Cavitatie verbeterde therapie bestuderen

Samenvatting

Het gepresenteerde experimentele protocol kan worden gebruikt om real-time metingen uit te voeren van cavitatieactiviteit in een celkweekapparaat met als doel onderzoek mogelijk te maken naar de voorwaarden die nodig zijn voor een succesvolle medicijnafgifte en/of andere bio-effecten.

Samenvatting

De interesse in de therapeutische toepassingen van echografie is aanzienlijk en groeit, met potentiële klinische doelen variërend van kanker tot de ziekte van Alzheimer. Cavitatie - de vorming en daaropvolgende beweging van bubbels binnen een echografieveld - vertegenwoordigt een belangrijk fenomeen dat ten grondslag ligt aan veel van deze behandelingen. Er blijft echter grote onzekerheid bestaan over de gedetailleerde werkingsmechanismen waarmee cavitatie therapeutische effecten bevordert en er is behoefte aan het ontwikkelen van betrouwbare monitoringtechnieken die klinisch kunnen worden geïmplementeerd. Er is met name een aanzienlijke variatie tussen studies in de blootstellingsparameters die worden gerapporteerd als succesvol leverende therapeutische effecten en de bijbehorende akoestische emissies. Het doel van dit document is om ontwerprichtlijnen en een experimenteel protocol te bieden met behulp van breed beschikbare componenten voor het uitvoeren van studies naar cavitatiegemedieerde bio-effecten, en om real-time akoestische monitoring op te nemen. Het is te hopen dat het protocol een meer wijdverbreide integratie van akoestische monitoring in therapeutische ultrasone experimenten mogelijk zal maken en een gemakkelijkere vergelijking tussen studies over blootstellingsomstandigheden en hun correlatie met relevante bio-effecten zal vergemakkelijken.

Inleiding

Echografie (VS) is op grote schaal gebruikt als een diagnostische beeldvormingstechniek vanwege het veilige en niet-invasieve karakter, het gemak van implementatie aan het bed van een patiënt en de kosteneffectiviteit¹. Naast zijn diagnostische en monitoringmogelijkheden heeft de VS een aanzienlijk potentieel voor therapeutische toepassingen. Vroeg werk onderzocht het gebruik ervan in trombolyse, DNA-transfectie en medicijnafgifte^2,3,4 en therapeutische VS vertegenwoordigt nu een zeer actief onderzoeksgebied, met toepassingen zoals tumorbehandeling^5,6,7,immunotherapie^8,9, verstoring van de bloed- hersenbarrière (BBB)^10,11,12,trombolyse^13,14,15en behandeling van bacteriële infecties^16,17. Een belangrijk fenomeen dat aan deze toepassingen ten grondslag ligt, is cavitatie: de nucleatie, groei en oscillatie van gasvormige holtes als gevolg van veranderingen in vloeistofdruk^18,19.

Er is een reeks mechanismen waarmee cavitatie biologische effecten veroorzaakt. Bijvoorbeeld, de hoogst niet-lineaire aard van bellenschommelingen onder invloed van een toegepast Amerikaans veld kan microstreaming in de omringende vloeistof genereren die zowel medicijnconvectie²⁰ kan verbeteren als schuifspanningen kan uitoefenen op het weefsel in de buurt van de bubbels. Dit komt met name voor wanneer bellen zich in de buurt van een grens bevinden, waardoor bellen niet-bolvormig oscilleren , en mogelijk de opname van geneesmiddelen bevorderen door door afschuiving geïnduceerde permeabilisatie^21,22,23,24. Bij hogere drukken worden grotere amplitudeschommelingen en snelle instorting van de bellen waargenomen, waardoor directe mechanische stress²⁵ wordt veroorzaakt en vaak schokgolven worden gegenereerd, en als gevolg daarvan grote drukgradiënten die weefsels kunnen verstoren en permeabiliseren^26,27. Het instorten van bellen in de buurt van een oppervlak kan ook leiden tot de vorming van vloeistofmicrojets met hoge snelheid^28,29,30. Deze microjets kunnen weefsel binnendringen, mogelijk poriën creëren of secundaire stressgolven veroorzaken^31,32. De permeabilisatie van biologische membranen op zowel weefsel- als cellulaire niveaus wordt verschillende worden sonoforese genoemd, voornamelijk gebruikt in de context van door de VS geïnduceerde verbetering van de huidpermeabiliteit^33,34en sonoporatie, voornamelijk gebruikt om de reversibele permeabilisatie van het cellulaire membraan als gevolg van de vorming van membraanporiën^35,36te beschrijven .

Viskeuze absorptie in de vloeistof direct rond de oscillerende bel kan een aanzienlijk verwarmingseffect veroorzaken³⁷. Bovendien produceren de zeer niet-lineaire oscillaties akoestische straling bij frequenties die hoger zijn dan het rijdende Amerikaanse veld. Dit leidt tot een verhoogde absorptie in het omliggende weefsel en verdere verwarming³⁸. Bubble collapse kan ook gepaard gaan met chemische effecten als gevolg van de voorbijgaande hoge temperaturen en druk in de bubbelkern, zoals het genereren van zeer reactieve soorten en elektromagnetische straling, bekend als sonoluminescentie³². Deze effecten zijn onderzocht om mogelijke schade en/of activering van relevante cellulaire trajecten voor levering³⁹ te beoordelen en worden benut bij lokale activering van lichtgevoelige geneesmiddelen in een benadering die bekend staat als sonodynamische therapie^40,41,42,43.

Veel door de VS gemedieerde bio-effecten kunnen uitsluitend worden geïnitieerd door controle van amerikaanse veldparameters (drukamplitude, frequentie, pulslengte en herhalingsfrequentie en duur van blootstelling), maar het betrouwbaar genereren van cavitatie in biologisch weefsel vereist vaak hoge inputenergieën en draagt daarom een verhoogd risico op schade met zich mee. De introductie van exogene of kunstmatige cavitatiekernen kan de inputenergie die nodig is om het brede scala aan effecten te produceren die hierboven zijn besproken, aanzienlijk verminderen en introduceert verder extra effecten die mogelijk niet mogelijk zijn met alleen de VS. Cavitatiekernen omvatten gasbellen^26,44, vloeibare druppels^45,46,47 en vaste deeltjes^48,49,50, waarbij nanoschaal cavitatiekernen een emergent onderzoeksgebied zijn voor hun voordelen in termen van verlengde circulatietijd, verbeterde extravasatie en langdurige cavitatieactiviteit^49,51,52,53.

De meest gebruikte kernen zijn gasmicrobubbles (MB's), oorspronkelijk gebruikt als contrastmiddelen in diagnostische beeldvorming. Ze hebben een diameter van meestal 1-2 micrometer en bevatten een kern van een gas met een hoog molecuulgewicht met een lage waterige oplosbaarheid in het omringende medium. De kern is omgeven door een beschermende lipide, eiwit of polymeer shell meestal bestaande uit fosfolipiden⁵⁴. Wanneer ze worden blootgesteld aan een Amerikaans veld, zorgt de samendrukbaarheid van de MB's ervoor dat ze volumetrische oscillaties ondergaan, waardoor sterke akoestische verstrooiing ontstaat, wat verantwoordelijk is voor het succes van MB's als contrastmiddel. Zoals gezegd leiden deze oscillaties ook tot de bovengenoemde mechanische, thermische en chemische effecten die kunnen worden gebruikt in therapeutische toepassingen. Het MB-coatingproces biedt ook een mechanisme voor het inkapselen van geneesmiddelen binnen de MB-structuur en voor het bevestigen van geneesmiddelen en/of targetingsoorten aan het MB-oppervlak. Deze techniek vergemakkelijkt de geactiveerde afgifte van geneesmiddelen om systemische toxiciteit te verminderen⁵⁵. Onlangs is ook aangetoond dat materiaal van het MB-oppervlak kan worden overgebracht naar biologische structuren, waardoor de afgifte van geneesmiddelen wordt verbeterd door middel van zogenaamde "sonoprinting"^56,57,58.

Monitoring van door de VS gemedieerde cavitatieactiviteit kan inzicht geven in de resulterende biologische effecten, zowel in vitro als in vivo, en maakt mogelijk het afstemmen en optimaliseren van deze effecten mogelijk. De twee meest toegepaste methoden voor het monitoren van cavitatieactiviteit zijn i) optisch, die ultrasnelle videomicroscopie gebruiken en over het algemeen niet haalbaar zijn in vivo; en ii) akoestisch, die de opnieuw uitgestraalde geluidsvelden opnemen die worden geproduceerd door oscillerende en / of instortende bubbels. Zowel de amplitude- als frequentiecomponenten van het akoestische signaal bevatten informatie over het gedrag van de bellen. Van lage concentraties bellen bij lage incidentele Amerikaanse amplitudes is aangetoond dat ze overwegend harmonische emissies (gehele veelvouden van de rijfrequentie) produceren⁵⁹. Naarmate de rijdruk toeneemt, kan het bubbelemissiespectrum ook fractionele componenten bevatten die bekend staan als subharmonica en ultraharmonica⁶⁰ die wijzen op sterker niet-lineair gedrag, evenals breedbandruis, wat wijst op traagheids cavitatie. Integer harmonischen zijn een primaire indicator van bubble oscillatie, maar kunnen ook worden veroorzaakt door niet-lineariteiten overal in een experimenteel systeem, bijvoorbeeld als gevolg van niet-lineaire propagatie. Fractionele harmonischen en breedbandruis daarentegen zijn zeer sterk gecorreleerd met bellendynamiek.

De relatie tussen bellengedrag en de gedetecteerde akoestische emissies kan gecompliceerd zijn door factoren zoals het amerikaanse veld van het incident, de nucleatieomgeving en de kenmerken van het detectietraject⁶⁰. Niettemin kan belangrijke informatie over bellengedrag en hun interacties met cellen worden verkregen door trends in frequentie en energie in het akoestische spectrum te onderscheiden. Deze gegevens kunnen ook waardevolle informatie opleveren die kan worden gebruikt om de basis te vormen voor klinische behandelingsbewakingstechnieken. Om deze informatie volledig te benutten, is de ontwikkeling van robuuste, vertaalbare en reproduceerbare experimentele methoden vereist.

Momenteel is er aanzienlijke variatie in gerapporteerde protocollen voor het ontwerpen van systemen en het uitvoeren van studies ter ondersteuning van de ontwikkeling van cavitatie-ondersteunde therapieën. Wat het apparaat betreft, is een reeks ontwerpbenaderingen uitgevoerd. Verschillende groepen hebben gebruik gemaakt van parallelplaatkamers^56,61,62,63,op maat gemaakt of in de handel verkrijgbaar (bijv. OptiCell, ThermoFisher Scientific). Hu et al. (2013) ontwikkelden een celkamer in combinatie met een Amerikaanse sonicatiemodule en real-time confocale beeldvorming⁶⁴, Carugo et al. (2015) gebruikten een systeem bestaande uit een commercieel verkrijgbaar celkweekschaaltje met een op maat gemaakt PDMS-deksel om onderdompeling in een waterbad mogelijk te maken tijdens Amerikaanse blootstelling⁶⁵, en Pereno et al. (2018) gebruikten een apparaat dat bestaat uit gelaagde acoustof. Het gebruik van op maat gemaakte en toepassingsspecifieke ontwerpen bemoeilijkt de karakterisering van het Amerikaanse veld en andere omgevingsblootstellingsomstandigheden, waardoor vergelijkingen tussen studies uitdagend zijn. Er is bijvoorbeeld een aanzienlijke variatie in de Amerikaanse parameters die zijn geïdentificeerd voor het bereiken van succesvolle sonoporatie, waaronder centrumfrequenties variërend van 0,02 tot 15 MHz, bedrijfscycli variërend van 1% tot continue golf en zeldzamefactionele drukken variërend van 0,1 tot 20 MPa^{23,64,67,68,69,70} ( Tabel1). Er is eveneens een aanzienlijke variatie in de spectrale componenten (harmonischen, subharmonischen enz.) die zijn geïdentificeerd als geassocieerd met bepaalde bio-effecten.

Het doel van dit werk is daarom om een gemakkelijk reproduceerbaar systeemontwerp- en implementatiekader te bieden voor de in vitro studie van cavitatie-geïnduceerde cellulaire bio-effecten met de specifieke opname van een cavitatiebewakingscapaciteit.

Protocol

1. Principes van systeemontwerp

OPMERKING: In deze sectie worden de ontwerpprincipes presenteert die worden gebruikt om systemen te maken voor blootstellings- en cavitatiebewaking in de VS. Deze beginselen worden geïllustreerd met twee bestaande systemen voor akoestische transfectie (SAT) (weergegeven in figuur 1). Elk systeem bestaat uit een celblootstellingscompartiment, een Amerikaanse bron en een transducer met één element die functioneert als een passieve cavitatiedetector (PCD), die allemaal zijn geïntegreerd in een testkamer op een bankje. Deze ontwerpen bouwen voort op de eerdere systeemontwikkeling beschreven in Carugo et al. (2015)⁶⁵.

1. Maximaliseer het gebruiksgemak.
   1. Maak het celblootstellingscompartiment compatibel met bestaande kweektechnieken en beeldvormingssystemen door bestaande commerciële celkweekapparaten te gebruiken als zaai-/groeisubstraten.
      1. Gebruik voor SAT2 een kweekschaal (35 mm diameter, waarvan een gebied met een diameter van 21 mm waarneembaar is, zie tabel met materialen).
      2. Gebruik voor SAT3 een Transwell-inzetstuk (diameter 6,5 mm, zie tabel met materialen). De Transwells hebben een doorlatend membraan en moeten daarom in celmedia worden geplaatst in plaats van in water.
2. Maak een snelle belasting en afdichting van het celblootstellingscompartiment mogelijk.
   1. Vorm het SAT2-celblootstellingscompartiment door op een flexibel polymeerdeksel over de kweekschaal te drukken (Carugo et al. 2015⁶⁵). Zoals te zien is in figuur 1C,heeft het deksel een paar gaten met een diameter van 1,2 mm waarmee het compartiment kan worden gevuld met een stompe naaldspuit van 18 G. Sluit deze vulpoorten na het vullen af met korte plastic staven(Tafel van materialen).
   2. Vul het SAT3-compartiment met een spuit of pipet en sluit af door op een rubberen stop/bung te drukken.
   3. Schakel een snelle belasting van het afgesloten celblootstellingscompartiment in de testkamer in. Houders voor de celblootstellingscompartimenten werden ingebouwd in de kamerdeksels, waar een lichte persing voldoende is om een goede uitlijning te garanderen. Met de systemen in figuur 1kan de tijd voor monsterveranderingen oplopen tot 20 seconden wanneer meerdere celblootstellingscompartimenten van tevoren zijn voorbereid.
   4. Minimaliseer het interne volume van de kamer, zodat het systeem draagbaar is en de hoeveelheid vereist water / media kan worden geminimaliseerd. Dit versnelt ook het herstel van accidentele morsen of lekken van cavitatiemiddelen uit het celblootstellingscompartiment.
      OPMERKING: Het interne volume van SAT2 is ongeveer 0,8 L. Het interne volume van SAT3 is ongeveer 7,6 L – groter gemaakt voor eenvoudig laden en wisselen van brontransducer of de configuratie ervan. Er werd een interne kamer van 0,3 L toegevoegd om het beschikbare volume te minimaliseren en om biologisch relevante vloeistoffen anders dan het vulwater van de tank (bijv. celkweekmedia) te kunnen gebruiken. De binnenkamerbodem is gemaakt van 30 μm dik mylar blad om een maximale akoestische transmissie mogelijk te maken.
   5. Maak de kamer en de interne componenten indien mogelijk van optisch heldere materialen, zodat eventuele problemen (bijv. lekken, ingesloten macrobubbels) snel kunnen worden waargenomen en verholpen.
3. Maximaliseer de akoestische overdraagbaarheid van het belichtingscompartiment.
   1. Maximaliseer de overdraagbaarheid door de keuzes van compartimentwandmaterialen en diktes. In de veronderstelling dat de vloeistoffen aan weerszijden van een muur in wezen hetzelfde zijn (bv. water), is de omvang van de normale^{drukoverdrachtscoëfficiënt 71:}
      , waarbij λ de golflengte in de wand van dikte Lis , en z _L en z_o de karakteristieke impedanties (producten van dichtheid en geluidssnelheid) zijn voor respectievelijk het wandmateriaal en de vloeistof. T = 1 duidt op een perfecte transmissie.
   2. Voor breedspectrummonitoring van cavitatie (bijv. 1-8 MHz) zullen de meeste laboratoriumpolymeren (bijv. PDMS, PTFE, polystyreen) de overgedragen druk met niet meer dan 10% veranderen als de dikte van het materiaal minder dan 1/10^e van een golflengte in het materiaal is. Deze voorwaarde kan moeilijk te voldoen zijn met standaard benodigdheden bij hoge frequenties (bijv. #1,5 coverslip bij 8 MHz), dus het is een goede gewoonte om de transmissiefrequentierespons te voorspellen of direct te kalibreren.
   3. Voor smalbandtransmissie van het Amerikaanse bronsignaal in het celblootstellingscompartiment, laat een dikkere laag toe als het ongeveer een geheel getal is van een halve golflengte in het laagmateriaal. Het PDMS-deksel in SAT2 wordt bijvoorbeeld gebruikt bij een dikte van 2,0 mm (~ 2 golflengte bij 1MHz, c_PDMS ~ 1000 m/s).
4. Maximaliseer het belichtingsgebied door selectie van bron- en celomgeving.
   1. Om het aantal blootgestelde cellen te maximaliseren, moet u het gebied van celaanhechting zo breed mogelijk maken met behoud van compatibiliteit met beschikbare kweek- en beeldvormingsapparatuur.
   2. Gebruik een Amerikaanse bron met een veld dat het celaanhechtingsgebied met minimale ruimtelijke variabiliteit overspant met behulp van het pre-focale gebied van een grote gerichte bron (SAT2) of een gerichte of lensbron met een hoofdkwabbreedte die overeenkomt met de diameter van het celbevestigingsgebied (SAT3). Zie de tabel met materialen voor specifieke bronnen.
   3. Minimaliseer de veldcomplexiteit die door de celcompartimenthouder wordt geïntroduceerd door het celcompartiment mechanisch te ondersteunen ver weg van het sterkste deel van het incidentveld, de verstrooiingsdoorsnede van de houder te minimaliseren of absorberend materiaal op de houder te plaatsen. Voorbeelden zijn te zien in figuur 1A en 1D.
5. Zorg voor herhaalbare blootstellingsomstandigheden.
   1. Beëindig het akoestische veld in een vaste grens om variabiliteit te elimineren die kan voortvloeien uit lucht-water interfaces in gedeeltelijk gevulde kamers. In SAT2 en 3 wordt dit bereikt door het installeren van een akoestische absorber (zie tabel met materialen) op het deksel van de kamer met een bijkomend voordeel dat de veldcomplexiteit die kan voortvloeien uit grensreflecties wordt verminderd.
   2. Bewaak en registreer de uitgangs-/broningang van de bronaandrijving, zodat kleine variabiliteit of grote storingen snel kunnen worden gedetecteerd. Gebruik een spanningssonde of een ander apparaat dat veilig kan worden gebruikt over het bereik van de aandrijfspanning van belang. Controleer regelmatig de kalibratie van de spanningssonde met behulp van een bekende bron zoals een golfvormgenerator.
   3. Controleer, bewaak en registreer de temperatuur van de kamer en de inhoud ervan. Reacties van cellen, transducers en voortplantingsmedium kunnen allemaal temperatuurgevoelig zijn. Bij SAT2 worden monitoring en controle uitgevoerd met een paar circulatiepoorten die zijn aangesloten op een waterconditioneringssysteem, terwijl SAT3 een aquariumverwarming gebruikt (niet weergegeven). Stel de watertemperatuur zo nodig in om de relevante fysiologische omstandigheden voor de therapeutische toepassing na te bootsen.
      OPMERKING: de interne temperaturen kunnen veranderen, zowel als gevolg van externe factoren als door door de VS gegenereerde verwarming van de transducer en het medium.
   4. Ontgast de kamervloeistof(en) zorgvuldig om de kans op onbedoelde cavitatie en/of verstrooiing van reeds bestaande bellen in het voortplantingspad te minimaliseren.
      OPMERKING: als ontgassing niet wordt uitgevoerd, bijvoorbeeld vanwege de negatieve impact op cellen, dan zal er een verhoogd achtergrondniveau van bellenactiviteit zijn, waarvoor geschikt is.
6. Kalibreer het volledig geassembleerde systeem.
   1. Voeg een middel toe om het drukveldincident op de blootgestelde cellen te meten wanneer alle systeemcomponenten aanwezig zijn, inclusief het celblootstellingscompartiment. In SAT2 en 3 wordt dit bereikt met een opening in het deksel van de kamer waardoor een naald of glasvezelhydrofoon kan worden ingebracht zonder het te meten veld te verstoren. Maak de metingen zo dicht mogelijk bij waar de cellen zich bevinden.
   2. Kies een hydrofoon met een gevoelige straal (een_rcv) is klein genoeg om het te meten drukveld niet verkeerd te kunnen gerapporteerd. De aanvaardbare grootte is een functie van bronfrequentie (f) en straal (een_src) evenals de afstand tussen bron en de veldscan (z_rcv). Een algemeen criterium voor de keuze van de hydrofoongrootte is: , wat leidt tot: , waarbij c de geluidssnelheid⁷²is .
   3. Zorg ervoor dat de hydrofoon is gekalibreerd onder de omstandigheden die worden gebruikt bij de karakterisering van het systeem, inclusief de temperatuur zoals gespecificeerd in punt 1.6. In het bijzonder, als de hydrofoon onder een hoek ten opzichte van het scanvlak wordt gehouden, moet de hydrofoon onder die hoek worden gekalibreerd, omdat de directiviteitseffecten aanzienlijk kunnen verschillen van de verwachte effecten die puur op geometrie zijn gebaseerd. De verandering in hydrofoongevoeligheid ten opzichte van de temperatuur moet bij de fabrikant beschikbaar zijn.
   4. Scan het hele gebied waarin cellen kunnen worden blootgesteld. Gebruik een scanafstand die niet grover is dan 1/5^e van een golflengte bij de hoogste frequentie van belang om een geschikt niveau van velddetail vast te leggen. Als onverwachte veldcomplexiteit wordt waargenomen, overweeg dan om korte burstsignalen (bijv. 1-3 cycli) te gebruiken om directe en verspreide veldbijdragen te identificeren en te kwantificeren.
7. Neem een cavitatiebewakingscapaciteit op.
   1. Bepaal het type en de plaatsing van de bewakingstransducer als onderdeel van het ontwerp van het algehele systeem, in plaats van als retrofit. In de praktijk leidt dit tot een systeem dat maximaal compact is zonder in te boeten aan het vermogen om de kritieke systeemcomponenten betrouwbaar uit te lijnen.
   2. Plaats een cavitatiebewakingsapparaat zo in het systeem dat het herhaalbaar kan worden geplaatst met minimale extra insteltijd of verstoring van de workflow. In SAT2 wordt dit bereikt met een piëzo-elektrische transducer met één element die fungeert als een PCD die in het kamerdeksel is gemonteerd, terwijl SAT3 de PCD in de bronbasis integreert met behulp van een 90° reflector.
   3. Selecteer de PCD-vorm op basis van de doelstellingen van de experimenten. In figuur 2tonen berekeningen van de halve amplitudecontouren van niet-gefocuste (links) en gerichte (rechts) apparaten de diepgaande verschillen in ruimtelijke gevoeligheid met betrekking tot frequentie. Het ongerichte apparaat is beter geschikt voor bewaking van grote volumes met een bescheiden ruimtelijke variatie ten opzichte van de frequentie, terwijl het scherpstelapparaat beter geschikt is voor meer radiaal compacte metingen op de frequenties van belang.
   4. Selecteer de PCD-centrumfrequentie en bandbreedte om aan de behoeften van het experiment te voldoen. De centrumfrequentie wordt meestal gekozen om ten minste vijf keer die van de Amerikaanse bron te zijn om de gevoeligheid voor directe bronemissies te minimaliseren. Bandbreedte wordt meestal gemaximaliseerd om een breed scala aan bellengedrag (harmonische en breedbandruis) te observeren.
   5. Selecteer conditionerings-, opname- en verwerkingsmethoden om analyse van cavitatiegegevens mogelijk te maken, zoals beschreven in de volgende sectie.

2. Instrumentatie en verwerking voor cavitatiemonitoring

OPMERKING: In deze sectie worden de signaalstroomcomponenten en -functies beschreven die worden aanbevolen voor het verzamelen van cavitatiebewakingsgegevens en de gegevensverwerking die leidt tot kwalitatieve en kwantitatieve beoordelingen van cavitatieactiviteit.

1. Instrumentatie (zie ook figuur 3).
   1. Tenzij de toepassing om een aangepast apparaat vraagt, selecteert u een PCD uit het brede scala aan commercieel beschikbare transducers met één element, meestal op de markt gebracht voor niet-destructieve tests van ondergedompelde doelen. Deze leveranciers hebben ook bekabeling en accessoires (bijv. de spiegelreflector in SAT3).
   2. Minimaliseer pcd-respons op de Amerikaanse bron. Dit kan zowel door selectie van de PCD (middenfrequentie en bandbreedte) als door gebruik te maken van een inkeping of high pass filter. Dit laatste is implementeerbaar als een zelfstandige module of als onderdeel van een signaalconditioneringsapparaat.
   3. Gebruik een digitizer met een groot dynamisch bereik (ten minste 12 bits) om zoveel mogelijk gegevens vast te leggen met minimale kans op hoge signaalopnamen en maximale signaal-ruisverhouding (SNR) van de kleinste signalen. Bekijk bij het vergelijken van apparaten de specificaties voor signaal tot ruis en vervorming en/of effectief aantal bits, omdat dit completere beschrijvingen van het haalbare dynamische bereik zijn. Overweeg ook of de grootte van de geheugenbuffer voldoende is voor de gewenste lengte en snelheid van gegevensopname.
   4. Optimaliseer het gebruik van het dynamische bereik van de digitizer. PCD-signalen kunnen verschillende ordes van grootte bestrijken, zowel vanwege een lange blootstelling (omdat bubbels worden geëlimineerd) als als er experimenten worden uitgevoerd op verschillende Amerikaanse schijfniveaus. Het is daarom noodzakelijk om te controleren of de signaalconditioneringsketting alle signalen schaalt, zodat ze goed kunnen worden geregistreerd.
   5. Neem een voorversterker op in de signaalketen, zodat de kleinste verwachte signalen adequaat kunnen worden vastgelegd. Onze ervaring is dat PCD-zelfruis ver onder die van de meeste digitizers ligt, dus een bescheiden mate van voorversterker (bijv. <100x) kan de SNR van het eindresultaat nog steeds verbeteren.
   6. Filter de Amerikaanse bronfrequentie vóór voorversterker om te voorkomen dat de versterker verzadigd raken.
   7. Als een Amerikaanse pulser/ontvanger wordt gebruikt om versterkings- en/of filtermogelijkheden te bieden, gebruikt u deze in de pulsermodus om de lengte/uitlijning van het pad te bevestigen of controleert u op onverwachte verstrooiers in het voortplantingspad tussen de PCD en het celblootstellingscompartiment.
   8. Schakel realtime streaming van gegevens naar opslag in. De SAT2- en SAT3-systemen maken beide gebruik van 12-bits streaming USB-oscilloscopen (zie tabel met materialen),die de gemakken van draagbaarheid en goed gebouwde gebruikersinterfaces hebben.
   9. Bevestig de juiste impedantiematching in de signaalketen om versterkings- of bandbreedtefouten te voorkomen. PCD-apparaten hebben meestal uitgangsimpedanties in de buurt van 50 ohm, dus een geschikt proces is om de PCD te vervangen door een bekend signaal van een golfvormgenerator (met 50 ohm uitgangsimpedantie) en te bevestigen dat de signaalgrootte die op de digitizer verschijnt, overeenkomt met de verwachtingen, lineair schaalt wanneer het geïnjecteerde signaal wordt gewijzigd en er geen knipsel wordt waargenomen voor het grootste signaal van belang.
2. Voorbewerking
   1. Corrigeer de ruwe spanningssignalen voor alle bekende winsten en gevoeligheden in het signaalpad die betrekking hebben op de verwerking van gegevens in het frequentiebereik van belang.
   2. Als de gegevens zijn geregistreerd met een DC-ingangskoppeling of anderszins een DC-offset vertonen, verwijdert u deze offset door directe aftrekking of met een high pass-filter.
3. Bereken het vermogensspectrum P van elk opgenomen signaal.
   1. Stel de Fourier-transformatielengte N_ft zo in dat de fundamentele frequentie van de Amerikaanse bron f₀ een groot geheel getal is van de breedte van de transformatieopslaglocatie: N_ft =   nf_s/f₀, waarbij n een geheel getal is en f_s de voorbeeldfrequentie van de gedigitaliseerde gegevens. Stel n ≥ 50 in voor het duidelijk vastleggen van spectrale kenmerken. Voor het voorbeeld van een 1 MHz fundamental bemonsterd op 50 MHz, N_ft is 2500 en de bin breedte is 0,02 MHz.
   2. Aangezien de transformatielengte N_ft meestal kleiner is dan de duur van het opgenomen signaal , gebruikt u een vermogensspectraaldichtheid(PSD)schatter zoals Welch's methode⁷³. Vermogen in een frequentieband van f₁-f₂ is , waarbij dF de breedte van de transformatieopslagbak is.
   3. Om de bubbelactiviteit tijdens elke blootstelling te karakteriseren, schat u de bijdragen aan het vermogensspectrum uit gehele veelvouden van f₀ (harmonischen), oneven gehele veelvouden van f₀/2 (ultraharmonica) en breedbandruis (traagheidsholte).
   4. Harmonische en ultraharmonische inhoud wordt het eenvoudigst geschat door de vermogensspectrumwaarden op specifieke frequenties te selecteren. Grote amplitudetonaire respons kan zich echter verspreiden in een klein aantal aangrenzende frequentiebakken (bijv. f0 ± 2-3), dus deze moeten worden opgenomen in de berekeningen van het smalbandvermogen en worden uitgesloten van de breedbandberekeningen.
   5. Schat het cavitatievermogen van breedbandbanden door de harmonische en ultraharmonische bijdragen af te trekken van het totale vermogensspectrum. Deze bijdragen kunnen ook worden geraamd met behulp van geavanceerdere voorverwerking⁷⁴.
   6. Schat de cumulatieve cavitatiesignaalenergie gedurende de duur van de blootstelling, bij voorkeur op basis van spectrumfunctie / bubbleactiviteitstype.
   7. Ervan uitgaande dat alle gegevensrecords dezelfde duur T_rhadden, is de cumulatieve energie in de geregistreerde gegevens , waarbij M het aantal records aangeeft.
   8. Als er hiaten zijn tussen opnames, zoals kan gebeuren wanneer de blootstelling continu is, en de opgeslagen bestanden een fractie van de totale blootstellingsduur T_evastleggen, kan de cumulatieve energie worden geschat als
   9. Schat de meting SNR in vergelijking met spectrumniveaus met die van achtergrondgeluiden die zijn geregistreerd bij afwezigheid van de VS.

3. Experimenteel protocol

1. SAT Voorbereiding
   1. Minimaliseer de kans op cavitatie in het voortplantingspad door de vulvloeistof (meestal gefilterd water) gedurende ten minste twee uur onder een druk van^{-10 5} Pa te ontgassen. Bevestiging met een opgeloste zuurstofsonde dat de partiële zuurstofdruk lager is dan 10 kPa wordt aanbevolen.
   2. Vul de testkamer langzaam om de herintroductie van lucht in de ontgaste vloeistof te minimaliseren. Ga indien nodig verder met het ontgassen van de gevulde kamer.
   3. Verwijder alle resterende bellen van de oppervlakken van de transducer en mediacontainer onmiddellijk na het vullen en opnieuw vlak voor het starten van blootstellingsexperimenten.
   4. Zorg ervoor dat de temperatuur van de kamer en de inhoud ervan zijn gestabiliseerd voordat u begint met blootstellingsexperimenten.
   5. Laat de Amerikaanse eindversterker opwarmen (volgens aanbeveling van de fabrikant) zodat de versterking en output stabiel zijn ten opzichte van de tijd.
2. Voorbereiding van het blootstellingscompartiment
   1. Cavitatiemiddel suspensie
      1. Bij het verdunnen van het cavitatiemiddel, voorzichtig en continu roeren om een uniforme suspensie te maken zonder macrobubbels in te sluiten of het middel te vernietigen (vooral als het beschoten bubbels zijn).
      2. Bij het werken met MB's langzaam terugtrekken en doseren met behulp van de grootste naald die beschikbaar is om de vernietiging tijdens het laadproces te minimaliseren⁷⁵. Een stompe vulnaald van 18 G is regelmatig gebruikt met de SAT-systemen.
3. SAT2 Voorbereiding
   1. Steriliseer het PDMS-deksel voor gebruik in experimenten met levende cellen.
   2. Vorm het celblootstellingscompartiment door op het PDMS-deksel op de kweekschaal te drukken.
   3. Bereid een spuit voor met een stompe naald van 18 G en vul met ongeveer 10 ml vloeistof (bijv. MB-suspensie of waterbeheersing).
   4. Steek de naald door een van de PDMS-vulgaten en vul de kamer langzaam, kantelend zodat macrobubbels door het open vulgat kunnen ontsnappen. Voor het beste resultaat kantelt u de kamer zodat het open gat zich boven het vulgat bevindt.
   5. Sluit het open gat wanneer het gevuld is door een korte (4-5 mm) polymeerstaaf in te brengen. Stel de montage zo in dat beide gaten horizontaal zijn.
   6. Verwijder de stompe vulnaald terwijl u extra vloeistof injecteert, zodat er geen lucht wordt aangezogen. Sluit het gat met een andere polymeerstaaf. Dit proces voltooit de afdichting van het celblootstellingscompartiment.
   7. Controleer het compartiment visueel op bewijs van ingesloten macrobubbels en herhaal 3.3.3.-3.3.6 indien aanwezig.
   8. Druk op het celblootstellingscompartiment in de compartimenthouder. Installeer het deksel van de kamer bovenop de kamer. Door het deksel met een hoek naar horizontaal te laten zakken, worden macrobubbels ontmoedigd om op de ondergedompelde delen (absorber, houder) te rusten.
   9. Houd rekening met het drijfvermogen van de deeltjes in suspensie bij het bepalen van de oriëntatie van het celblootstellingscompartiment (bijv. zwevende bellen of zinkende nanodeeltjes) en hoe dit hun contact met cellen zal beïnvloeden.
   10. Gebruik bij alle bewerkingen zo min mogelijk kracht om de buiging van het celgroeioppervlak en de loslating van cellen te minimaliseren.
4. SAT3 Voorbereiding
   1. Vul de Transwell met ongeveer 150 μL vloeistof (bijv. MB-suspensie of waterbeheersing).
   2. Vorm het celblootstellingscompartiment door de transwell zorgvuldig af te dichten met een rubberen plug en eventuele overloopvloeistof te verwijderen met een schone papieren handdoek of doekje. Steriliseer voor gebruik in experimenten met levende cellen de rubberen plug.
   3. Controleer het compartiment visueel op bewijs van ingesloten macrobubbels en verwijder indien aanwezig de stekker, verwijder de macrobubbels en herhaal 4.4.2.
   4. Druk op het celblootstellingscompartiment in de compartimenthouder. Installeer het deksel van de kamer bovenop de kamer. Door het deksel met een hoek naar horizontaal te laten zakken, worden macrobubbels ontmoedigd om op de ondergedompelde delen (absorber, houder) te rusten.
      OPMERKING: Zoals hierboven vermeld, kunnen macrobubbels een verscheidenheid aan niet-herhaalbare en potentieel schadelijke effecten op Amerikaanse blootstellingsexperimenten veroorzaken. Het meest kritisch is dat macrobubbels die vastzitten in het celblootstellingscompartiment PCD-reacties en lokale cellulaire bio-effecten kunnen veroorzaken die niet representatief zijn voor de beoogde behandeling. Inspecteer altijd visueel alle systeemcomponenten om macrobubbels te vinden en te verwijderen voordat u Amerikaanse experimenten start.

4. Gegevensverzameling

1. Vaststellen van pcd-responsniveaus op de achtergrond door eerste experimenten uit te voeren met een celblootstellingscompartiment gevuld met controlevloeistof (bv. ontgast water of celmedia).
2. Neem PCD-gegevens op zonder de Amerikaanse bron te besturen om elektronische achtergrondgeluidsniveaus vast te stellen.
3. Neem PCD-gegevens op terwijl u de Amerikaanse bron bestuurt op het volledige bereik van geplande schijfniveaus. Deze gegevens geven aan welke delen van de akoestische respons geen verband houden met de cavitatiemiddelen die later moeten worden getest.
   OPMERKING: Gewone laboratoriumvloeistoffen (bijv. PBS of celmedia) vertonen cavitatie bij matige druk (bijv. 0,5 MPa bij 0,5 MHz) als ze niet worden ontgast.
4. Geef voor aanvang van de metingen de tijd voor de suspensie om thermisch te equilibreren met de kamertemperatuur. Een fijne naald thermokoppel kan nuttig zijn voor dit doel.
5. Bewaak de experimenten in realtime in zowel de tijd- als frequentiedomeinen.
   1. Tijddomeinbewaking van de PCD laat zien of signalen geschikt zijn voor de huidige instrumentatie-instellingen. In het bijzonder moet het knippen van signalen worden vermeden, omdat het in het frequentiedomein zal verschijnen als een harmonische reactie met meerdere toons.
   2. Tijddomeinbewaking van de PCD laat ook zien of cavitatiesignalen eerder worden waargenomen dan verwacht op basis van de voortplantingstijd van de Amerikaanse bron naar het blootstellingscompartiment aan de PCD. Als dergelijke signalen worden waargenomen, kan dit wijzen op lekkage van cavitatiemiddel in de testkamer.
   3. Frequentiedomeinbewaking van de PCD geeft het type bellengedrag aan en kan worden gebruikt om de schijfniveaus zo nodig aan te passen om de gewenste celstimulans te bereiken (bijv. lagere schijfniveaus voor harmonische excitatie).
6. Om ervoor te zorgen dat de eerste belichtingen niet worden gemist, start u het gegevensverzamelingsproces voordat u het Amerikaanse bronstationsignaal inschakelt.
7. Bewaak het uitgangssignaal van de versterker dat de Amerikaanse bron aandrijft (in tegenstelling tot de uitgang van de golfvormgenerator) tijdens het experiment om ervoor te zorgen dat de blootstelling verloopt zoals verwacht. Gebruik voor deze meting een hoogspanningssonde en zorg ervoor dat de oscilloscoop is ingesteld om de demping van de sonde te compenseren.
8. Verwijder het na het blootstellen van een monster voorzichtig uit de testkamer.
   1. Verwijder en reinig het PDMS-deksel (SAT2)/rubberen stekker (SAT3) ter voorbereiding op later gebruik.
   2. Breng de kweekschaal (SAT2)/Transwell (SAT3) indien nodig over voor latere analyse (bijv. microscopie, fluorescentiebeeldvorming).
   3. Na een klein aantal blootstellingen (bijv. 3-5) is het een goede gewoonte om de cavitatiesignalen van de uitgangssituatie (bij afwezigheid van cavitatiemiddel) opnieuw te verkrijgen en te vergelijken met de oorspronkelijke gegevensset om ervoor te zorgen dat de kamermedia niet zijn verontreinigd.

Resultaten

Figuur 4 toont voorbeelden van pcd-reacties op tijd- en frequentiedomeinen, die drie verschillende cavitatiegedragingen illustreren. Alle gegevens werden verzameld op SAT3 met behulp van SonoVue MB's verdund 5x in PBS, met een uiteindelijke concentratie van ~2*10⁷ MB/ml. De temperatuur voor alle voorbeelden in deze sectie was 19 ± 1 °C. De Amerikaanse bron werd aangedreven met een puls van 2,0 ms bij 0,5 MHz om incidentpieknegatieve drukken van 0,20 (figuur 4A en 4B), 0,30(figuur 4C en 4D)en 0,70 MPa(figuur 4E en 4F) te bereiken. De signaalopnamen begonnen 1,4 ms vóór de t = 0 start van de Amerikaanse puls. De ingezette sporen tonen het signaal zoals opgenomen (rood) en met een 2 MHz high pass filter (blauw) voor een tijdvenster gecentreerd op het moment van vlucht van bron naar celblootstellingscompartiment naar PCD. De lage respons vóór deze tijd is te wijten aan direct ontvangen straling van de bron, wat gebruikelijk is in configuraties waar de PCD zich achter de Amerikaanse bron bevindt.

Bij de laagste incidentdruk bestaat de PCD-respons volledig uit gehele harmonischen van de 0,5 MHz fundamentele Amerikaanse frequentie. Het verhogen van 0,20 naar 0,30 MPa resulteert in uitgesproken ultraharmonica in het spectrum naast verdere verhoogde gehele harmonischen. De tijddomeingolfvormen bij deze twee drukken lijken op elkaar, hoewel de 0,30 MPa-resultaten meer variabiliteit vertonen over de pulsduur. Bij de hoogste druk is de amplitude van de tijddomeingolfvorm niet lineair gegroeid ten opzichte van de lagere druk als gevolg van duidelijk verhoogde breedbandruis die zichtbaar is in het spectrum. Dit geluid wordt algemeen beschouwd als een gevolg van traagheidsholte en komt in dit voorbeeld overeen met vernietiging van MB's.

Om dit duidelijker te zien, worden pcd-reacties als functie van de tijd weergegeven in figuur 5. In het linkerpaneel (figuur 5A) worden volledige spectra weergegeven gedurende een belichtingstijd van 50 seconden, waarbij de bron elke 0,20 seconden 2,0 ms pulsen uitstraalt. Overeenkomstige totale, harmonische en breedbandvermogens worden in het rechterpaneel weergegeven (figuur 5B). De VS werd ingeschakeld op t = 3 ,0 s, op welk moment breedbandresponsen met grote amplitude werden gezien. De initiële piek wordt verondersteld overeen te komen met de vernietiging van de grootste bubbels in de suspensie (SonoVue is polydisperse) en is een veel voorkomende observatie in cavitatie-experimenten met gedopte bubbels en zelfs met niet-ontgaste media (bijv. PBS).

Na een paar seconden nam de breedbandrespons snel af, blijkbaar als gevolg van bubbelvernietiging, en het signaal bestaat voornamelijk uit harmonischen. Dit suggereert dat het vrijgevelijk gas en de resterende MB's stabiel en niet-traag trillen. Bij t ~ 50s is de breedbandcomponent gedaald tot het niveau van het oorspronkelijke achtergrondgeluid. Blootstellingstests zoals deze zijn daarom belangrijk bij het proberen te begrijpen van de tijdschalen waarin verschillende bubbeleffecten op de cellen in de kamer kunnen werken.

Bellen zullen zich waarschijnlijk vertalen als reactie op stralingskrachten die worden gegenereerd tijdens blootstelling in de VS en beweging van MB's in en uit het PCD-gezichtsveld kan leiden tot verhoogde variabiliteit in het bewaakte cavitatiesignaal, vooral bij het omgaan met verdunde suspensussingen. Het gevoelige gebied van de PCD moet daarom zoveel mogelijk van het celblootstellingsoppervlak omvatten. Een vergelijking van de responsgerichte en niet-gerichte PCD's met identieke centrumfrequenties (zie figuur 2) wordt weergegeven in figuur 6, met behulp van een 20:1 verdunning van MB's in normale PBS is SAT2. Uit de tijd en de steekproefgemiddelde spectra in paneel figuur 6A blijkt dat de niet-gerichte PCD een sterkere breedbandrespons bevat, vergezeld van verminderde sample-to-sample variabiliteit in zowel harmonische (Figuur 6B) als ultraharmonische vermogens (Figuur 6C).

Het is belangrijk om te erkennen dat media die worden gebruikt voor in vitro celwerk niet worden ontgast en een verhoogd achtergrondniveau van bubbelactiviteit kunnen vertonen. Figuur 7 toont de respons in SAT2 van PBS die in de door de leverancier geleverde vorm werd gebruikt en na twee uur ontgassen onder vacuüm, waarna de luchtverzadiging werd verlaagd van 92% naar 46% zoals bepaald met een optische sensor (PreSens, Duitsland). De spectra in figuur 7A werden gemiddeld over de blootstellingstijd en herhaald met vijf onafhankelijke monsters, en laten duidelijk verhoogde ultraharmonica zien in normale PBS. Krachten opgeteld over drie harmonischen (figuur 7B) liggen ruim binnen de standaardafwijking van elke experimentele output. De ultraharmonische sommen in figuur 7C laten daarentegen zien dat normale PBS bijna een orde van grootte hoger niveau en aanzienlijk hogere variabiliteit tussen monsters heeft. Deze voorbeelden geven aan dat een gemeenschappelijk celcompatibel medium gedrag kan vertonen dat (onjuist) kan worden toegeschreven aan de aanwezigheid van MB's. Aangezien het meestal onpraktisch is om het kweekmedium te ontgassen vanwege de negatieve impact op de stabiliteit van cellen en/of cavitatiemiddelen, is het van cruciaal belang om geschikte controles uit te voeren in een cavitatiegerelateerd onderzoek.

Figuur 1: Illustraties van twee Amerikaanse belichtingssysteemontwerpen met cavitatiebewaking: SAT3 (D-F). (A) SAT2 geannoteerde montage met zijwand verwijderd voor de duidelijkheid. (B) SAT2 met zijwand intact. (C) SAT2 celblootstellingscompartiment, gedemonteerd. (D) SAT3 geannoteerde assemblage. (E) SAT3 in normale (links) en lens (rechts) configuraties voor bundelbreedte matching op verschillende frequenties. (F) SAT3 celblootstellingscompartiment, gedemonteerd. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 2: Berekeningen van halve amplitude drukveldcontouren voor 12,7 mm diameter ongericht (links) en bolvormig gerichte (rechts) transducers. Frequenties van respectievelijk 2, 4 en 8 MHz worden weergegeven als rode, blauwe en groene contouren voor een PCD-element bij de coördinatenoorsprong (0,0). De buitenste contouren van het ongerichte apparaat zijn relatief ongevoelig voor frequentie, maar de binnenstructuur is frequentieafhankelijk. Het bolvormig gerichte veld trekt samen naarmate de frequentie toeneemt, maar binnen de contouren variëren de velden soepel. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 3: Instrumentatie voor cavitatiesignaalconditionering en -opname (blauwe pijlen), Amerikaanse bron excitatie (rode lijnen) en triggering van gegevensverzameling. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 4: Tijd (links) en frequentie (rechts) domein PCD-reacties geregistreerd met MB's verwaterd 5x in PBS. Incident piek negatieve drukken waren (A, B) 0,2 MPa, (C, D) 0,4 MPa, (E, F) 0,7 MPa, allemaal op 0,5 MHz. Signaalopnamen beginnen 1,4 ms vóór de t = 0 start van de 2,0 ms duur ultrasone puls. (A, C, E) Tijddomeinsignalen (rood) worden weergegeven op een vaste verticale schaal, wat aangeeft hoe het responsniveau verandert met incidentdruk. De ingezette sporen tonen het signaal zoals opgenomen (rood) en met een 2 MHz high pass filter (blauw) voor een tijdvenster gecentreerd op het moment van vlucht van bron naar celblootstellingscompartiment naar PCD. (B, D, F) Ruis en signaalvermogen spectrale dichtheden worden berekend voor respectievelijk t<0 en t>0. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 5: Spectrumgeschiedenissen over een blootstelling van 50 seconden van een suspensie van MB's verdund 5x in PBS. (A) Volledige spectra en (B) totale, harmonische en breedband signaalkrachten, allemaal als functie van de tijd. De aandrijfomstandigheden waren 0,5 MHz, 0,7 MPa pieknegatieve druk, 2,0 ms pulsduur, 200 ms pulsherhalingsperiode. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 6: Effect van PCD-scherpstelgeometrie geregistreerd met een 20:1 verdunning van microbubbels in normale PBS. De rijomstandigheden waren: 1,0 MHz, 0,50 MPa pieknegatieve druk, 3,0 ms pulsduur, 10 ms pulsherhalingsperiode. (A) Volledige spectra gemiddeld over de blootstellingstijd en drie onafhankelijke monsterherhalingen. (B) Vermogen in 3, 4 en 5 MHz harmonischen, en (C) vermogen in 2,5, 3,5 en 4,5 MHz ultraharmonica. Dikke lijnen zijn monstermiddelen, gearceerde gebieden geven +/- 1 standaarddeviatie aan. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 7: Effect van ontgaste media opgenomen met PBS. (A) Volledige spectra gemiddeld over de blootstellingstijd en vijf onafhankelijke monsterherhalingen. (B) Vermogen in 3, 4 en 5 MHz harmonischen, en (C) vermogen in 2,5, 3,5 en 4,5 MHz ultraharmonica. Dikke lijnen zijn monstermiddelen, gearceerde gebieden geven +/- 1 standaarddeviatie aan. De aandrijfomstandigheden waren 1,0 MHz, 0,50 MPa pieknegatieve druk, 1,0 ms pulsduur, 200 ms pulsherhalingsperiode. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

parameter	eenheid	minimum	maximum
frequentie	Mhz	0.02	15
druk (piek negatief)	Mpa	0.1	20
pulslengte	Cycli	1	Cw
duty cycle	%	1	Cw
belichtingstijd	s	10	1000

Tabel 1: Samenvatting van het scala aan gerapporteerde parameters die sonoporatie in vitro vergemakkelijken.

Discussie

De kritische stappen voor elke akoestische meting werden in 1981 door Apfel ingekapseld als "ken uw vloeistof, ken uw geluidsveld, weet wanneer er iets gebeurt." In de context van dit protocol omvatten deze de kalibratie en uitlijning van de transducer en de watervoorbereidings- en bellenbehandelingsstappen. Ten eerste is het essentieel dat de hydrofoon die wordt gebruikt om de aandrijfomvormer en/of de PCD te kalibreren, zelf nauwkeurig wordt gekalibreerd door middel van regelmatig extern onderhoud of interne vergelijking met een referentiestandaard. Evenzo moet de respons van zowel de aandrijvende transducer als PCD regelmatig worden gekarakteriseerd om te controleren op een verandering in de output en/of verlies van gevoeligheid. Als de rijomstandigheden en de gevoeligheid van het systeem onbekend zijn, is het onmogelijk om een betekenisvol verband te concluderen tussen blootstellingsomstandigheden, bio-effecten en akoestische emissies. De uitlijning van de transducers op elkaar en de monsterkamer moet zorgvuldig worden gecontroleerd om ervoor te zorgen dat de blootstellingsomstandigheden in de kamer naar verwachting zijn en dat het bemonsteringsvolume voor de PCD overeenkomt met het interessegebied. Zoals aangegeven , kunnen de temperatuur en het gasgehalte van het opschortende medium de uiteindelijke resultaten aanzienlijk beïnvloeden en is consistentie in dit opzicht uiterst belangrijk^77,78. Evenzo vereisen de bereiding, karakterisering en behandeling van de suspensie van het cavitatiemiddel zeer nauwe aandacht om ervoor te zorgen dat de verwachte grootteverdeling en concentratie van deeltjes in het monster aanwezig is. Als de concentratie van bellen bijvoorbeeld te hoog is, zal het monstervolume effectief worden afgeschermd van het amerikaanse veld. MB-middelen zijn bijzonder gevoelig voor vernietiging en coalescentie en verdere richtlijnen voor de behandeling ervan zijn te vinden in Mulvana et. al. (2012)⁷⁹.

Een veel voorkomend probleem bij het detecteren van cavitatiesignalen is het bereiken van een adequate SNR. Dit komt deels door de aard van het signaal zelf, zoals beschreven, maar kan ook te wijten zijn aan bronnen van elektrische ruis binnen de experimentele opstelling. Het controleren van de verbindingen tussen systeemcomponenten, met name die met coaxiale kabels, kan helpen om sommige van deze te elimineren. Het vervangen of repareren van coaxiale kabels kan nodig zijn. Het identificeren en verwijderen of deactiveren van andere apparatuur in het laboratorium, zoals pompen die elektrisch geluid kunnen veroorzaken, kan ook helpen. Een slechte afstemming van elektrische impedantie tussen systeemcomponenten kan een verdere oorzaak zijn van een slechte signaal-ruisverhouding en mogelijk ook van schade aan apparatuur en moet zorgvuldig worden gecontroleerd. De activeringsinstellingen op de signaalgenerator en oscilloscoop moeten op dezelfde manier worden gecontroleerd om te bevestigen dat ze op de juiste manier zijn geconfigureerd voor het experiment en niet zijn teruggekeerd naar de standaardinstellingen van de fabrikant. Als er tijdens het hanteren een aanzienlijke vernietiging van bellen is, kan het in het geval van de SAT2 nuttig zijn om een tweede spuit aan de uitlaatpoort te bevestigen en deze te gebruiken om voorzichtig vloeistof uit de kamer te extraheren, waardoor de suspensie wordt intrek. Dit kan ook helpen bij het elimineren van macrobubbels of het inschakelen van stroom tijdens amerikaanse blootstelling, indien gewenst.

Het is niet mogelijk om akoestische reflecties in de monsterkamer volledig te elimineren en daarom zal het incidentveld niet volledig uniform zijn over het hele monstervolume. Zoals vermeld in de stappen 1.3.2 en 1.3.3, zal de overdraagbaarheid van akoestische ramen frequentieafhankelijk zijn en daarom moet zorgvuldig worden nagedacht over de gewenste bandbreedte voor akoestische emissiemetingen. In het bijzonder kunnen er significante meervoudige reflecties van componenten met een hogere frequentie zijn. Dit is een andere reden waarom kalibratie van het veld binnen het volledig geassembleerde systeem zo belangrijk is om de onzekerheid in incidentdruk te minimaliseren. Er moet ook worden overwogen de effecten van meervoudige reflecties tot een minimum te beperken. Het gebruik van commerciële apparaten voor het gemak en de noodzaak van akoestische transparantie betekent dat enige optische transparantie moet worden opgeofferd. Dit kan van invloed zijn op de kwaliteit van latere beeldvorming, bijvoorbeeld om de levensvatbaarheid van cellen of de opname van geneesmiddelen te beoordelen. Sommige membranen die in commerciële apparaten worden gebruikt, zijn ook poreus en daarom treedt onvolmaakte isolatie op tussen de monsterkamer en het omringende waterbad. Zoals hierboven vermeld, kan het overeenkomstige besmettingsrisico worden beperkt door een kleinere subkamer te gebruiken, waarvan de inhoud regelmatig kan worden vervangen. De celkweekapparaten die in de tabel met materialen worden aangegeven, zijn voornamelijk geschikt voor celmonolagen die mogelijk niet representatief zijn voor weefsels in termen van alle door de VS/cavitatie gemedieerde bio-effecten. De nabijheid van de cellen tot een vast oppervlak zal ook de MB-dynamiek beïnvloeden op een manier die mogelijk niet de omstandigheden in vivo weerspiegelt, bijvoorbeeld het bevorderen van microstreaming en microjetting zoals beschreven in de inleiding. Deze beperkingen kunnen echter worden aangepakt door een eenvoudige vervanging van alternatieve weefselmodellen.

Het doel van de voorstellen van de SATs is een middel te bieden om de reproduceerbaarheid van akoestische blootstellingsomstandigheden en akoestische emissies tussen studies van door de VS gemedieerde bio-effecten te verbeteren, waardoor hopelijk een beter begrip van de onderliggende mechanismen en de ontwikkeling van behandelingsbewakingstechnieken worden vergemakkelijkt om de veiligheid en werkzaamheid te verbeteren. De systemen zijn ontworpen om compatibel te zijn met in de handel verkrijgbare celkweekapparaten, waardoor een breed scala aan biologische test kan worden uitgevoerd op basis van de toepassing van interesse en de uitvoering van experimenten met hoge doorvoer mogelijk wordt, waardoor tijdrovende uitlijningsprocedures tussen runs overbodig worden. Door protocollen te standaardiseren voor de karakterisering van blootstellingsomstandigheden en het opvangen van akoestische emissies, kan de systeemafhankelijke variabiliteit hopelijk worden verminderd. Het bereik van parameters die voor een bepaald experiment moeten worden onderzocht, hangt af van de toepassing (gewenst bio-effect, celtype, diepte van het doelweefsel indien in vivo enz.) en de aard van elk cavitatiemiddel dat wordt gebruikt. Gezien het grote aantal variabelen (Amerikaanse frequentie, drukamplitude, pulslengte, pulsherhalingsfrequentie enz.) is het onwaarschijnlijk dat het volledig verkennen van de hele parameterruimte haalbaar is. Een voordeel van het voorgestelde protocol is dat het mogelijk is om bepaalde grenzen op deze parameterruimte snel vast te stellen. Het maakt het bijvoorbeeld mogelijk om de minimale druk te bepalen waarbij een cavitatiesignaal wordt gegenereerd, de maximale druk of pulslengte die kan worden gebruikt voordat celloslating / dood optreedt, en de druk waarbij fractionele harmonischen of breedbandgeluid worden geproduceerd. Het wordt aanbevolen om een dergelijke reeks scopingmetingen uit te voeren als een eerste stap in elk onderzoek.

Zoals gepresenteerd, zijn de SATs ontworpen voor real-time monitoring van akoestische emissies, waarbij biologische assays buiten het experiment worden uitgevoerd. Het zou echter relatief eenvoudig zijn om de SAT aan te passen om directe optische observatie van de monsterkamer via een microscoopdoelstelling mogelijk te maken. Dit kan op zijn beurt worden gekoppeld aan een fluorescentie- en/of high-speed microscopiesysteem om bijvoorbeeld observatie van de opname van geneesmiddelen en de dynamiek van de bellen mogelijk te maken. De PCD-uitgang zoals momenteel gepresenteerd in termen van spanning geeft aan: i) de soorten cavitatiegedrag en hun relatieve verhoudingen; ii) hoe lang deze cavitatiegedragingen aanhouden; iii) of de waargenomen tijd-cumulatieve blootstellingskenmerken gecorreleerd zijn met een bepaald bio-effect; en iv) of de relatieve niveaus en tijdsafhankelijke gedragingen consistent zijn met eerdere experimenten in het blootstellingssysteem. Hoewel de ontvangstgevoeligheid van de PCD kan worden gekwantificeerd, is aanvullende ruimtelijke informatie vereist om de akoestische emissies betrouwbaar te karakteriseren in termen van absolute energie. Dit kan worden bereikt door de PCD te vervangen door een arraysonde om passieve akoestische mapping (PAM) te implementeren⁸⁰. Dit zou echter de complexiteit van signaalverwerking en de benodigde rekentijd en -kracht vergroten.

Andere instrumenten voor het meten van de elektrische weerstand van het membraan of de toepassing van fysische richtmethoden, bijvoorbeeld magnetische velden, kunnen ook worden opgenomen. Het zou ook mogelijk zijn om driedimensionale weefselstructuren zoals tumorsferoïden, organoïden of zelfs ex vivo weefselmonsters te gebruiken op akoestisch "zachte" gelsubstraten in plaats van de celmonolagen om amerikaanse en cavitatiegemedieerde effecten in meer realistische weefselomgevingen te bestuderen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Absorber	Precision Acoustics	APTFlex F28 panel	1.0 cm standaard dikte
Versterker (vermogen)	E&I Ltd.	1040L	400W vermogensversterker om ultrasone bron aan te drijven
Versterker (voorversterker)	Stanford Research Systems	SR445A	Meertraps voorversterker met vaste versterking voor PCD-signalen
Aquariumverwarming	Aquael	Ultra 50W	Verschillende modellen voor verschillende tankgroottes.
Digitalisator	TiePie Engineering	HS5-110-XM	Uitgebreide geheugenoptie: 32M punten per kanaal
Hydrofoon	Precision Acoustics	FOH	Gevoelig gebied met een diameter van 0,01 mm minimaliseert directiviteitseffecten
Microbubbels	Bracco	SonoVue	Door de FDA goedgekeurde microbubbels
PCD-spiegel (SAT3)	Olympus NDT	F-102	90 graden straalreflectie
PCD-transducer	Olympus NDT	V320-SU	Immersiedop, 7,5MHz
PCD-waterdichte kabel	Olympus NDT	BCU-58-1 W
PDMS (SAT2-compartimentdeksel)	Corning	Sylgard 184	Zie Carugo et al. (2015) voor bereidingsrichtlijnen
Polymeerstang (SAT2-afdichting)	Zeus	PTFE monofilament
Rubberen plug (SAT3-deksel/afdichting)	VWR	391-2101	6mm bodemdiameter, 8mm bovendiameter, rood
Signaalgenerator	Agilent	33250	Golfvormgenerator voor ultrasone bron
Substraat voor celblootstellingscompartiment, SAT2	Ibidi	µ-Dish 35mm
Substraat voor celblootstellingscompartiment, SAT3	Corning	Transwell 6,5mm
Ultrasone bron (SAT3)	Sonic Concepts	H107 met centraal gat	Gebruik van een HIFU-compatibele bron maakt het mogelijk om drukken >1MPa te genereren, zowel op het focuspunt als pre-focally voor een grotere ruimtelijke dekking