Vereenvoudiging van transcutane intratracheale toediening van geneesmiddelen bij het te vroeg geboren pasgeboren konijn

Samenvatting

Transcutane intratracheale injectie zorgt voor een effectieve intrapulmonale toediening van geneesmiddelen tijdens spontane ademhaling. Enkelvoudige en meervoudige injecties worden goed verdragen en hebben geen effect op de overleving. De techniek is eenvoudig uit te voeren en kan het effect van stoffen op de longontwikkeling en de preventie van longletsel bij pasgeboren konijnen onderzoeken.

Samenvatting

Intratracheale (IT) medicijnafgifte maakt de directe toediening van farmaceutische stoffen aan de longen mogelijk, waardoor het potentiële pulmonale voordeel wordt gemaximaliseerd en de systemische blootstelling aan geneesmiddelen wordt geminimaliseerd. De transcutane techniek is eenvoudig en maakt de IT-afgifte van stoffen aan de long van te vroeg geboren konijnen kort na de geboorte mogelijk. Pasgeboren pups worden verdoofd met ingeademd isofluraan voordat ze in rugligging worden geplaatst met de nek gestrekt. Het strottenhoofd wordt geïdentificeerd en gestabiliseerd voordat een 26-gauge (G) katheter transcutaan in de luchtpijp wordt geplaatst. Na katheterisatie van de luchtpijp wordt een stompe naald van 30 G, bevestigd aan een Hamilton-spuit, in de IT-katheter ingebracht en gebruikt om een nauwkeurig volume in de luchtpijp af te geven tijdens spontane ademhaling. Nadat de IT-injectie is voltooid, worden de naald en katheter teruggetrokken en kan de pup herstellen van de anesthesie. Transcutane IT-injectie levert een groot deel van de geïnjecteerde stof af aan de longen, waarbij het grootste deel 3 uur na de ingreep in de long blijft. De injecties worden goed verdragen vanaf de dag van de geboorte en kunnen meerdere opeenvolgende dagen worden herhaald zonder de overleving te beïnvloeden. Deze techniek kan worden gebruikt om het effect van farmaceutische middelen op de longontwikkeling te onderzoeken en bij de preventie van neonatale longbeschadiging bij te vroeg geboren konijnen.

Inleiding

Chronische neonatale longziekte (CNLD) na vroeggeboorte komt nog steeds voor bij een aanzienlijk aantal zuigelingen¹. Verbeterde moderne neonatale zorg heeft de overleving aanzienlijk verhoogd en de meeste significante complicaties na vroeggeboorte verminderd. Hoewel neurologische, gastro-intestinale en oogheelkundige complicaties zijn afgenomen, blijven respiratoire complicaties de afgelopen 2 decennia grotendeels onveranderd, waarbij bijna een op de twee baby's geboren vóór de zwangerschap van 28 weken longziekte ontwikkelt.

Vroeggeboorte, ontsteking, oxidatieve schade en letsel door beademing spelen allemaal een rol in de pathofysiologie van CNLD en slechte ademhalingsresultaten na vroeggeboorte ^2,3,4. Ondanks de aanzienlijke vooruitgang van de moderne neonatale zorg, is er beperkte effectieve therapie beschikbaar om de ontwikkeling van CNLD ^5,6 te behandelen of te voorkomen.

Er zijn nieuwe benaderingen en interventies nodig om therapie te ontwikkelen om CNLD te voorkomen en te behandelen. Intrapulmonale medicijnafgifte is een aantrekkelijke interventie om medicijnen aan de longen toe te dienen en kan het verloop van luchtwegaandoeningen bij pasgeborenen veranderen. Intrapulmonale medicamenteuze therapie heeft het voordeel van directe toediening van actieve stoffen aan de longen, waardoor de accumulatie van het geneesmiddel in organen buiten het doelwit wordt geminimaliseerd ^7,8, waardoor systemische bijwerkingen mogelijk worden beperkt. Ondanks meer dan 2 decennia van intrapulmonale vervanging van surfacturatie, zijn er geen aanvullende intrapulmonale geneesmiddelen gevalideerd om de neonatale respiratoire resultaten te verbeteren. Onlangs is beschreven dat combinatietherapie budesonide-oppervlakteactieve stoffen de longresultaten na vroeggeboorte bij mechanisch beademde zuigelingen verbetert ^9,10. Er is echter nog veel onbekend over de functionele en structurele effecten van IT-medicamenteuze therapie, er zijn weinig nieuwe therapieën geïdentificeerd en de waarde van intratracheale toediening van geneesmiddelen in de neonatale periode blijft onzeker. Diermodellen zijn nodig om potentiële geneesmiddelen te identificeren en de ontwikkeling van de broodnodige therapie voor CNLD te ondersteunen.

Dierstudies die longziekte bij pasgeborenen onderzoeken, worden meestal uitgevoerd in kleine diermodellen zoals ratten en muizen 11,12,13. Het konijn heeft als bijkomend voordeel dat vroeggeboorte de structuur en functie van de onvolgroeide menselijke long beter nabootst¹⁴. Een beperking van het te vroeg geboren konijn is de moeilijkheid om toegang te krijgen tot de luchtwegen om intrapulmonale interventies mogelijk te maken. Hoewel volwassen konijnen- en knaagdiermodellen transorale endotracheale intubatie mogelijk maken, zijn deze technieken moeilijk bij pasgeboren pups vanwege hun kleine formaat en de unieke anatomie van de bovenste luchtwegen^15,16. Er zijn alternatieve benaderingen nodig om toegang tot de luchtpijp mogelijk te maken voor de toediening van geneesmiddelen bij pasgeboren konijnenpups.

In dit manuscript beschrijven we het gebruik van een tracheostomie met transcutane naald om tracheale intubatie en medicijnafgifte mogelijk te maken.

Protocol

Voor alle experimenten met IT-injectie werd toestemming gevraagd aan de Ethische Commissie Dieren van de KU Leuven en werden alle richtlijnen inzake dierenwelzijn en verzorging van de KU Leuven nageleefd.

1. Voorbereiding

1. Verzamel alle benodigde materialen om de IT-injectie te voltooien (tabel 1).
2. Zorg ervoor dat de uitlaat van de anesthesiekamer open is en is aangesloten op een aaseter om te voorkomen dat de onderzoeker wordt blootgesteld aan isofluraan.

2. Levering van pups

OPMERKING: Konijnenpups (Nieuw-Zeelandse wit-Vlaamse reuzenhybride) werden via hysterotomie afgeleverd op dag 28 dracht (termijn 31 dagen) tijdens de sacculaire fase van longontwikkeling zoals eerder beschreven door onze groep¹⁷. Pups kunnen in normoxie worden geplaatst om de longontwikkeling na vroeggeboorte te bestuderen, of hyperoxie om acuut longletsel te bestuderen.

1. Kalmeerde dam met een intramusculaire injectie van 1 ml ketamine (100 mg/ml) en 1 ml xylazine (2%) toegediend aan de quadriceps met een spuit van 2 ml en een naald van 26 g. Eenmaal diep verdoofd, plaatst u de dam in rugligging op de operatietafel. Adequate anesthesie wordt bevestigd door diepe langzame ademhaling, verminderde kaaktonus en het gebrek aan reactie op een knijp in het oor.
2. Scheer de centrale buik met een elektrisch scheerapparaat en steriliseer het operatieveld met een oplossing op basis van jodium.
3. Euthanaseer de dam met een intraveneuze bolus van 1 ml T61 toegediend in de laterale ader van het oor.
4. Voer onmiddellijk een middellijn abdominale incisie uit door de huid, spierschede en buikspieren in de buikholte.
5. Verleng de incisie om de tweehoornige baarmoeder bloot te leggen.
6. Maak onmiddellijk een incisie in de baarmoeder met een schaar en lever elk van de pups af via de hysterotomie. Een snelle bevalling van de pups is essentieel om te overleven.
7. Droog bij de bevalling elke pup af met een papieren handdoek, dit droogt en stimuleert de pup.
8. Plaats de gedroogde pup in de verwarmde (36 °C), bevochtigde (50% relatieve luchtvochtigheid) couveuse.
9. Reken 1 uur op het herstel en de overgang naar de extra-uteriene omgeving. Alle overlevende pups worden gerandomiseerd naar de vooraf bepaalde behandelingsgroepen.

3. Anesthesie

1. Vul de inductiekamer met isofluraan (2,5%, 2,5 minimale alveolaire concentratie (MAC), 2 l/min)
2. Plaats de pups in de inductiekamer totdat een adequaat niveau van anesthesie is bereikt (verminderde spontane beweging, verminderde voetreflex voor pijnlijke prikkels, verminderde ademhalingsfrequentie).
   OPMERKING: De ogen van de konijnenpup zijn niet open op dag 28 van de zwangerschapsduur (zoals in dit experiment) en daarom is er geen topische oogzalf nodig om uitdroging van het hoornvlies te voorkomen. Als IT-injecties op latere leeftijd worden uitgevoerd, moet topische zalf op de open ogen worden aangebracht.

4. Positionering voor intratracheale injectie

1. Plaats de pup op de montagefase, liggend met gestrekte nek en neus ingebracht in de neuskegel om voortdurende anesthesie te bieden.
2. Houd de poten van de pup vast met niet-rekbaar plakband om de poten aan de montagefase vast te plakken.
3. Identificeer de tracheale en larynxkraakbeenringen, die zichtbaar zijn als donkere onderhuidse middellijnstructuur in de bovenste luchtpijp boven de thoracale inlaat.
4. Steriliseer de huid over de luchtpijp met een alcoholoplossing (80% ethanoloplossing)
5. Pak het strottenhoofd vast en stabiliseer het strottenhoofd met een Allis-tang met de niet-dominante hand van de operator.

5. Uitvoeren van de intratracheale injectie ( Figuur 1)

1. Bereid je voor op het cannuleren van de luchtpijp met de 26 G intraveneuze canule (het beste gedaan met de dominante hand) terwijl je de luchtpijp stabiliseert met de Allis-tang.
   OPMERKING: Om de steriliteit van de procedure te garanderen, gebruikt u voor elke pup een nieuwe steriele canule.
2. Penetreer de huid met de canule in een hoek van 45° ten opzichte van de huid ter hoogte van het schildklierkraakbeen.
3. Beweeg de canule en stilet langzaam vooruit totdat de luchtpijp is gecanuleerd, een subtiel "geven" wordt gevoeld als de naald de luchtpijp binnendringt en het luchtweglumen binnengaat.
4. Zodra de canule met de stilet zich in het lumen van de luchtpijp bevindt, stopt u met het naar voren schuiven van de stilet en beweegt u de plastic canule over de stilet in de luchtpijp terwijl u de stilet stilstaat Schuif de plastic canule niet >10 mm of het selectief intuberen van de linker- of rechterhoofdbronchus loopt gevaar.
5. Trek de stilet uit de canule en laat de plastic canulehuls in de luchtpijp achter.
6. Bevestig de IT-positie van de canule door een kleine hoeveelheid normale zoutoplossing (0,9% NaCl, 5 μL) in de canule te injecteren met behulp van een Hamilton-spuit en een stompe naald van 30 G. Zodra de zoutoplossing in de canule is geïnjecteerd, verwijdert u de Hamilton-spuit en -naald. Let op het luchtvloeistofniveau in de plastic canule; Beweging van het lucht-waterniveau in de canule bij spontane ademhaling bevestigt de plaatsing van de canule in de luchtwegen.
7. Zuig de benodigde hoeveelheid stof op in de Hamilton-spuit met behulp van de naald met stompe punt van 30 G.
8. Breng de 30 G naald met stompe punt (bevestigd aan de Hamilton-spuit) in de plastic canule (in de luchtpijp) en injecteer de stof langzaam in de luchtpijp gedurende 5-10 s.
9. Verwijder de naald van de Hamilton-spuit uit de plastic canule en de plastic canule uit de luchtpijp.

6. Herstel van de procedure

1. Bevrijd de pup van de opstapfase en stimuleer de ademhaling met tactiele stimulatie van de pup.
2. Zet de pup terug in een aparte kooi van de onverdoofde pups in de verwarmde (36 °C), bevochtigde (50% relatieve vochtigheid) couveuse; Plaats in een positie van 30° met het hoofd omhoog totdat u voldoende hersteld bent van de anesthesie en in staat bent om de sternale lighouding te behouden. Laat de pups niet zonder toezicht achter totdat ze hersteld zijn van de verdoving.

Resultaten

Representatieve resultaten van de techniek van enkelvoudige en herhaalde dagelijkse transcutane IT-injecties zijn gepubliceerd en tonen aan dat de overleving niet werd beïnvloed door IT-injectie (enkele of meerdere injecties), noch veranderde IT-injectie met placebo (zoutoplossing) de longfunctie of longstructuur in vergelijking met controles¹⁸.

Daarnaast hebben we de techniek gevalideerd in een reeks experimenten die de pulmonale afgif...

Discussie

Er moeten verschillende cruciale stappen worden gevolgd om IT-injectie met succes uit te voeren. Indien correct uitgevoerd, zorgt de transcutane IT-injectiemethode voor een effectieve en betrouwbare intrapulmonale toediening van geneesmiddelen bij het te vroeg geboren konijn. Temperatuurregeling is belangrijk omdat de pasgeboren pups gemakkelijk onderkoeld raken, wat de overleving negatief kan beïnvloeden. Voordat de pups in de inductiekamer worden geplaatst, moet de temperatuur worden g...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Anesthesie
Verwarmingsmat om koeling tijdens anesthesie te voorkomen			1
Isofluraannevelmachine met zuurstoftoevoer			1
Isofluraan (Iso-Vet; 1000 mg/g)	Dechra Veterinary Products NV, België		2% bij 2 liter/minuut
Plexiglas inductiekamer met afvoer en afzuigsysteem	In huis gebouwd		1
Positionering voor injectie
Monteerfase	In huis gebouwd (gemaakt van styrofoam om flexibele positionering mogelijk te maken		1
Neuskoker aangesloten op anesthesiecircuit			1
Afzuigsysteem			1
Tape om ledematen vast te zetten	Elke		1 rol
Intratracheale injectie
Allis weefseltang			1
19-mm-lange 26-gauge katheter	BD Biosciences	391349	1
Hamilton-spuit (10µl met 20 mm stompe 30-gauge naald	Hamilton Company	7638-01	1
Farmaceutische stof naar keuze			zoals in het protocol
Saline (0,9% NaCl)			5 µl per dier
Dierverblijf
Bevochtigings- en temperatuurregelende incubator	Okolab Srl. Op maat gemaakte kooi-incubator. Als alternatief kunnen in huis gebouwde kooi-incubators worden gebruikt