Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Covalente etikettering met diethylpyrocarbonaat voor het bestuderen van eiwitstructuur in hogere orde door massaspectrometrie

5.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/61983

⸱

15 juni 2021

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry, University of Massachusetts Amherst, 2Molecular and Cellular Biology Program, University of Massachusetts Amherst, 3Department of Food and Pharmaceutical Chemistry, Faculty of Pharmaceutical Sciences, Chulalongkorn University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

De experimentele procedures voor het uitvoeren van covalente etikettering op basis van diethylpyrocarbonaat met massaspectrometrische detectie worden beschreven. Diethylpyrocarbonaat wordt eenvoudig gemengd met het eiwit- of eiwitcomplex van belang, wat leidt tot de wijziging van oplosmiddeltoegankelijke aminozuurresiduen. De gemodificeerde residuen kunnen worden geïdentificeerd na proteolytische vergisting en vloeistofchromatografie/massaspectrometrieanalyse.

Samenvatting

Het karakteriseren van de hogere ordestructuur van een eiwit is essentieel voor het begrijpen van de functie ervan. Massaspectrometrie (MS) is naar voren gekomen als een krachtig hulpmiddel voor dit doel, vooral voor eiwitsystemen die moeilijk te bestuderen zijn met traditionele methoden. Om de structuur van een eiwit door MS te bestuderen, worden specifieke chemische reacties uitgevoerd in een oplossing die de structurele informatie van een eiwit in zijn massa codeert. Een bijzonder effectieve aanpak is het gebruik van reagentia die covalent oplosmiddel toegankelijke aminozuur zijketens wijzigen. Deze reacties leiden tot massatoestijgingen die kunnen worden gelokaliseerd met een resolutie op residuniveau in combinatie met proteolytische spijsvertering en tandemmassaspectrometrie. Hier beschrijven we de protocollen die verband houden met het gebruik van diethylpyrocarbonaat (DEPC) als een covalent labelend reagens samen met MS-detectie. DEPC is een zeer elektrofiele molecule die tot 30% van de residuen in het gemiddelde eiwit kan labelen, waardoor een uitstekende structurele resolutie wordt geboden. DEPC is met succes samen met MS gebruikt om structurele informatie te verkrijgen voor kleine single-domain eiwitten, zoals β2-microglobuline, voor grote multidomeineiwitten, zoals monoklonale antilichamen.

Inleiding

Eiwitten zijn essentiële biomoleculen in vrijwel elk fysiologisch proces. De verscheidenheid aan functies die eiwitten uitvoeren, is mogelijk vanwege de structuren die ze aannemen en de interacties die ze hebben met andere biomoleculen. Om de eiwitfunctie op een dieper niveau te begrijpen, zijn biochemische en biofysische hulpmiddelen nodig om deze belangrijke structurele kenmerken en interacties op te helderen. Traditioneel hebben röntgenkristallografie, cryogene elektronenmicroscopie en nucleaire magnetische resonantie (NMR) spectroscopie het gewenste atoomniveaudetail opgeleverd om de eiwitstructuur te onthullen. Talrijke eiwitsystemen kunnen echter niet door deze technieken worden ondervraagd vanwege slecht kristallisatiegedrag, beperkte eiwitbeschikbaarheid, overmatige monster heterogeniteit of moleculaire gewichtsbeperkingen. Bijgevolg zijn er nieuwere analysemethoden ontstaan die deze beperkingen overwinnen. Een van de opkomende technieken die eiwit structurele informatie kan leveren is massaspectrometrie.

Massaspectrometrie (MS) meet de massa-op-ladingverhouding (m/z) van een molecuul, dus eiwit hogere orde structurele informatie moet worden verkregen door de gewenste structurele informatie te coderen in de massa van het eiwit. Er zijn verschillende benaderingen ontwikkeld om deze informatie te coderen, waaronder waterstof-deuteriumuitwisseling (HDX)1,2,3,4, chemische crosslinking (XL)5,6en covalente etikettering (CL)7,8,9,10. In HDX worden backboneamidewaterstofen uitgewisseld door iets massievere deuteriums tegen snelheden die afhankelijk zijn van de toegankelijkheid van oplosmiddelen en de mate van H-binding. De omvang van HDX kan worden gelokaliseerd door het eiwit snel te verteren tot peptidefragmenten voordat deze fragmenten worden gescheiden en gemeten door de massaspectrometer of door het eiwit te scheiden in een top-down experiment. Het bepalen van de wisselkoers geeft meer inzicht in eiwitdynamiek. HDX heeft bewezen een waardevol hulpmiddel te zijn voor het karakteriseren van de eiwitstructuur, ondanks uitdagingen in verband met ruguitwisseling en de behoefte aan gespecialiseerde apparatuur om de reproduceerbaarheid te maximaliseren. Bij XL-MS worden eiwitten gereageerd met bi-functionele reagentia die naast elkaar vloeiende residuzijdeketens binnen een bepaald eiwit of tussen twee eiwitten met elkaar verbinden. Daarbij kan XL-MS afstandsbeperkingen bieden die kunnen worden gebruikt om de eiwitstructuur te karakteriseren. De gebieden van het eiwit die met elkaar verbonden zijn, kunnen worden geïdentificeerd door proteolytische spijsvertering gevolgd door vloeistofchromatografie (LC)-MS-analyse. Hoewel XL-MS een veelzijdig hulpmiddel is dat is gebruikt om een verscheidenheid aan eiwitcomplexen te bestuderen, waaronder in cellen, is de identificatie van de XL-producten een uitdaging en vereist het gespecialiseerde software.

CL-MS is onlangs naar voren gekomen als een aanvullend en soms alternatief op MS gebaseerd hulpmiddel om eiwitstructuur en interacties te bestuderen. Bij CL-MS wordt een eiwit- of eiwitcomplex covalent gewijzigd met een monofunctioneel reagens dat kan reageren met aan oplosmiddel blootgestelde zijketens (figuur 1). Door de modificatieomvang van een eiwit- of eiwitcomplex onder verschillende omstandigheden te vergelijken, kunnen conformatieveranderingen, bindingsplaatsen en eiwit-eiwitinterfaces worden onthuld. Na de CL-reactie kan sitespecifieke informatie, vaak op het niveau van één aminozuur, worden verkregen met behulp van typische bottom-up proteomics-workflows waarin eiwitten proteolytisch worden verteerd, peptidefragmenten worden gescheiden door LC en gemodificeerde locaties worden geïdentificeerd met behulp van tandem-MS (MS/MS). De rijke geschiedenis van bioconjugaatchemie heeft tal van reagentia beschikbaar gemaakt voor CL-MS-experimenten. CL-reagentia vallen in twee algemene categorieën: i) specifiek en ii) niet-specifiek. Specifieke reagentia reageren met één functionele groep (bijv. vrije aminen)8,10 en zijn gemakkelijk te implementeren, maar ze hebben de neiging om beperkte structurele informatie te verstrekken. Niet-specifieke reagentia reageren met een breed scala aan zijketens, maar vereisen vaak gespecialiseerde apparatuur zoals lasers of synchrotronbronnen om deze zeer reactieve soorten te produceren. Hydroxylradicalen zijn het meest gebruikte niet-specifieke reagens, dat is toegepast in hydroxylradicalenvoetafdruk (HRF)7,11,12,13 experimenten om een breed scala aan eiwitten en eiwitcomplexen onder verschillende omstandigheden te bestuderen.

Onze onderzoeksgroep heeft met succes een ander relatief niet-specifiek reagens genaamd diethylpyrocarbonaat (DEPC) gebruikt om eiwitstructuur en interacties te bestuderen in de context van CL-MS-experimenten14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25. DEPC biedt de eenvoud van specifieke etiketteerreagentia (d.w.z. er is geen gespecialiseerde apparatuur nodig om de reacties uit te voeren), terwijl het reageert met maximaal 30% van de aminozuren in het gemiddelde eiwit. Als een zeer elektrofiele reagens is DEPC in staat om te reageren met de N-terminus en de nucleofiele zijketens van cysteïne, histidine, lysine, tyrosine, serine en threonineresiduen. Meestal wordt een enkel product van deze reacties gegenereerd, wat resulteert in een massatoename van 72,02 Da. Dit ene type product staat in contrast met de tot 55 verschillende producten die kunnen worden geproduceerd wanneer eiwitten reageren met hydroxylradicalen7. Een dergelijke eenvoudige chemie vergemakkelijkt de identificatie van gelabelde sites.

Hier bieden we protocollen voor het gebruik van OP DEPC gebaseerde CL-MS om eiwitstructuur en interacties te bestuderen. Details in verband met reagensbereiding, DEPC-eiwitreacties, eiwitverteringsomstandigheden, LC-MS- en MS/MS-parameters en gegevensanalyse worden beschreven. We tonen ook het nut van DEPC-etikettering aan door voorbeeldresultaten te geven van eiwit-metaal-, eiwit-ligand- en eiwit-eiwitinteracties, evenals eiwitten die structurele veranderingen ondergaan bij verhitting.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Eiwit- en reagensbereiding

OPMERKING: Dit protocol bevat een voorbeeldworkflow voor het labelen van een eiwit met DEPC. Sommige vermelde aandoeningen en reagensconcentraties kunnen variëren op basis van het eiwit van keuze.

  1. Bereid alle reagensoplossingen in microcentrifugebuizen van 1,5 ml.
  2. Bereid een eiwitoplossing van de gewenste concentratie, meestal in het bereik van tientallen μM, in een 10 mM 3-(N-morpholino)propaansulfonzuur (MOPS) buffer bij pH 7,4. U kunt ook een bestaande eiwitoplossing voor bufferuitwisseling bereiden in een pH van 10 mM 7,4 MOPS als het monster een nucleofiele buffer bevat die reactief zou zijn met DEPC. Andere buffers (bijv. fosfaatgebufferde zoutoplossing) kunnen ook worden gebruikt, zolang ze geen nucleofiele functionele groepen hebben.
  3. Bereid een 100 mM DEPC-oplossing in droog acetonitril (ACN) door 1,45 μL van de standaard 6,9 M DEPC-oplossing in 98,55 μL van de ACN te gieten.
    OPMERKING: Er is niet één set concentraties die met elk eiwit zal werken, hoewel de optimale concentraties kunnen worden geschat op basis van het aantal Zijne en Lys-residuen23. Reageer bijvoorbeeld met 50 μL van een 50 μM β2-microglobulineoplossing het eiwit met 0,2 μL van de 100 mM DEPC voor een uiteindelijke DEPC-concentratie van 200 μM (gelijk aan 4x de eiwitconcentratie) om de gewenste molaire verhouding te garanderen met behulp van dit algemene voorbeeld (Tabel 1). DEPC-etikettering is een2e orde reactie, dus het veranderen van de concentratie van eiwitten of DEPC in het reactiemengsel zal de etiketteringssnelheid veranderen.
  4. Bereid 1 M imidazoloplossing door 10 mg imidazol te wegen en op te lossen in 146,9 μL HPLC-water.

2. Covalente etikettering van intact eiwit

  1. Stel de temperatuur van het waterbad in op 37 °C en wacht tot het bad een stabiele temperatuur heeft bereikt.
    OPMERKING: Reagensconcentraties en -volumes voor een voorbeeldetiketteringsprotocol zijn te vinden in tabel 1.
  2. Meng mopsbuffer en eiwitoplossing in een nieuwe microcentrifugebuis in de in tabel 1vermelde volumes .
  3. Voeg aan het eiwit en de buffer 0,2 μL van de DEPC-oplossing toe, zorg ervoor dat u de resulterende oplossing goed mengt en plaats vervolgens de buis met het reactiemengsel gedurende 1 minuut in het waterbad van 37 °C.
    OPMERKING: Het toegevoegde volume ACN mag niet groter zijn dan 1% van het totale reactievolume om verstoring van de structuur van het eiwit tijdens de etiketteringsreactie te voorkomen. De reactietijd is aan de gebruiker, hoewel een reactie van 1 minuut onder de voorbeeldomstandigheden overlabeling en de potentiële hydrolyse van DEPC14minimaliseert.
  4. Verwijder na 1 minuut de buis met het reactiemengsel uit het waterbad en doof de reactie met 1 μL van de 1 M imidazoloplossing om de resterende niet-geactiveerde DEPC op te ruimen.
    OPMERKING: De uiteindelijke concentratie imidazol in het reactiemengsel moet gelijk zijn aan 50x de concentratie DEPC in het reactiemengsel. Dit zorgt ervoor dat de resterende niet-gerealiseerde DEPC wordt opgegraven.

3. Bereiding van eiwitvertering voor bottom-up LC-MS

OPMERKING: Kies spijsverteringsomstandigheden die vatbaar zijn voor het eiwit van belang. Veel voorkomende stappen zijn het ontvouwen van het eiwit en het verminderen en alkyleren van eventuele disulfidebindingen.

  1. Vouw het eiwit uit door een geschikt uitvouwreagens aan het reactiemengsel toe te voegen.
    OPMERKING: Veel voorkomende ontvouwingsmiddelen zijn ACN, ureum en guanidinehydrochloride (GuHCl).
  2. Bereid oplossingen van Tris(2-carboxyethyl)fosfine (TCEP) en iodoacetamide (IAM) voor door elk 5 mg te wegen en op te lossen in nieuwe microcentrifugebuizen in respectievelijk 174,4 en 270,3 μL van 10 mM pH 7,4 MOPS-buffer voor de reductie- en alkyleringsstappen.
  3. Verminder disulfidebindingen door 2 μL van de 100 mM TCEP (eindconcentratie van 2 mM in reactiemengsel) oplossing aan het reactiemengsel toe te voegen en gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur te reageren.
    OPMERKING: De uiteindelijke concentratie TCEP moet gelijk zijn aan 40x de eiwitconcentratie per disulfidebinding die in de oplossing aanwezig is.
  4. Alkylaat verminderde cysteïnes met 4 μL van de 100 mM IAM-oplossing (eindconcentratie van 4 mM in reactiemengsel) gedurende 30 minuten in het donker. IAM is lichtgevoelig en zal ontleden onder direct licht.
    OPMERKING: De uiteindelijke concentratie IAM in oplossing moet tweemaal de concentratie zijn die voor TCEP wordt gebruikt, of 80x de eiwitconcentratie per disulfidebinding.
  5. Verteer het eiwit met een geschikt enzym zoals trypsine of chymotrypsine. Een 10:1 eiwit:enzymverhouding voor een 3-uurs spijsvertering bij 37 °C met geïmmobiliseerd enzym bij een schudsnelheid van 300 slagen/min is meestal voldoende voor DEPC-gelabelde eiwitten. Zie Discussie.
  6. Scheid na de spijsvertering het geïmmobiliseerde enzym van de verteerde peptiden door centrifugeren bij 12.000 tpm gedurende 5 minuten.
  7. Analyseer het monster onmiddellijk met LC-MS/MS of flash-freeze het monster met vloeibare stikstof om monsterdegradatie en labelverlies te minimaliseren. Bewaar de flash-frozen monsters bij < -20 °C tot ze klaar zijn voor LC-MS/MS analyse.

4. LC-MS/MS-analyse

OPMERKING: Standaard LC-MS/MS-parameters voor bottom-up proteomica kunnen worden gebruikt om gelabelde locaties op de proteolytische peptidefragmenten te identificeren. Een algemeen voorbeeld wordt hieronder beschreven.

  1. Scheid de DEPC-gelabelde peptiden met behulp van een omgekeerde fase C18 stationaire fase. Gebruik een typische LC mobiele fase van twee oplosmiddelen: (A) water + 0,1% mierenzuur en (B) ACN + 0,1% mierenzuur met behulp van een gradiënt (bijv. figuur 2) om de beste scheiding van peptiden te bereiken.
    OPMERKING: De scheidingstijd kan worden geoptimaliseerd op basis van de complexiteit van het monster en het mobiele fasedebiet is afhankelijk van het gebruik van capillaire of nano LC.
  2. Gebruik een massaspectrometer die in staat is om online LC-MS en MS/MS te doen om DEPC-modificatielocaties op het peptide te identificeren. In onze experimenten hebben we met succes verschillende soorten massaspectrometers gebruikt. Elke massaspectrometer die in staat is om automatisch MS/MS van veel peptiden uit te voeren tijdens een LC-MS-analyse, moet geschikt zijn. Relevante MS-parameters zijn: ESI-bronspanning = -4000 V voor reguliere ESI; -2000 V voor nanospray; Orbitrap resolutie = 60.000; Dynamische uitsluitingsduur = 30 s; MS/MS-activeringstype: CID, ETD of beide; Massascanbereik = 200-2.000; Automatische gain control = 4.0E5 (MS1 in Orbitrap) en 5.0E4 (MS2 in lineaire quadrupole ionenvanger).
  3. Laad en injecteer het verteerd, gelabeld eiwitmonster in het LC-systeem en start de LC-MS/MS-acquisitie. Als het monster is bevroren, ontdooi dan vóór de analyse. Leid het LC-effluent de eerste 5 minuten om naar afval om te voorkomen dat overmatige zouten in de ESI-bron komen.
    OPMERKING: Over het algemeen wordt een injectielus van 5 μL gebruikt, waardoor ongeveer 2,5 μg eiwit op de LC-MS/MS kan worden toegediend. Dit is afhankelijk van de belastingsomstandigheden van de LC om de monsterinjector niet te verstoppen.

5. Gegevensanalyse

  1. Identificeer DEPC-labellocaties en kwantificeer peptidepiekgebieden met behulp van geschikte software voor de massaspectrometer die wordt gebruikt.
  2. Neem DEPC-toevoeging (72,02 Da) en carbamidomethylatie (57,02 Da) op als variabele wijzigingen. Aanvullende zoekparameters voor de MS/MS-analyse zijn als volgt: Maximale gemiste kloven = 3; Fragmentionen = b en y; Precursor m/z tolerantie = 10 ppm (deze waarde moet hoger zijn als een quadrupole ion trap mass spectrometer wordt gebruikt); Fragment m/z tolerantie = 0,5 Da (deze waarde moet lager zijn als een massaspectrometer met hoge resolutie wordt gebruikt voor een productsonscan); Voorloperlading = 1-4.
    OPMERKING: Verschillende databasezoekalgoritmen hebben verschillende scoresystemen en velen kunnen moeite hebben met het identificeren van DEPC-gemodificeerde peptiden omdat wijzigingsniveaus laag kunnen zijn. Het aanpassen van de score cutoff kan nodig zijn om meer gelabelde peptiden te identificeren. Als dat het vraag is, moet handmatige ondervraging van de MS/MS-gegevens worden gebruikt om laag scorende peptiden te verifiëren. Het product van de hydrolyse van het DEPC-label is niet opgenomen in het zoeken naar gegevens omdat de gehydrolyseerde DEPC niet langer reageert op nucleofiele zijketens.
  3. Modificatiepercentages op residuniveau bepalen met behulp van de chromatografische piekgebieden van de gewijzigde en ongewijzigde versies van de peptiden.
    OPMERKING: Elk peptide dat het gewijzigde residu van belang bevat, moet in aanmerking worden genomen en alle ladingstoestanden die zijn opgenomen, moeten in alle gemeten monsters aanwezig zijn. Peptiden met verschillende ionisatie-efficiëntie en eluting op verschillende tijdstippen zorgt ervoor dat deze waarde een relatieve in plaats van absolute maat is voor de wijziging van een specifieke locatie.
    figure-protocol-1
    waarbij Ai,z het piekgebied vertegenwoordigt van een bepaald peptide (i) dat het residu van belang bevat en rekening houdt met alle gedetecteerde ladingstoestanden (z).
  4. Bepaal of een etiketteringswijziging tussen een controle- en experimenteel monster significant is met behulp van statistische evaluatie. Drie repliceermetingen voor elk monster zijn typisch en t-tests worden meestal gebruikt met betrouwbaarheidsintervallen van 95 of 99%.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Identificeren van DEPC modificatiesites en wijzigingspercentages
Massatoevoeging als gevolg van covalente etikettering kan worden gemeten op de a) intacte eiwit - en b) peptideniveaus8,9. Op intact niveau kan een verdeling van eiwitsoorten met verschillende aantallen etiketten worden verkregen uit directe analyse of LC-MS van gelabelde eiwitmonsters. Om structurele informatie met een hogere resolutie te verkrijgen (d.w.z. sitespecifieke etiketteringsg...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Kritieke stappen
Er moeten verschillende punten met betrekking tot het experimentele ontwerp worden overwogen om betrouwbare etiketteringsresultaten te garanderen. Ten eerste, om eiwitetikettering te maximaliseren, is het noodzakelijk om buffers met sterk nucleofiele groepen (bijv. Tris) te vermijden, omdat ze kunnen reageren met DEPC en de mate van etikettering kunnen verlagen. Het is ook denkbaar dat dergelijke buffers kunnen reageren met gelabelde residuen, waardoor het etiket wordt verwijderd en dus struc...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets bekend te maken.

Dankbetuigingen

De auteurs erkennen steun van de National Institutes of Health (NIH) onder Grant R01 GM075092. De Thermo Orbitrap Fusion massaspectrometer die werd gebruikt om enkele van de hier beschreven gegevens te verkrijgen, werd verworven met fondsen van de National Institutes of Health grant S10OD010645.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1.5 mL microcentrifuge tubeThermo Fisher Scientific3448
3-(N-morpholino)propaansulfonzuurMillipore SigmaM1254
3-(N-morpholino)propaansulfonzuur natriumzoutMillipore SigmaM9381
Acclaim PepMap RSLC C18 ColumnThermo Scientific164537300 μm x 15 cm, C18, 2 μm, 100 A
AcetonitrilFisher ScientificA998-1
DiethylpyrocarbonaatMillipore SigmaD5758
HPLC-grade waterFisher ScientificW5-1
ImidazoolMillipore SigmaI5513
Geïmmobiliseerd chymotrypsineProteoChemg4105
Geïmmobiliseerd trypsine, TPCK BehandeldThermo Fisher Scientific20230
IodoacetamideMillipore SigmaI1149
Tris(2-carboxyethyl)fosfineMillipore SigmaC4706

Referenties

  1. Katta, V., Chait, B. T., Carr, S. Conformational Changes in Proteins Probed by Hydrogen-exchange Electrospray-ionization. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 5, 214-217 (1991).
  2. Wales, T. E., Engen, J. R. Hydrogen exchange mass spectrometry for the analysis of protein dynamics. Mass Spectrometry Reviews. 25, 158-170 (2006).
  3. Pirrone, G. F., Iacob, R. E., Engen, J. R. Applications of hydrogen/deuterium exchange MS from 2012 to 2014. Analytical Chemistry. 87, 99-118 (2015).
  4. Oganesyan, I., Lento, C., Wilson, D. J. Contemporary hydrogen deuterium exchange mass spectrometry. Methods. 144, 27-42 (2018).
  5. Sinz, A. Chemical cross-linking and mass spectrometry to map three-dimensional protein structures and protein-protein interactions. Mass Spectrometry Reviews. 25, 663-682 (2006).
  6. Holding, A. N. XL-MS: Protein cross-linking coupled with mass spectrometry. Methods. 89, 54-63 (2015).
  7. Xu, G., Chance, M. R. Hydroxyl radical-mediated modification of proteins as probes for structural proteomics. Chemical Reviews. 107, 3514-3543 (2007).
  8. Mendoza, V. L., Vachet, R. W. Probing Protein Structure by Amino Acid-Specific Covalent Labeling and Mass Spectrometry. Mass Spectrometry Reviews. 28, 785-815 (2009).
  9. Limpikirati, P., Liu, T., Vachet, R. W. Covalent labeling-mass spectrometry with non-specific reagents for studying protein structure and interactions. Methods. 144, 79-93 (2018).
  10. Liu, X. R., Zhang, M. M., Gross, M. L. Mass Spectrometry-Based Protein Footprinting for Higher-Order Structure Analysis: Fundamentals and Applications. Chemistry Reviews. 120, 4335(2020).
  11. Maleknia, S. D., Brenowitz, M., Chance, M. R. Millisecond radiolytic modification of peptides by synchrotron X-rays identified by mass spectrometry. Analytical Chemistry. 71, 3965-3973 (1999).
  12. Aye, T. T., Low, T. Y., Sze, S. K. Nanosecond laser-induced photochemical oxidation method for protein surface mapping with mass spectrometry. Analytical Chemistry. 77, 5814-5822 (2005).
  13. Hambly, D. M., Gross, M. L. Laser flash photolysis of hydrogen peroxide to oxidize protein solvent-accessible residues on the microsecond timescale. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 16, 2057-2063 (2005).
  14. Mendoza, V. L., Vachet, R. W. Protein surface mapping using diethylpyrocarbonate with mass spectrometric detection. Analytical Chemistry. 80, 2895-2904 (2008).
  15. Mendoza, V. L., Antwi, K., Barón-rodríguez, M. A., Blanco, C., Vachet, R. W. Structure of the Pre-amyloid Dimer of β-2-microglobulin from Covalent Labeling and Mass Spectrometry. Biochemistry. 49, 1522-1532 (2010).
  16. Mendoza, V. L., Barón-Rodríguez, M. A., Blanco, C., Vachet, R. W. Structural insights into the pre-amyloid tetramer of β-2-microglobulin from covalent labeling and mass spectrometry. Biochemistry. 50, 6711-6722 (2011).
  17. Zhou, Y., Vachet, R. W. Increased protein structural resolution from diethylpyrocarbonate-based covalent labeling and mass spectrometric detection. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 23, 708-717 (2012).
  18. Borotto, N. B., et al. Investigating Therapeutic Protein Structure with Diethylpyrocarbonate Labeling and Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 87, 10627-10634 (2015).
  19. Liu, T., Marcinko, T. M., Kiefer, P. A., Vachet, R. W. Using Covalent Labeling and Mass Spectrometry To Study Protein Binding Sites of Amyloid Inhibiting Molecules. Analytical Chemistry. 89, 11583-11591 (2017).
  20. Limpikirati, P., et al. Covalent labeling and mass spectrometry reveal subtle higher order structural changes for antibody therapeutics. MAbs. 11, 463-476 (2019).
  21. Limpikirati, P., Pan, X., Vachet, R. W. Covalent Labeling with Diethylpyrocarbonate: Sensitive to the Residue Microenvironment, Providing Improved Analysis of Protein Higher Order Structure by Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 91, 8516-8523 (2019).
  22. Liu, T., Limpikirati, P., Vachet, R. W. Synergistic Structural Information from Covalent Labeling and Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry for Protein-Ligand Interactions. Analytical Chemistry. 91, 15248-15254 (2019).
  23. Pan, X., Limpikirati, P., Chen, H., Liu, T., Vachet, R. W. Higher-Order Structure Influences the Kinetics of Diethylpyrocarbonate Covalent Labeling of Proteins. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 31, 658-665 (2020).
  24. Limpikirati, P. K., Zhao, B., Pan, X., Eyles, S. J., Vachet, R. W. Covalent Labeling/Mass Spectrometry of Monoclonal Antibodies with Diethylpyrocarbonate: Reaction Kinetics for Ensuring Protein Structural Integrity. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 31, 1223-1232 (2020).
  25. Liu, T., Marcinko, T. M., Vachet, R. W. Protein-Ligand Affinity Determinations Using Covalent Labeling-Mass Spectrometry. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 31, 1544-1553 (2020).
  26. Srikanth, R., Mendoza, V. L., Bridgewater, J. D., Zhang, G., Vachet, R. W. Copper Binding to β-2-Microglobulin and its Pre-Amyloid Oligomers. Biochemistry. 48, 9871-9881 (2009).
  27. Lim, J., Vachet, R. W. Using mass spectrometry to study copper-protein binding under native and non-native conditions: β-2-microglobulin. Analytical Chemistry. 76, 3498-3504 (2004).
  28. Lindsley, C. W. Predictions and Statistics for the Best-Selling Drugs Globally and in the United States in 2018 and a Look Forward to 2024 Projections. ACS Chemical Neuroscience. 10, 1115(2019).
  29. Floege, J., Ketteler, M. β2-Microglobulin-derived amyloidosis: An update. Kidney International. 59, 164(2001).
  30. Antwi, K., et al. Cu (II) organizes β-2-microglobulin oligomers but is released upon amyloid formation. Protein Science. 17, 748-759 (2008).
  31. Dong, J., et al. Unique Effect of Cu(II) in the Metal-Induced Amyloid Formation of β-2-Microglobulin. Biochemistry. 53, 1263-1274 (2014).
  32. Marcinko, T. M., Drews, T., Liu, T., Vachet, R. W. Epigallocatechin-3-gallate Inhibits Cu(II)-Induced β-2-Microglobulin Amyloid Formation by Binding to the Edge of Its β-Sheets. Biochemistry. 59, 1093-1103 (2020).
  33. Zhou, Y., Vachet, R. W. Diethylpyrocarbonate Labeling for the Structural Analysis of Proteins: Label Scrambling in Solution and How to Avoid it. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 23, 899-907 (2012).
  34. Borotto, N. B., Degraan-Weber, N., Zhou, Y., Vachet, R. W. Label scrambling during CID of covalently labeled peptide ions. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 25, 1739-1746 (2014).
  35. Aprahamian, M. L., Chea, E. E., Jones, L. M., Lindert, S. Rosetta Protein Structure Prediction from Hydroxyl Radical Protein Footprinting Mass Spectrometry Data. Analytical Chemistry. 90, 7721-7729 (2018).
  36. Schmidt, C., et al. Surface Accessibility and Dynamics of Macromolecular Assemblies Probed by Covalent Labeling Mass Spectrometry and Integrative Modeling. Analytical Chemistry. 89, 1459-1468 (2017).
  37. Zheng, X., Wintrode, P. L., Chance, M. R. Complementary Structural Mass Spectrometry Techniques Reveal Local Dynamics in Functionally Important Regions of a Metastable Serpin. Structure. 16, 38-51 (2008).
  38. Pan, Y., Piyadasa, H., O'Neil, J. D., Konermann, L. Conformational dynamics of a membrane transport protein probed by H/D exchange and covalent labeling: The glycerol facilitator. Journal of Molecular Biology. 416, 400-413 (2012).
  39. Li, J., et al. Mapping the Energetic Epitope of an Antibody/Interleukin-23 Interaction with Hydrogen/Deuterium Exchange, Fast Photochemical Oxidation of Proteins Mass Spectrometry, and Alanine Shave Mutagenesis. Analytical Chemistry. 89, 2250-2258 (2017).
  40. Borotto, N. B., Zhang, Z., Dong, J., Burant, B., Vachet, R. W. Increased β-Sheet Dynamics and D-E Loop Repositioning Are Necessary for Cu(II)-Induced Amyloid Formation by β-2-Microglobulin. Biochemistry. 56, 1095-1104 (2017).
  41. Shi, L., Liu, T., Gross, M. L., Huang, Y. Recognition of Human IgG1 by Fcγ Receptors: Structural Insights from Hydrogen-Deuterium Exchange and Fast Photochemical Oxidation of Proteins Coupled with Mass Spectrometry. Biochemistry. 58, 1074-1080 (2019).
  42. Gerega, S. K., Downard, K. M. PROXIMO - A new docking algorithm to model protein complexes using data from radical probe mass spectrometry (RP-MS). Bioinformatics. 22, 1702-1709 (2006).
  43. Kamal, J. K. A., Chance, M. R. Modeling of protein binary complexes using structural mass spectrometry data. Protein Science. 17, 79-94 (2007).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Eiwitstructuurproteolytische digestietandemmassaspectrometrieLC MS MShistidine lysine residuenoplosmiddel toegankelijkstructurele resolutie
Covalente etikettering met diethylpyrocarbonaat voor het bestuderen van eiwitstructuur in hogere orde door massaspectrometrie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.