J. H., Li, H., Zhang, Y., Ron, D., Walter, P. Divergent effects of PERK and IRE1 signaling on cell viability. PLoS One. 4, 4170(2009).
- Virgolini, M. J., Feliziani, C., Cambiasso, M. J., Lopez, P. H., Bollo, M. Neurite atrophy and apoptosis mediated by PERK signaling after accumulation of GM2-ganglioside. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1866, 225-239 (2019).
- Ferreira, A., Busciglio, J., Landa, C., Caceres, A. Ganglioside-enhanced neurite growth: evidence for a selective induction of high-molecular-weight MAP-2. The Journal of Neuroscience. 10, 293-302 (1990).
- Moore, C. B., Guthrie, E. H., Huang, M. T., Taxman, D. J. Short hairpin RNA (shRNA): design, delivery, and assessment of gene knockdown. Methods in Molecular Biology. 629, 141-158 (2010).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature Protocols. 1, 2406-2415 (2006).
- Rusnak, F., Mertz, P. Calcineurin: form and function. Physiological Reviews. 80, 1483-1521 (2000).
- Hogan, P. G., Chen, L., Nardone, J., Rao, A. Transcriptional regulation by calcium, calcineurin, and NFAT. Genes & Development. 17, 2205-2232 (2003).
- Endo, M., Mori, M., Akira, S., Gotoh, T. C/EBP homologous protein (CHOP) is crucial for the induction of caspase-11 and the pathogenesis of lipopolysaccharide-induced inflammation. Journal of Immunology. 176, 6245-6253 (2006).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
