Methodenartikel

Isolatie en karakterisering van extracellulaire blaasjes afkomstig van menselijke vetcellen met behulp van filtratie en ultracentrifugatie

DOI:

10.3791/61979

⸱

19 april 2021

 ,  ,  , 
1Division of Cardiovascular Medicine, Radcliffe Department of Medicine, University of Oxford, 2Oxford Centre for Diabetes, Endocrinology and Metabolism, University of Oxford

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We beschrijven de isolatie van extracellulaire blaasjes (EV's) afkomstig van menselijke adipocyten uit bil- en buikvetweefsel met behulp van filtratie en ultracentrifugatie. We karakteriseren de geïsoleerde adipocyt-afgeleide EV's door hun grootte en concentratie te bepalen door middel van Nanoparticle Tracking Analysis en door western blotting voor de aanwezigheid van EV-eiwit tumorgevoeligheidsgen 101 (TSG101).

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Extracellulaire blaasjes (EV's) zijn met lipiden omsloten omhulsels die biologisch actief materiaal bevatten, zoals eiwitten, RNA, metabolieten en lipiden. EV's kunnen de cellulaire status van andere cellen lokaal moduleren in weefselmicro-omgevingen of door vrijlating in perifeer bloed. Van adipocyten afgeleide EV's zijn verhoogd in het perifere bloed en vertonen veranderingen in hun lading (RNA en eiwit) tijdens metabole stoornissen, waaronder obesitas en diabetes. Van adipocyten afgeleide EV's kunnen de cellulaire status van naburige vaatcellen, zoals endotheelcellen en in vetweefsel residente macrofagen, reguleren om ontsteking van vetweefsel te bevorderen. Het onderzoeken van veranderingen in van adipocyten afgeleide EV's in vivo is complex omdat EV's afgeleid van perifeer bloed zeer heterogeen zijn en EV's bevatten uit andere bronnen, namelijk bloedplaatjes, endotheelcellen, erytrocyten en spieren. Daarom biedt de cultuur van menselijke vetcellen een modelsysteem voor de studie van van adipocyten afgeleide EV's. Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor de extractie van totale kleine EV's uit celkweekmedia van menselijke gluteale en abdominale adipocyten met behulp van filtratie en ultracentrifugatie. We demonstreren verder het gebruik van Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) voor kwantificering van EV-grootte en -concentratie en tonen de aanwezigheid van EV-eiwit tumorgevoeligheidsgen 101 (TSG101) aan in de gluteale en abdominale adipocyten afgeleide EV's. Geïsoleerde EV's uit dit protocol kunnen worden gebruikt voor stroomafwaartse analyse, waaronder transmissie-elektronenmicroscopie, proteomics, metabolomics, kleine RNA-sequencing, microarrays en kunnen worden gebruikt in functionele in vitro/in vivo studies.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Extracellulaire blaasjes (EV's) zijn met lipiden omsloten omhulsels die biologisch actief materiaal bevatten, zoals eiwitten, microRNA's, metabolieten en lipiden. De term EV's duidt verschillende subpopulaties aan, waaronder exosomen, microblaasjes (microdeeltjes/ectosomen) en apoptotische lichamen1. EV's kunnen dienen als biomarkers omdat ze betrokken zijn bij pathologische signalering en vrijkomen in biovloeistoffen, waaronder bloed en urine. EV's kunnen de cellulaire status van andere cellen lokaal moduleren in weefselmicro-omgevingen of door vrijlating in perifeer bloed2. EV's vertonen kenmerken van hun moedercel, maar differentiatie van elke subpopulatie is voornamelijk gebaseerd op EV-grootte en eiwitgehalte zoals EV's-markers, waaronder de aanwezigheid van tetraspaninen (CD9, CD63 en CD81), tumorgevoeligheidsgen 101 (TSG101) en ALG-2-interagerend eiwit X (ALIX). Deze eiwitmarkers zijn representatief voor de endosomale oorsprong (CD9, CD63 en CD81) voor exosomen, die worden gegenereerd in multi-vesiculaire lichamen of eiwitten vertegenwoordigen die geassocieerd zijn met knopvorming of bloeding rechtstreeks uit het plasmamembraan voor microblaasjes. Er is echter een aanzienlijke overlap tussen deze subpopulaties en het is moeilijk om individuele subpopulaties te onderscheiden in complexe biovloeistoffen zoals plasma, serum of urine.

Metabole stoornissen, waaronder obesitas, insulineresistentie en verstoringen in extracellulaire glucose, zuurstof en ontstekingen, kunnen de grootte en concentratie van EV's en hun lading veranderen. Van adipocyten afgeleide EV's dragen perilipine A, adiponectine en vertonen veranderingen in hun eiwit- en RNA-lading tijdens obesitas en diabetes 3,4,5,6. Van adipocyten afgeleide EV's reguleren de cellulaire status van naburige vasculaire endotheelcellen7 en in vetweefsel residente macrofagen om ontsteking van vetweefsel en insulineresistentie te bevorderen 8,9,10,11. Het onderzoeken van veranderingen in van adipocyten afgeleide EV's in vivo is complex omdat EV-populaties afgeleid van complexe biovloeistoffen zoals plasma, serum of urine EV's bevatten uit meerdere bronnen, zoals bloedplaatjes, endotheelcellen, erytrocyten en spieren, die betrokken zijn bij de pathogenese van metabole disfunctie en ziekte.

De kweek en in vitro differentiatie van menselijke preadipocyten biedt daarom een modelsysteem voor de studie van van adipocyten afgeleide EV's. Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor de extractie van totale kleine EV's uit celkweekmedia van menselijke adipocyten met behulp van spuitfiltratie en ultracentrifugatie. Ultracentrifugatie blijft een populaire isolatiemethode voor EV's omdat het gemakkelijk toegankelijk is en weinig specialistische voorkennis vereist. Andere methoden, zoals precipitatie, chromatografie met uitsluiting van grootte en het vastleggen van immunoaffiniteit met behulp van tetraspanines, maken EV-isolatie mogelijk van een reeks biovloeistoffen, waaronder plasma, serum, urine en geconditioneerde celkweekmedia. Elke methode, inclusief het hier beschreven ultracentrifugatieprotocol, produceert EV-preparaten van verschillende zuiverheid omdat de methoden oplosbare eiwitten en lipoproteïnen kunnen co-isoleren, die zich kunnen maskeren als EV's. Door dit ultra-centrifugatieprotocol te combineren met andere methoden zoals dichtheidscentrifugatie, chromatografie met uitsluiting van grootte en immunoaffiniteitsopname wordt de zuiverheid van geïsoleerde EV's drastisch verhoogd. Maar net als bij ultracentrifugatie maken deze andere methoden het niet mogelijk om onafhankelijke subpopulaties van EV's te vangen uit complexe monsters zoals bloed, plasma en urine. Daarom blijven culturen van geselecteerde celpopulaties een van de meest robuuste methoden voor het genereren van hoge opbrengsten van celspecifieke EV's. Elke EV-methode heeft een aantal kanttekeningen en de keuze van de methode kan van invloed zijn op de soorten geïsoleerde EV's en hun concentraties, wat stroomafwaarts mechanistisch onderzoek naar cellulaire en weefselsignalering en bepaling van EV-vracht voor diagnostische studies kan beïnvloeden; deze methodologische kwesties van EV-isolatie worden elders en in de secties over beperkingen onder 4,12 besproken. Hier beschrijven we de isolatie van van menselijke adipocyten afgeleide EV's met behulp van filtratie en ultracentrifugatie. We demonstreren verder het gebruik van Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) voor kwantificering van EV-grootte en -concentratie en tonen de aanwezigheid van EV-eiwit tumorgevoeligheidsgen 101 (TSG101) aan in onze van menselijke adipocyten afgeleide EV's. Geïsoleerde EV's uit dit protocol kunnen worden gebruikt voor stroomafwaartse analyse, waaronder transmissie-elektronenmicroscopie, proteomics, metabolomics, kleine RNA-sequencing, microarray, en kunnen worden gebruikt in functionele in vitro/in vivo studies.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle methoden zijn goedgekeurd door de institutionele ethische beoordelingscommissie van de Universiteit van Oxford. Vetweefsel werd verkregen door middel van naaldbiopsie onder plaatselijke verdoving van gezonde vrijwilligers.

1. Bereiding van celkweekmedium en buffers

  1. Bereid een collagenase-verteringsbuffer voor door collagenase H (1 mg/ml) op te lossen in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) (zonder calciumchloride en zonder magnesiumchloride) en steriel filter met behulp van een poriënspuitfilter van 0.2 μm.
    1. Bereid de collagenase-verteringsbuffer niet langer dan 10 minuten voor gebruik voor.
  2. Bereid het groeimedium (GM) als volgt aan: Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Ham's voedingsmengsel F12 (DMEM/F12) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 100 eenheden/ml penicilline, 100 μg/ml streptomycine, 2 mM L-glutamine en 0,5 ng/ml fibroblastgroeifactor (FGF).
  3. Bereid het basisch differentiatiemedium (basisch DM) als volgt aan: DMEM/F12 aangevuld met 100 eenheden/ml penicilline, 100 μg/ml streptomycine, 2 mM L-glutamine, 17 μM pantothenaat, 100 nM humane insuline, 10 nM trijood-L-thyronine, 33 μM biotine, 10 μg/ml transferrine en 1 μM dexamethason.
  4. Bereid een volledig differentiatiemedium (volledige DM) door de basis-DM uit stap 1.3 aan te vullen met 0,25 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine en 4 μM troglitazon.
  5. Bereid als volgt 10 mM vetzuurstockoplossingen gecomplexeerd tot 10% in wezen vetzuurvrij runderserumalbumine (BSA).
    1. Los 16 g BSA op in 160 ml DMEM/F12 en verwarm tot 37 °C. Weeg in drie afzonderlijke conische buisjes van 50 ml 150 mg natriumoleaat, 139 mg natriumpalmitaat en 151 mg natriumlinoleaat af. Voeg 50 ml van de verwarmde BSA-oplossing toe aan elke buis en meng goed door herhaalde vortexing.
    2. Leg de tubes oleaat en linoleaat gedurende 15 minuten terug in het waterbad van 37 °C. Meng door vortex tot het volledig is opgelost.
    3. Plaats voor de palmitaatoplossing de buis gedurende 2-3 minuten in een waterbad van 65 °C. Meng krachtig door vortex.
    4. Herhaal stap 1.5.3 tot het volledig is opgelost - ongeveer 30 minuten.
      OPMERKING: Er kunnen nog enkele kleine deeltjes zichtbaar zijn.
    5. Steriel filtreer de vetzuuroplossingen met behulp van een poriënspuitfilter van 0,2 μm.
    6. Controleer de concentratie van niet-veresterde vetzuren van elke stamoplossing met behulp van een geschikte analyse.
      OPMERKING: De vetzuurvoorraden moeten 10 mM (±10%) zijn om een molaire verhouding van 6:1 tussen vetzuur en BSA te geven. Als de concentratie buiten dit bereik ligt, moet de stamoplossing opnieuw worden gemaakt. Voorraadoplossingen kunnen worden gesorteerd en bewaard bij -30 °C.

2. Vertering van biopten van menselijk vetweefsel

  1. Zeef de inhoud van de biopsiespuit langzaam door een steriele celzeef van 200 μm die is bevestigd aan een conische buis van 50 ml, zodat het vetweefsel in de zeef wordt opgevangen.
  2. Breng de zeef over in een nieuwe conische buis van 50 ml en was het vetweefsel driemaal met 10 ml HBSS.
    OPMERKING: Het kan nodig zijn om bloedstolsels en vezelig weefsel te verwijderen met een chirurgische schaar of om de HBSS-wasbeurt te herhalen om overtollige rode bloedcellen te verwijderen.
  3. Weeg het gewassen weefsel.
    OPMERKING: We verkrijgen doorgaans 400-800 mg weefsel door middel van naaldbiopsie.
  4. Doe de collagenase-digestiebuffer in een steriele conische buis van 50 ml en voeg het gewassen weefsel toe. Een chirurgische schaar kan bij deze stap worden gebruikt om het weefsel in stukken van gelijke grootte te hakken.
    OPMERKING: Gebruik 5 ml buffer per weefsel van 0,5 g. Voor groter weefsel kunnen monsters worden fijngehakt in een petrischaaltje.
  5. Plaats de buis in een schudwaterbad van 37 °C en incubeer gedurende 35-40 minuten.
    OPMERKING: Na een succesvolle spijsvertering moet de oplossing er melkachtig uitzien. Als er nog kleine stukjes weefsel zichtbaar zijn, schud dan nog 10-20 seconden met de hand.

3. Isolatie van preadipocyten

  1. Om de preadipocytenfractie te pelleteren, centrifugeert u gedurende 5 minuten op 1.000 x g .
  2. Zuig de zwevende adipocytenlaag en het bovenstaande op en gooi deze weg, zodat er ongeveer 1 ml HBSS overblijft die de celpellet bedekt.
  3. Resuspendeer de pellet in 5 ml HBSS en leid de celsuspensie door een maas met een poriegrootte van 250 μm, gevolgd door een maas van 100 μm om onverteerd materiaal te verwijderen. Vang de celsuspensie op in een conische buis van 15 ml.
  4. Centrifugeer op 1.000 x g gedurende 5 min.
    OPMERKING: Na deze stap kan de preadipocytfractie worden behandeld met een lysisoplossing voor rode bloedcellen als besmetting van rode bloedcellen een probleem is.
  5. Aspiratie en gooi het bovenliggende weg.
  6. Resuspendeer de celpellet in 5 ml genetisch gemodificeerd (stap 1.2) en zaai het zaad in een aanhangende weefselkweekkolf van 25cm2 . Plaats de kolf in een celkweekincubator (5% CO2, 37 °C).

4. Behoud van preadipocytenculturen

  1. Vervang de GM elke 2 dagen terwijl de cellen zich vermenigvuldigen
    OPMERKING: Celproliferatiesnelheden kunnen variëren tussen donoren.
    1. Wanneer de cellen ongeveer 80% samenvloeien, brengt u ze over naar een aanhangende weefselkweekkolf van 75cm2 . Verwijder de GM en was de cellen met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
    2. Gooi de PBS weg en voeg 0,5 ml sterk gezuiverde celdissociatie-enzymen toe om de aangehechte cellen te dissociëren. Incubeer gedurende 5 minuten bij 37 °C.
    3. Tik scherp op de kolf om de cellen vrij te maken en voeg 5 ml GM toe. Vang de celsuspensie op in een conische buis van 15 ml.
  2. Centrifugeer op 1.000 x g gedurende 5 min.
  3. Aspiratie en gooi het bovenliggende weg. Resuspendeer de celpellet in 5 ml genetisch gemodificeerde stof en breng deze over in een kolf van 75 cm2 . Vul de GM bij tot een eindvolume van 12 ml en vervang de kolf in de celkweekincubator (5 % CO2, 37 °C).
    OPMERKING: Om de cellen te onderhouden, blijft u de GM elke 2-3 dagen veranderen. Wanneer de cellen 80% samenvloeien, herhaalt u de stappen 4.2-4.3 en verdeelt u de cellen 1:3 in nieuwe kolven van 75 cm2 . Dit kan gedurende meerdere passages worden herhaald totdat er voldoende cellen zijn gegenereerd voor de experimentele opstelling. We zouden niet meer dan 10 passages aanbevelen omdat de proliferatie en differentiatiecapaciteit van de preadipocyten afneemt.

5. Zaaien van preadipocyten voor adipogene differentiatie

  1. Tel de cellen met behulp van een hemocytometer en zaai 200.000 cellen in meerdere putjes van een plaat met 6 putjes in 2 ml genetisch gemodificeerde stof. U kunt ook 3,5 miljoen cellen per 175 cm2 kolf in 22 ml genetisch gemodificeerde media zaaien.
  2. Laat de cellen nog 2-4 dagen woekeren totdat ze volledige samenvloeiing bereiken, waarbij de GM op de tweede dag van de cultuur verandert.
  3. Om met adipogene differentiatie te beginnen, verwijdert u de GM en vervangt u deze gedurende 4 dagen door volledige DM (2 ml volledige DM per putje van een plaat met 6 putjes of 22 ml voor een kolf van 175 cm2 ).
    OPMERKING: Vervang door verse volledige DM op dag 2.
  4. Verwijder op dag 4 de volledige DM en vervang deze door 2 ml basisch DM aangevuld met 22,5 μM oleaat, 15 μM palmitaat en 12,5 μM linoleaat om een totale vetzuurconcentratie te verkrijgen van 50 μM per putje van een plaat met 6 putjes of 22 ml voor een kolf van 175 cm2 . Vervang elke 2 dagen door media voor nog eens 10 dagen.
    OPMERKING: Vanaf dag 7 moeten lipidedruppels zichtbaar zijn in de differentiërende preadipocyten.
  5. Verzamel op kweekdag 14 de media uit de cellen voor isolatie van van adipocyten afgeleide EV's.

6. Bereiding van celkweeksupernatans voor extracellulaire isolatie of opslag van blaasjes en toekomstige extracellulaire blaasjesisolatie

  1. Verwijder celkweeksupernatanten van elke plaat met 6 putjes en combineer. Voeg toe aan een buisje van 15 ml of verwijder alle celkweeksupernatanten uit een kolf van 175 cm2 en voeg toe aan een buisje van 50 ml.
  2. Centrifugeer bij 1000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
  3. Decanteer het bovenstaande in een nieuwe, schone buis van 15 ml of 50 ml door respectievelijk te gieten.
  4. Verwijder de cilinder van een spuit van 10 ml en bevestig een spuitfilter van 0,45 μm.
  5. Giet het bovenstaande in het reservoir van de spuit en oefen lichte druk uit op de opening van het spuitvat met een duim of handpalm totdat het supernatans van de celcultuur vrij door het filter stroomt.
    OPMERKING: De snelheid van deze filtratiestap kan variëren, afhankelijk van het type spuitfilter.
  6. Vang het filtraat op in een schone buis van 50 ml.
    OPMERKING: Indien nodig kunnen de geconditioneerde gefilterde media op dit punt enkele weken bij -80 °C worden bewaard. Ontdooi indien nodig de supernatanten van de celcultuur bij 4 °C en centrifugeer ze gedurende 10 minuten bij 1000 x g bij 4 °C. Decanteer het bovenstaande in een schone buis door te gieten voordat u verder gaat met de EV-isolaties.

7. Isolatie van extracellulaire blaasjes

  1. Label een ultracentrifugatiebuis van 13 ml door een cirkel op de bodem van de buis te tekenen, waar de verwachte EV-pellet zich zal vormen en markeer een lijn rond de hals van de buis ter oriëntatie in de rotor van de ultracentrifugatiebuis. Label de buis met een voorbeeldidentificatie.
  2. Plaats de buis in de buishouder.
  3. Bevestig een naald van 16 g aan een spuit van 10 ml en verwijder de cilinder van de spuit.
  4. Verwijder de beschermkap van de naald en steek de naald in de hals van de ultracentrifugatiebuis.
  5. Giet het celkweeksupernatans rechtstreeks in de spuitcilinder om de ultracentrifugatiebuis te vullen.
  6. Vul de tube indien nodig bij met PBS tot deze vol is.
    NOTITIE: Laat de buis indien nodig iets overlopen en zorg ervoor dat er geen luchtruimten in de ultracentrifugatiebuis zijn en geen luchtbellen.
  7. Sluit de ultracentrifugatiebuis af met een soldeerbout en zorg ervoor dat de buis luchtdicht is door voorzichtig in de buis te knijpen.
  8. Plaats de ultracentrifugatiebuizen in de ultracentrifugatierotor; zorg ervoor dat de lijn aan de bovenkant van de buis en de cirkel aan de onderkant van de buis naar buiten wijzen, waar de EV-pellet zich zal vormen.
  9. Ultracentrifuge bij 120.000 x g gedurende 2 uur bij 4 °C.
  10. Verwijder voorzichtig de rotor van de ultracentrifuge.
  11. Verwijder de ultracentrifugatiebuizen van de rotor en plaats ze in de buishouder.
  12. Bevestig een naald van 16 g op een spuit van 10 ml.
  13. Prik in de bovenkant van de ultracentrifugatiebuis en steek de naald 2 cm in de bovenkant van de buis en zuig het bovenstaande op in de spuit.
  14. Decanteer dit EV-verarmde supernatans in een tube van 1,5 ml en vries in bij -80 °C.
  15. Steek de naald weer in de tube en zuig voorzichtig het resterende bovenstaande op en gooi het weg.
  16. Knip de bovenkant van de buis af met een schaar.
  17. Giet het resterende bovenstaande in één snelle beweging af.
  18. Laat de tube 1 minuut ondersteboven hangen.
  19. Dep alle vloeistof die zich op de tube vormt droog met keukenpapier.
  20. Keer de buis om en plaats deze in de buishouder.
  21. Voeg 100 μL PBS toe aan de buis.
  22. Maak met de punt van een pipet de EV-pellet aan de onderkant van de buis voorzichtig los met een cirkelvormige beweging in het gebied dat is gemarkeerd in stap 7.1.
  23. Vortex kort (1-2 seconden), twee keer.
  24. Label een nieuwe ultracentrifugatiebuis van 13 ml door een cirkel op de bodem van de buis te tekenen, waar de verwachte EV-pellet zich zal vormen en markeer een lijn rond de hals van de buis ter oriëntatie in de rotor van de ultracentrifugatiebuis. Label de buis met een voorbeeldidentificatie.
  25. Plaats de buis in de buishouder.
  26. Voeg 12 ml PBS toe aan een nieuwe ultracentrifugatiebuis met behulp van een schone spuit en naald.
  27. Verzamel met behulp van een spuit en naald het 100 μL EV-monster en voeg toe aan de buis. Meng de EV's en PBS voorzichtig en spoel de spuit en naald door PBS voorzichtig op te vangen en in de slang te zuigen.
    OPMERKING: Vermijd het creëren van bubbels.
  28. Sluit de ultracentrifugatiebuis af met een soldeerbout en zorg ervoor dat de buis luchtdicht is door voorzichtig in de buis te knijpen.
  29. Plaats de ultracentrifugatiebuizen in de ultracentrifugatierotor; Zorg ervoor dat de lijn aan de bovenkant van de buis en de cirkel die aan de onderkant van de buis is getekend, naar buiten wijzen.
  30. Ultracentrifuge bij 120.000 x g gedurende 1 uur bij 4 °C.
  31. Verwijder voorzichtig de rotor van de ultracentrifuge.
  32. Bevestig een naald van 16 G aan een spuit van 12 ml.
  33. Prik in de bovenkant van de ultracentrifugatiebuis en steek de naald tot 2 cm in de bovenkant van de buis; Zuig het bovenstaande op in de spuit en gooi het weg.
  34. Knip de bovenkant van de buis af met een schaar.
  35. Giet het resterende bovenstaande in één snelle beweging af.
  36. Laat de tube 1 minuut ondersteboven hangen.
  37. Dep alle vloeistof die zich op de rand van de tube vormt droog.
  38. Plaats de buis in de buishouder.
  39. Voeg 100 μL PBS toe aan de buis.
  40. Maak met de punt van een pipet de EV-pellet aan de onderkant van de buis voorzichtig los met een cirkelvormige beweging in het gebied dat is gemarkeerd in stap 7.24.
  41. Vortex kort (1-2 seconden), twee keer.
  42. Pipetteer 100 μL PBS/EV-oplossing in een schone buis van 1,5 ml en bewaar op nat ijs.
    OPMERKING: EV zijn klaar voor stroomafwaartse verwerking en kunnen worden ingevroren en opgeslagen bij -80 °C.

8. Bepaling van de EV-grootte en -concentratie met behulp van Nanoparticle Tracking Analysis (NTA)

  1. Het systeem voorbereiden
    OPMERKING: Een gedetailleerde methode voor het gebruik van Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) voor het bepalen van de EV-grootte en -concentratie werd gerapporteerd door Mehdiani et al.13.
    1. Ontdooi de monsters en bewaar ze bij 4 °C.
    2. Start de NTA-software door op het software-icoontje te klikken.
    3. De software wordt geopend in "celcontrole" en vraagt om de stroomcel te vullen met gedeïoniseerd water. Vul een spuit van 10 ml met gedeïoniseerd water en duw deze in de machine, zodat er geen luchtbellen in de laadkamer terechtkomen.
    4. Volg de instructies op het scherm om het systeem voor te bereiden door middel van een kwaliteitscontrole (QC). De software voert een celcontrole uit en geeft een meting van de celkwaliteit. Dit moet zeer goed tot uitstekend zijn.
    5. Bereid de kwaliteitscontrole voor die bestaat uit een 100 nanometer polystyreen korrels. Pipetteer 1 μL van de standaard in 999 μL gedeïoniseerd water (verdunde bouillon). Voeg vervolgens 10 μL van de verdunde bouillon toe aan 2,5 ml gedeïoniseerd water (QC-monster). Meng de oplossing door 2-3 s zachtjes te vortexen en te pipetteren.
      OPMERKING: Kwaliteitscontrolemonsters moeten elke dag vers worden bereid, maar het eerste verdunde voorraadmonster is 1 week stabiel bij 4 °C.
    6. Vul een spuit van 1 ml met de 1 ml van het QC-monster en verwijder alle luchtbellen uit de spuit.
    7. Injecteer, zonder luchtbellen in te voeren, in de laadkamer van het NTA-monster door de punt van de spuit voorzichtig in de injectiekamer te kantelen en tegelijkertijd op de zuiger te drukken. Injecteer tot 950 μL van het QC-monster in de kamer.
      OPMERKING: Breng geen luchtbellen in de laadkamer van het monster.
    8. Wacht terwijl de software een automatische uitlijning uitvoert (om de camera scherp te stellen) en de spanning controleert op Z-potentiaalmetingen - de spanningsgrafiek moet een vloeiende U-vormige curve zijn.
      NOTITIE: Als er een foutmelding "voltage te laag fout", kan de cel nat zijn van het schoonmaken of niet vastzitten of er kan een luchtbel zijn.
    9. Zodra de automatische uitlijning/spanningscontrole is voltooid, gebruikt u de vervolgkeuzelijst voor camerapositie om alle posities (0.1-0.9) te controleren op ongebruikelijke markeringen - de aanwezigheid hiervan geeft aan dat de cel mogelijk moet worden doorgespoeld en/of gereinigd. Na QC geeft het systeem "klaar voor metingen" weer.
    10. Vul de flowcel voor met PBS. Open het tabblad Pomp/Temp en klik onder Pomp op Uitvoeren voor pomp 2 (PBS-reservoir). Hierdoor wordt PBS gedurende 1 minuut door de cel geleid en wordt dan automatisch gestopt.
      OPMERKING: Er kunnen deeltjes in de kamer zitten, maar deze kunnen worden verwijderd door 10 ml PBS door de laadpoort te duwen.
    11. Vul een spuit van 10 ml met PBS en vul deze in de kamer zonder luchtbellen.
    12. Maak een protocol voor het uitvoeren van het apparaat dat meerdere posities van de laser meet en het gemiddelde van de deeltjes per frame neemt.
    13. Controleer of het aantal deeltjes minder dan 5 is (zo dicht mogelijk bij 0
    14. Vóór de verdunning dient het EV-monster te worden gemengd door middel van pipetteren.
    15. Verdun het monster 1:1.000 in PBS en meng door te pipetteren. Vul een spuit van 1 ml met het monster en vul deze in de kamer zonder luchtbellen.
    16. Controleer of het aantal deeltjes binnen het acceptabele bereik ligt (de balk boven de telwaarde moet zich in het groene gebied of dichtbij bevinden). Als dit niet het geval is, pas dan de monsterverdunning dienovereenkomstig aan. Laad tussen de monsters en de monsterverdunningen 10 ml PBS in de voorkant van de machine om de kamer vrij te maken en laad vervolgens 1 ml van het verdunde monster.
      OPMERKING: Elk monster heeft een onafhankelijke verdunning op basis van de concentratie van het monster. Het aantal deeltjes van het apparaat moet tussen de 50-200 deeltjes per frame liggen voor nauwkeurige metingen.
    17. Ga naar het tabblad Meting in de software.
    18. Klik op de knop Video-acquisitie uitvoeren .
    19. Voer een voorbeeldnaam in en selecteer een bestemmingsmap om de meting op te slaan.
  2. Maak een EV-standaardwerkprocedure (SOP).
    1. Creëer > Sla op > Laad een EV SOP die het aantal en de grootte van de deeltjes meet met een sluitertijd van 100 en een cameragevoeligheid van 80, 11 cameraposities gedurende 2 cycli.
      OPMERKING: Tenzij het monster speciale vereisten heeft, is het niet nodig om deze instellingen te wijzigen.
    2. Voer de verdunning van het monster in en voeg eventuele andere noten toe die u wilt toevoegen.
    3. Klik op OK en de software begint automatisch met opnemen. Als u klaar bent, laadt de software automatisch een pop-uptabel met het gemiddelde aantal deeltjes en de grootte voor elke camerapositie.
      OPMERKING: Raak de machine of werkbladen in de buurt gedurende deze tijd niet aan, aangezien trillingen de eindmetingen beïnvloeden.
    4. Cameraposities met statistisch ongebruikelijke metingen worden automatisch uitgesloten - om cameraposities handmatig uit te sluiten (of om welke reden dan ook uitgesloten posities opnieuw op te nemen), klikt u op het selectievakje links van de voorbeelddetails.
    5. Klik op Doorgaan en de software maakt en opent een PDF van het monster met de grootte en concentratieresultaten.
  3. Statistische analyse
    1. Analyseer de NTA-gegevens door middel van eenrichtings- of tweerichtings-ANOVA met post-hoc Tukey-correctie. Gegevens uitzetten als groep betekent ± standaarddeviatie. Een P-waarde van <0,05 werd als significant beschouwd.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We bepaalden de hoeveelheid EV's geïsoleerd uit menselijke gluteale adipocyten volgens het beschreven protocol. We hebben de grootte en concentratie van van adipocyten afgeleide EV's berekend met behulp van NTA (Figuur 1A,B). We gebruikten schijnmediacontroles, dit waren gelijke hoeveelheden media die niet in contact waren geweest met cellen, maar waren gekweekt en onderworpen aan de hierboven beschreven isolatieprocedure. We maten de van adipocyten afgeleide EV-concentratie na de eerste isolatie en na het wassen van de geïsoleerde adipocyt-EV's in PBS (Figuur 1A,B) en zetten de groepsgemiddelden uit ± standaarddeviatie (SD), die werd geanalyseerd door een tweerichtings-ANOVA met post-hoc Tukey-correctie.

De concentratie van adipocyt-afgeleide EV's bepaald door NTA uit de 1eisolatie varieerde van 6,10 x 106 tot 2,70 x 107 met een mediaan van 2,60 x 107 EV's/ml (Figuur 1 A,B). Na een PBS-wasbeurt waren er significant minder van adipocyten afgeleide EV's per monster (Figuur 1A,B) (P < 0,001), die varieerden van 5,00 x 105 tot 4,30 x 106 met een mediaan van 2,70 x 106 EV's/ml. De schijnmedia-controles bevatten geen EV's zoals bepaald door NTA (Figuur 1A,B). De modale grootte van EV's vanaf de eerste isolatie was 125 nm en 105 nm na een PBS-wasbeurt (Figuur 1A,B). Het beschreven protocol werd verder toegepast op buik- en bilcellen uit grotere T175 cm2-kolven. Deze gluteale EV-monsters, afgeleid van T175 cm2-kolven, varieerden in concentratie van 3,60 x 107 tot 7,50 x 107/ml met een mediaan van 5,40 x 107 EV's/ml. Abdominale adipocyt-afgeleide EV's uit T175 cm2-kolven varieerden in concentratie van 6,30 x 107 tot 8,60 x 107/ml met een mediaan van 7,60 x 107 EV's/ml (Figuur 1C,D). De modale grootte van EV's afgeleid van de T175 cm2-kolven was 115 nm voor gluteale EV's en 125 nm abdominale EV's. We bevestigden de aanwezigheid van EV-eiwit in gluteale en abdominale afgeleide EV's door immunoblotting voor tumorgevoeligheidsgen 101 (TSG101) en ontdekten dat abdominale en gluteale adipocytcelpellets en abdominale en gluteale adipocyt-afgeleide EV's positief waren voor TSG101, terwijl als sham-control media, die niet in contact waren geweest met cellen, negatief waren (Figuur 1E).

figure-results-1
Figuur 1: Grootte en distributieprofiel van van adipocyten afgeleide EV's uit celkweekmedia en bepaling van EV-eiwit TSG101. Totale EV-concentraties en grootte- en concentratieverdelingsprofielen zoals bepaald door Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) vanaf de 1eisolatie ( N = 5) en na wassen met PBS (N = 6). (C) Totale concentraties en (D) grootte- en concentratieverdelingsprofielen bepaald door NTA voor abdominale en gluteale afgeleide EV's uit T175cm2-kolven (N = 4 per groep). (E) Western blot van gluteale en abdominale afgeleide EV's voor TSG101. Celpellets en schijnmedia werden gebruikt als respectievelijk positieve en negatieve controles. Gegevens zijn groepsgemiddelden ± standaarddeviatie (SD). Een eenrichtings- of tweerichtings-ANOVA met post-hoc Tukey-correctie. P < 0,001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We demonstreren een protocol voor de isolatie van gluteale en abdominale adipocyt-afgeleide EV's uit celkweeksupernatanten en bepalen hun grootte en concentratie aan de hand van NTA 7,14,15. We tonen aan dat gekweekte menselijke vetcellen EV's produceren en afgeven aan de celkweekmedia, die vervolgens kunnen worden geïsoleerd met behulp van filtratie en ultracentrifugatie. We bepaalden de grootte en het concentratieprofiel van geïsoleerde adipocyt-afgeleide EV's en tonen aan dat ultracentrifugatie waarschijnlijk contaminanten uit de celkweekmedia heeft geïsoleerd en dat het wassen van de geïsoleerde EV-pellets in PBS hun concentratie significant verlaagt in een tweede NTA-meting. We bepaalden verder de zuiverheid van de geïsoleerde gluteale en abdominale afgeleide EV's door western blotting voor TSG101, een EV-marker. Gluteale en abdominale afgeleide EV-preparaten waren positief voor TSG101, maar, belangrijker nog, dit was afwezig in controlemedia die niet werden blootgesteld aan cellen. De gepresenteerde experimenten gebruikten menselijke vetcellen als de oudercel die EV's genereerde, maar de beschreven methode is geschikt voor andere celtypen, waaronder endotheelcellen, vasculaire gladde spieren, skeletspieren, immuuncellen en voor de isolatie van EV's uit bloedplaatjesarm plasma of serum van de patiënt.

Van adipocyten afgeleide EV's zijn verhoogd bij stofwisselingsziekten en het bepalen van veranderingen in de grootte en het aantal adipocyt-EV's in vivo is complex omdat biologische vloeistoffen zoals bloed EV's bevatten uit een aantal celbronnen die ook betrokken zijn bij de pathogenese van stofwisselingsziekten, waaronder EV's van endotheelcellen, skeletspieren, erytrocyten en immuuncellen. De hier beschreven methode maakt het mogelijk om EV's van menselijke adipocyten te bepalen, wat een nuttig model kan bieden voor mechanistische studies naar de factoren die leiden tot EV-biogenese in adipocyten, die momenteel onbekend is. Belangrijk is dat het bepalen van de biogenese van adipocyten EV en hoe het laden van bepaalde RNA's, eiwitten en metabolieten wordt georkestreerd in adipocyt EV's, nieuwe therapeutische mogelijkheden kan onthullen om pathogene adipocyten EV-signalering bij metabole disfunctie te verstoren. Gedetailleerde studies zullen een beter begrip geven van hoe EV-grootte, aantal, biogeneseroute en EV-lading (RNA, eiwitten en metabolieten) worden veranderd als reactie op ziekte of stimuli zoals verstoringen in zuurstof, glucose, lipiden en insuline. Informatie over de rol van omgevingsfactoren op de signalering van adipocyten EV bij stofwisselingsziekten en hoe van adipocyten afgeleide EV's bijdragen aan ontsteking van vetweefsel, kan nieuwe therapeutische doelen bij stofwisselingsziekten aan het licht brengen.

Beperkingen
In vitro generatie van adipocyten afgeleide EV's
Het gebruik van humane preadipocyten in vitro biedt een modelsysteem om de afgifte en generatie van adipocyten-afgeleide EV's te bestuderen na in vitro adipocytendifferentiatie, maar er zijn een aantal beperkingen. In het bijzonder verschillen in vitro afgeleide adipocyt-EV's waarschijnlijk van van vet afgeleide EV's die worden gewonnen uit biovloeistoffen, zoals plasma14 in hun grootte, concentratie, EV-eiwit, -RNA, -metabolieten en functie. Deze EV-verschillen kunnen worden beïnvloed door andere niet-adipocytcellen die in vivo in vetweefsel aanwezig zijn, zoals van vetweefsel afgeleide stamcellen, endotheelcellen en macrofagen, die nauw verbonden zijn met de fysiologie van vetweefsel en een rol hebben gespeeld in de pathologie van vetweefsel, waaronder vetweefselontsteking.

Opgemerkt moet worden dat het hier beschreven in-vitrodifferentiatieprotocol van 2 weken mogelijk niet voldoende is om volledig rijpe vetcellen te genereren die gelijkwaardig zijn aan die in vivo; in vitro gedifferentieerde vetcellen die in een tweedimensionaal (2D) formaat worden gekweekt, vertonen een andere morfologie dan in vivo cellen en ontwikkelen geen uniloculaire lipidedruppeltjes. Bovendien worden de preadipocyten die in dit protocol worden beschreven, verkregen uit de stromalevasculaire fractie van vet en hebben we de bijdrage aan de EV-pool van andere celtypen die niet volledig werden geëlimineerd tijdens de celisolatie niet beoordeeld.

Het verlies van belangrijke cel-tot-cel interacties van vetcellen met andere niet-vetcellen in vetweefsel kan van invloed zijn op de aanmaak en afgifte van vetcyten door EV, EV-eiwit en EV-RNA uit vetcellen en van vetweefsel afgeleide stamcellen16. Een beoordeling van hoe in vitro afgeleide adipocyt-EV's verschillen van in vivo geproduceerde EV's is echter niet uitputtend uitgevoerd.

Primaire weefselbiopten bevatten bloed en daarom kunnen de afgeleide celculturen erytrocyten en van erytrocyten afgeleide EV's bevatten, ongeacht de meerdere wasbeurten en mediaveranderingen die in ons protocol worden benadrukt. Een extra lysisstap van rode bloedcellen na isolatie van de stromale-vasculaire fractie kan nodig zijn om de effecten van erytrocyten op vetcellen te elimineren. Dit is belangrijk omdat van erytrocyten afgeleide EV's de cellulaire functie van andere cellen kunnen beïnvloeden17 en van erytrocyten afgeleide EV's verhoogd zijn in aanwezigheid van oxidatieve stress18 en bij patiënten met metabool syndroom19,20. Daarom kan vetweefsel afkomstig van patiënten met stofwisselingsziekten verhoogde niveaus van van erytrocyten afgeleide EV's bevatten, wat het in vitro fenotype van adipocyten kan beïnvloeden.

Eliminatie van FBS
Het beschreven protocol maakte gebruik van FBS in de groeimedia tijdens adipogene differentiatie, maar vervolgens werden de vetcellen onderworpen aan meerdere mediaveranderingen vóór de definitieve mediaverzameling voor de isolatie van van adipocyten afgeleide EV's. Daarom gingen we ervan uit dat het algehele risico op besmetting van FBS-afgeleide EV's in de EV-preparaten laag was en bevestigden we vervolgens dat er geen resterende EV's aanwezig waren in de celkweekmedia door westerse blotting voor TSG101. De isolatie van celgekweekte EV's uit celbronnen die FBS vereisen, moet EV-verarmde FBS gebruiken of runder-EV's uitputten door middel van ultracentrifugatie om te voorkomen dat runder-EV's de adipocyt-EV-concentraties verstoren en analyse van adipocyt-EV-lading. Het is bekend dat depletie van serum uit adipocyten hun cellulaire respons verandert21 en daarom moet onderzoek ervoor zorgen dat serumdepletie of EV-depletie uit serum hun adipocytenculturen echt representatief maakt voor de biologie van adipocyten.

Technische beperking van EV-isolatie met behulp van filtratie en ultracentrifugatie
We beschrijven een methode van ultracentrifugatie met plastic buizen voor eenmalig gebruik die voorafgaand aan ultracentrifugatie moeten worden afgedicht voor EV-isolaties. We erkennen dat deze verzegelde buizen voor eenmalig gebruik voor veel mensen misschien geen economische optie zijn en stellen voor om soortgelijke buizen te onderzoeken, die geen afdichting vereisen en herbruikbaar zijn. Onderzoekers moeten er echter voor zorgen dat het wassen van herbruikbare tubes adequaat is en niet leidt tot progressieve accumulatie van eiwit-, lipide- en RNA-verontreinigingen in de loop van de tijd, wat van invloed kan zijn op stroomafwaartse onderzoeken van EV-geassocieerde lading of op cellulaire functiestudies.

Het hier beschreven filtratie- en ultracentrifugatieprotocol wordt al vele jaren gebruikt en meerdere onderzoeken hebben de tekortkomingen van deze methode benadrukt, waaronder de niet-specifieke isolaties van verontreinigende cellulaire componenten zoals cellulaire mitochondriën, de aanwezigheid van nucleaire fragmenten en bestanddelen van het celmembraan. Bovendien zal de hier beschreven methode lipoproteïnen co-isoleren die aanwezig zijn in EV-verarmd FBS. De methode hier kan verder worden ontwikkeld door het gebruik van dichtheidsultracentrifugatie en grootte-uitsluitingschromatografie (SEC) om verontreinigende oplosbare eiwitten en sommige lipoproteïnen te elimineren. In combinatie met PBS-wassing van de geïsoleerde EV's en SEC kunnen de co-geïsoleerde verontreinigingen worden beperkt, maar niet volledig worden geëlimineerd. Daarom moeten gebruikers ervoor zorgen dat passende controles worden opgenomen, waaronder een schijnmedium dat niet in contact is geweest met cellen om rekening te houden met oplosbare eiwitten en lipoproteïnen in de kweekmedia en een EV-verarmde supernatanscontrole om de succesvolle isolatie van EV's aan te tonen van geconditioneerde media die nog steeds oplosbare eiwitten en lipoproteïnen bevatten.

De isolatie van EV's met behulp van filtratie en ultracentrifugatie berust op de operator die ervoor zorgt dat er geen onnodige druk wordt uitgeoefend op de celkweeksupernatanten terwijl deze door de boring van het filter of de boring van de naald/spuit wordt geleid. Toepassing van ongepaste kracht tijdens deze fase van het beschreven protocol kan EV's scheuren, de uiteindelijke EV-concentraties beïnvloeden en vrij RNA, eiwitten en metabolieten genereren, die ooit in EV's waren ingekapseld. We hebben hier een methode beschreven, waarvoor geen spuitcilinder nodig is en dus geen kracht hoeft te worden uitgeoefend op de EV's in geconditioneerde media wanneer ze door het filter of de naald in hun opvangreservoirs en ultracentrifugatiebuizen gaan. Desalniettemin moet verdere voorzichtigheid worden betracht bij het resuspenderen van de EV-pellet in PBS. Er mag slechts een korte vortex worden gebruikt, omdat krachtige vortex de EV-membranen kan verstoren.

Na ultracentrifugatie moeten operators voorzichtig zijn met de ultracentrifugatiebuizen om de EV-pellet niet te verstoren. Dit kan worden bereikt door de buizen voorzichtig te hanteren en ze langzaam te verplaatsen tussen de ultracentrifugatierotor en het buizenrek. Verdere voorzichtigheid is geboden bij het doorboren van een gat in de bovenkant van de ultracentrifugatiebuis om de EV-verarmde supernatanten op te zuigen. Door de naald in de bovenkant van de buis te steken en de supernatanten snel op te zuigen, ontstaat er een vacuüm in de spuitcilinder, waardoor het bovenstaande met geweld terug in de ultracentrifugatiebuis kan worden gedwongen en de EV-pellet kan worden verstoord. Na het afsnijden van de ultracentrifugatiebuis om het resterende supernatant af te gieten, moet voorzichtig worden omgegaan, omdat de EV-pellet los kan raken en door het gieten de EV-pellet wordt weggegooid. Als alternatief kunnen een spuit en naald worden gebruikt om het resterende bovenstaande middel langzaam te verwijderen zonder de buis te gieten of om te keren.

Filtratie en ultracentrifugatie van supernatanten voor de isolatie van EV's is een nuttige en efficiënte methode. Maar het is vatbaar voor de co-isolatie van lipoproteïnen en oplosbare eiwitten. Deze kunnen worden verzacht door de EV's te wassen met PBS (zoals beschreven), maar dit zal niet alle verontreinigingen elimineren. Oplosbare eiwitten kunnen uit de EV-fractie worden geëlueerd door gebruik te maken van SEC, maar deze methode maakt geen onderscheid tussen lipoproteïnen en EV's. SEC-eluties die EV's bevatten, kunnen worden gecombineerd met ultracentrifugatie om EV's te pelleteren. Filtratie en differentiële ultracentrifugatie is een voorkeursmethode voor EV-isolatie boven precipitatietechnieken, waarbij polyethyleenglycol wordt gebruikt, omdat deze precipitatiemethoden grote hoeveelheden oplosbare eiwitten en lipoproteïnen co-isoleren in celkweeksupernatanten en andere biologische vloeistoffen. Ultracentrifugatie zal voor velen waarschijnlijk de meest toegankelijke vorm van EV-isolatie blijven, omdat de meeste laboratoria zijn uitgerust met een ultracentrifuge, waardoor de initiële opstartkosten worden beperkt. Maar voor velen wordt ultracentrifugatie voor EV-isolatie gehinderd door het volume van ultracentrifugatiebuizen en het startvolume van het materiaal. Er kunnen enkele honderden milliliters kweeksupernatanten nodig zijn om voldoende EV-hoeveelheden te produceren voor stroomafwaartse proteomics of RNA-sequencing. Het is echter waarschijnlijk dat ultra-centrifugatietechnieken voor EV-isolatie gepaard zullen gaan met andere technieken zoals SEC en immunoaffiniteitsopname met behulp van tetraspanines CD9, CD63 en CD81 om de zuiverheid van geïsoleerde EV's te verbeteren. Andere technieken, zoals in de handel verkrijgbare precipitatieoplossingen en flowcytometrie, kunnen van enig nut zijn in specifieke onderzoeken.

Zuiverheid van EV-preparaten
We bevestigden de isolatie van van adipocyten afgeleide EV's door westerse blotting voor TSG101, maar deze enkele westerse vlek voldoet niet aan de richtlijnen die zijn gepubliceerd door de internationale vereniging voor extracellulaire blaasjes (ISEV). Verdere karakterisering van deze van adipocyten afgeleide EV's zou ideaal zijn met behulp van tetraspaninen CD9, CD63 en CD81 om exosomen en markers van cellulaire besmetting zoals histon H3, albumine en apolipoproteïne A1 te identificeren.

Het hier gepresenteerde protocol maakt het mogelijk om EV's te isoleren uit celkweeksupernatanten uit een reeks celbronnen, waaronder adipocyten, voor het bepalen van de EV-grootte, concentratie, EV-markers door western blot en bruikbaarheid in op omics gebaseerde technologieën zoals proteomics en RNA-sequencing.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

N.A. en R.C. erkennen de steun door onderzoeksbeurzen van de British Heart Foundation, het Centre of Research Excellence, Oxford (N.A. en R.C.; RE/13/1/30181 en RE/18/3/34214), British Heart Foundation Project Grant (N.A. en R.C.; PG/18/53/33895), het Tripartite Immunometabolism Consortium, Novo Nordisk Foundation (NNF15CC0018486), het National Institute for Health Research (NIHR), Oxford Biomedical Research Centre (BRC), Nuffield Benefaction for Medicine en het Wellcome Institutional Strategic Support Fund (ISSF). De geuite meningen zijn die van de auteur(s) en niet noodzakelijkerwijs die van de NHS, de NIHR of het ministerie van Volksgezondheid.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
100 µm meshSefar03-250/50
15 mL Conical TubeSarstedt62.554.002
250 µm meshSefar03-100/44 
50 mL Conical TubeSarstedt62.547.004
Beckman Coulter, Optima MAX-XP UltracentrifugeBeckman Coulter393315
Bicinchoninic acid assay (BCA)Thermo Scientific23225
BiotinSigmaB4639
BSA (essentially fatty acid free)SigmaA7030
Collagenase HSigma11074032001
DexamethasoneSigmaD2915
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Ham's nutrient mixture F12 SigmaD6421
Fetal bovine serumLabtechFCS-SA
Fibroblast growth factorBio-Techne233-FB-025
GlutamineThermoFisher25030024
Hanks balanced salt solution SigmaH9394
Human insulinThermoFisher12585-014
Hypodermic needles, Microlance 16GVWR613-3897
IBMXSigmaI7018
Nanoparticle Tracking Analysis, ZetaviewParticle Metrix BASIC PMX-120 
NEFA kitRandoxFA115
PantothenateSigmaP5710
Penicillin and StreptomycinThermoFisher15140122
Phosphate buffered salineThermoFisher Scientific10010056
PluriStrainer 200 µmCambridge Bioscience43-50200-03
Polyallomer Quick-Seal ultra-clear 16 mm × 76 mm tubesBeckman Coulter342413
Single use syringes, 2-piece, Injekt SoloVWR20-2520
Sodium linoleateSigmaL8134
Sodium oleateSigmaO7501
Sodium palmitateSigmaP9767
Soldering IronZacro7.14954E+11
Syringe Filter 0.2 µm Sarstedt83.1826.001
Syringe Filter 0.45 µm ThermoFisher195-2545
T175 cm2 tissue culture flasksSarstedt83.3912.002
T25 cm2 tissue culture flasksSarstedt83.3910.002
T75 cm2 tissue culture flasksSarstedt83.3911.002
Transferrin SigmaT8158
Triiodo-L-thyronineSigmaT5516
TroglitazoneSigmaT2573
TrypLE Express EnzymeFisher Scientific 12604021

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  2. Akbar, N., et al. Endothelium-derived extracellular vesicles promote splenic monocyte mobilization in myocardial infarction. JCI Insight. 2 (17), (2017).
  3. Xiao, Y., et al. Extracellular vesicles in type 2 diabetes mellitus: key roles in pathogenesis, complications, and therapy. Journal of Extracellular Vesicles. 8, 1625677(2019).
  4. Akbar, N., Azzimato, V., Choudhury, R. P., Aouadi, M. Extracellular vesicles in metabolic disease. Diabetologia. 62 (12), 2179-2187 (2019).
  5. Kobayashi, Y., et al. Circulating extracellular vesicles are associated with lipid and insulin metabolism. The American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 315 (4), 574-582 (2018).
  6. Eguchi, A., et al. Circulating adipocyte-derived extracellular vesicles are novel markers of metabolic stress. Journal of Molecular Medicine. 94 (11), Berlin, Germany. 1241-1253 (2016).
  7. Crewe, C., et al. An Endothelial-to-adipocyte extracellular vesicle axis governed by metabolic state. Cell. 175 (3), 695-708 (2018).
  8. Flaherty, S. E., et al. A lipase-independent pathway of lipid release and immune modulation by adipocytes. Science. 363 (6430), 989-993 (2019).
  9. Deng, Z. B., et al. Adipose tissue exosome-like vesicles mediate activation of macrophage-induced insulin resistance. Diabetes. 58 (11), 2498-2505 (2009).
  10. Kranendonk, M. E., et al. Human adipocyte extracellular vesicles in reciprocal signaling between adipocytes and macrophages. Obesity. 22 (5), Silver Spring. 1296-1308 (2014).
  11. Song, M., et al. Adipocyte-derived exosomes carrying sonic hedgehog mediate M1 macrophage polarization-induced insulin resistance via Ptch and PI3K pathways. Cellular Physiology and Biochemistry. 48 (4), 1416-1432 (2018).
  12. Ramirez, M. I., et al. Technical challenges of working with extracellular vesicles. Nanoscale. 10 (3), 881-906 (2018).
  13. Mehdiani, A., et al. An innovative method for exosome quantification and size measurement. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (95), e50974(2015).
  14. Connolly, K. D., et al. Evidence for adipocyte-derived extracellular vesicles in the human circulation. Endocrinology. 159 (9), 3259-3267 (2018).
  15. Camino, T., et al. Vesicles shed by pathological murine adipocytes spread pathology: characterization and functional role of insulin resistant/hypertrophied adiposomes. International Journal of Molecular Sciences. 21 (6), 2252(2020).
  16. Zhu, Y., et al. Extracellular vesicles derived from human adipose-derived stem cells promote the exogenous angiogenesis of fat grafts via the let-7/AGO1/VEGF signalling pathway. Scientific Reports. 10 (1), 5313(2020).
  17. Sadallah, S., Eken, C., Schifferli, J. A. Erythrocyte-derived ectosomes have immunosuppressive properties. Journal of Leukocyte Biology. 84 (5), 1316-1325 (2008).
  18. Sudnitsyna, J., et al. Microvesicle formation induced by oxidative stress in human erythrocytes. Antioxidants. 9 (10), Basel. (2020).
  19. Helal, O., et al. Increased levels of microparticles originating from endothelial cells, platelets and erythrocytes in subjects with metabolic syndrome: relationship with oxidative stress. Nutrition, Metabolism and Cardiovascular Diseases. 21 (9), 665-671 (2011).
  20. Agouni, A., et al. Endothelial dysfunction caused by circulating microparticles from patients with metabolic syndrome. The American Journal of Pathology. 173 (4), 1210-1219 (2008).
  21. Park, J., Park, J., Nahm, S. -S., Choi, I., Kim, J. Identification of anti-adipogenic proteins in adult bovine serum suppressing 3T3-L1 preadipocyte differentiation. BMB Reports. 46 (12), 582-587 (2013).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Adipocyte EVsExtracellular VesiclesFiltration UltracentrifugationNanoparticle Tracking AnalysisTSG101 ProteinTransmission Electron MicroscopyProteomics MetabolomicsSmall RNA SequencingFunctional StudiesCell Culture Media
Video binnenkort beschikbaar

Gerelateerde artikelen