Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Aanvulling van splicingactiviteit door een Galectin-3 - U1 snRNP-complex op kralen

1.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/61990

⸱

9 december 2020

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Michigan State University, 2Department of Microbiology and Molecular Genetics, Michigan State University

In dit artikel

Samenvatting

Dit artikel beschrijft de experimentele procedures voor (a) depletie van U1 snRNP uit nucleaire extracten, met gelijktijdig verlies van splicingactiviteit; en (b) reconstitutie van splicingactiviteit in het U1-uitgeputte extract door galectine-3 - U1 snRNP-deeltjes gebonden aan kralen covalent gekoppeld aan anti-galectine-3-antilichamen.

Samenvatting

Klassieke depletie-reconstitutie-experimenten geven aan dat galectine-3 een vereiste splicingfactor is in nucleaire extracten. Het mechanisme van opname van galectine-3 in de splicingroute wordt in dit artikel behandeld. Sedimentatie van HeLa-celkernextracten op 12%-32% glycerolgradiënten levert fracties op die verrijkt zijn in een endogeen ~10S-deeltje dat galectine-3 en U1 snRNP bevat. We beschrijven nu een protocol om nucleaire extracten van U1 snRNP uit te putten met gelijktijdig verlies van splicingactiviteit. Splicing-activiteit in het U1-uitgeputte extract kan worden gereconstitueerd door het galectine-3 - U1 snRNP-deeltje gevangen op agarose-kralen covalent gekoppeld aan anti-galectine-3-antilichamen. De resultaten geven aan dat het galectine-3 - U1 snRNP - pre-mRNA ternair complex een functioneel E-complex is dat leidt tot tussenproducten en producten van de splicingreactie en dat galectine-3 de splicingroute binnenkomt door zijn associatie met U1 snRNP. Het schema van het gebruik van complexen affiniteit- of immuno-geselecteerd op kralen om splicing activiteit te reconstitueren in extracten uitgeput van een specifieke splicing factor kan algemeen toepasbaar zijn op andere systemen.

Inleiding

De productie van de meeste eukaryote boodschapper-RNA's (mRNA's) omvat verwijdering van introns en ligatie van exonen in een nucleair proces dat pre-mRNA-splicing wordt genoemd1. Twee klassen van RNA-eiwitcomplexen (RRP's) sturen de verwerking van pre-messenger RNA tot volwassen mRNA via spliceosomale complexen. Eén klasse, ontluikende pre-messenger RRP's, wordt co-transcriptioneel gevormd door de binding van heterogene nucleaire RNP-eiwitten en andere RNA-bindende eiwitten, waaronder enkele leden van de SR-familie, die hnRNP-complexen opleveren2. De tweede klasse, uracil-rijke kleine nucleaire RRP's (U snRNPs met U1, U2, U4, U5 en U6 snRNAs) is geassocieerd met U-specifieke en kerneiwitten3,4. De U snRNPs interageren op een geordende manier met specifieke regio's van pre-messenger RRP's in een dynamische remodelleringsroute, terwijl introns worden weggesneden en exonen worden geligeerd om volwassen mRNPs5 te produceren. Veel extra nucleaire eiwitten nemen deel aan deze verwerkingsgebeurtenissen6.

Galectine-1 (Gal1) en galectine-3 (Gal3) zijn twee eiwitten die vereiste factoren zijn in de splicingroute, zoals aangetoond door depletie-reconstitutiestudies7,8. Verwijdering van beide galectines uit het splitsen van competente nucleaire extracten (NE) elimineert spliceosoomassemblage en splicingactiviteit in een vroeg stadium. Toevoeging van beide galectine aan zo'n dubbel uitgeput NE herstelt beide activiteiten. Gal1 en Gal3 zijn componenten van actieve spliceosomen zoals blijkt uit specifieke immunoprecipitatie van pre-mRNA, splicing intermediates en volwassen mRNA door antiserum specifiek voor Gal1 of Gal39. Belangrijk is dat Gal3 zich associeert met endogene U-snRNA die deeltjes in het NE bevatten buiten de splicingroute, zoals blijkt uit de precipitatie van snRNPs door anti-Gal3 antisera10. Ten slotte verandert het uitschakelen van Gal3 in HeLa-cellen de splicingpatronen van talrijke genen11.

In NE voorgeïncubeerd om voorgevormde spliceosomen12 te demonteren, worden snRNPs gevonden in meerdere complexen die sedimenteren in glycerolgradiënten van 7S tot groter dan 60S. Hoewel glycerolgradiëntfractionering een veelgebruikte techniek is voor de isolatie van spliceosomale complexen en componenten (zie bijvoorbeeld referenties13,14,15), hebben we deze methode uitgebreid door specifieke fracties te karakteriseren met behulp van antilichaamimmunoprecipitaties. Een snRNP-sedimentering op 10S bevat alleen U1-snRNA samen met Gal3. Immunoprecipitatie van de 10S-fractie met antisera specifiek voor Gal3 of U1 snRNP co-precipiteert zowel U1 als Gal3, wat aangeeft dat sommige van de U1 snRNP-monodeeltjes gebonden zijn aan Gal310. Aangezien U1 snRNP het eerste complex is dat bindt aan pre-mRNP in spliceosomale assemblage1,5, vertegenwoordigt deze stap een potentiële ingangsplaats voor Gal3 in de splicingroute. Op basis hiervan toonden we aan dat 10S Gal3-U1 snRNP monodeeltjes gebonden aan anti-Gal3 bevattende kralen de splicingactiviteit herstelden tot een U1 snRNP uitgeput NE, waardoor dit complex werd vastgesteld als één mechanisme waarmee Gal3 wordt gerekruteerd in de spliceosomale route16. Dit in tegenstelling tot pogingen om spliceosomen te isoleren in specifieke stadia van de splicingreactie en het catalogiseren van de geassocieerde factoren17,18. In dergelijke studies wordt de aanwezigheid van bepaalde factoren op een bepaald moment vastgesteld, maar niet het mechanisme waarmee ze werden geladen.

We hadden eerder in detail de bereiding van NE, het splicing substraat, de assemblage van het splicing reactiemengsel en de analyse van producten beschreven in onze documentatie van de rol van galectinen in pre-mRNA splicing19. We beschrijven nu de experimentele procedures voor fractionering van nucleaire extracten om een fractie verrijkt in Gal3 - U1 snRNP-complex te verkrijgen en voor immunoselectie van het laatste complex om splicingactiviteit te reconstitueren in een U1-uitgeput nucleair extract.

figure-introduction-1
Figuur 1: Schematisch diagram ter illustratie van de complementatie van splicingactiviteit in nucleair extract uitgeput van U1 snRNP door een Gal3-U1 snRNP-complex op kralen. (A) NE in Buffer C (NE(C)) wordt geïncubeerd met eiwit A-Sepharose kralen covalent gekoppeld aan anti-U1 snRNP (αU1 kralen). De ongebonden fractie is uitgeput van U1 snRNP (U1ΔNE). (B) NE in Buffer D (NE(D)) wordt gefractioneerd over een glycerolgradiënt van 12%-32% door ultracentrifugatie. Fracties die overeenkomen met het 10S-gebied (fracties 3-5) worden gecombineerd en gemengd met kralen die covalent zijn gekoppeld aan anti-Gal3-antilichamen (αGal3-kralen). Het materiaal gebonden aan de kralen bevat een Gal3-U1 snRNP monodeeltje. (C) Het Gal3-U1 snRNP-complex uit deel (B) wordt gemengd met U1ΔNE uit deel (A) in een splicing-assay met behulp van 32P-gelabeld MINX pre-mRNA-substraat en de tussenproducten en producten van de splicingreactie worden geanalyseerd door gel-elektroforese en autoradiografie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Opmerkingen over de algemene procedures

  1. Zorg ervoor dat alle chemicaliën (buffercomponenten, enzymen, enz.) vrij worden gehouden van ribonuclease (RNase). Sequester alle commercieel gekochte reagensflessen van algemeen laboratoriumgebruik. Draag handschoenen voor alle stappen van de experimentele procedure. Gebruik alleen glaswerk en keukengerei dat is gebakken (zie stap 1.2 hieronder) en oplossingen die zijn voorbehandeld (zie stap 1.3 hieronder).
  2. Bak al het glaswerk (bekers, flacons, flessen, pipetten, enz.) minimaal 4 uur bij 177 °C. Wikkel andere gebruiksvoorwerpen (spatels, roerstaafjes, enz.) in aluminiumfolie voordat u onder dezelfde omstandigheden gaat bakken.
  3. Bereid een 0,1% (vol/vol) oplossing van diethylpyrocarbonaat (DEPC) in dubbel gedestilleerd water (ddH2O). Gebruik een magnetische roerstaaf, roer deze oplossing een nacht en autoclaaf. Gebruik deze met DEPC behandelde H2O om alle oplossingen die Tris bevatten te maken; filter vervolgens steriliseer met behulp van een vacuümfilter met flesdeksel. Gebruik gewone ddH2O om alle andere oplossingen te bereiden (zonder Tris); behandel vervolgens met DEPC (0,1%, vol/vol) en autoclaaf.
    OPMERKING: De buffers die in de volgende reeks experimentele procedures worden gebruikt, zijn alfabetisch weergegeven in tabel 1.
Naam van de bufferCompositie
Boraatbuffer0,2 M natriumboraat, pH 9
Buffer C20 mM HEPES, pH 7,9, 25% (vol/vol) glycerol, 0,42 M NaCl, 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM EDTA, 0,5 mM fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF), 0,5 mM dithiothreitol (DTT)
Buffer D10 mM HEPES, pH 7,9, 20% (vol/vol) glycerol, 0,1 M KCl, 0,2 mM EDTA, 0,5 mM PMSF, 0,5 mM DTT
60%D60% Buffer D en 40% H2O
Ethanolamine0,2 M ethanolamine, pH 8
HEPES bindingsbuffer20 mM HEPES, pH 7,9
HEPES wasbuffer20 mM HEPES, pH 7,9, 0,5 M NaCl
RNA-laadbuffer90% formamide, 20 mM EDTA, pH 8, 0,05% (w/v) broomfenolblauw
SDS-PAGE buffer25 mM Tris, 169 mM glycine, 0,1% natriumdodecylsulfaat (SDS), pH 8,8
SDS-voorbeeldbuffer62,5 mM Tris, pH 6,8, 2% SDS, 10% glycerol, 5% 2-mercaptoethanol, 0,1% (w/v) broomfenolblauw
TBE-buffer voor RNA-gels89 mM Tris, 89 mM boorzuur, 2,5 mM EDTA, pH 8,3
TE-buffer10 mM Tris, pH 8, 1 mM EDTA
Buffer overdragen25 mM Tris, 1,92 M glycine, 20% methanol, pH 8,3
T-TBS-buffer10 mM Tris, 0,5 M NaCl, 0,05% Tween 20, pH 7,5
TX wasbuffer0,05% Triton X-100 (TX) in 60%D

Tabel 1: Naam en samenstelling van buffers

2. Bereiding van NE uitgeput van U1 snRNP (U1 ΔNE)

  1. Bereiding van anti-U1 kralen voor immunoadsorptie
    1. Pre-swell 50 mg Protein A-Sepharose CL-4B kralen in overtollig DEPC-behandeld H2O om ongeveer 200 μL gezwollen kralen te produceren en vervolgens te wassen in HEPES wasbuffer.
    2. Pellet voor deze wasbeurt en alle daaropvolgende wasbeurten de kralen door centrifugeren (1.000 x g in een zwenkbakrotor bij 4 °C gedurende 10-15 s) en verwijder de ongebonden was met een micropipettor en gooi weg.
    3. Meng 150 μL gewassen kralen met 150 μL menselijk auto-immuunserum specifiek voor U1 snRNP (volume van antilichaam tot volume van kralen in een verhouding van 1:1).
    4. Stel, op basis van het totale volume van (~ 300 μL vanaf stap 2.1.3 hierboven), het mengsel aan op 20 mM HEPES, pH 7,9, overeenkomend met de voorwaarden van de HEPES-bindingsbuffer; incubeer dit mengsel met continu schommelen bij kamertemperatuur gedurende 60 minuten.
    5. Was de kralen gebonden met antilichamen met 1 ml boraatbuffer (0,2 M natriumboraat, pH 9) en resuspend in 1 ml van dezelfde boraatbuffer.
    6. Om het antilichaam dat gebonden is aan de eiwit A-Sepharose-kralen covalent te koppelen, voegt u dimethylpimelimidaat toe aan een eindconcentratie van 20 mM en incubeert u bij kamertemperatuur met schommelen gedurende 60 minuten.
    7. Was de kralen met 1 ml boraatbuffer.
    8. Om een niet-gereageerd cross-linking reagens te blokkeren, voegt u 1 ml 0,2 M ethanolamine (pH 8) toe en incubeert u bij kamertemperatuur met schommelen gedurende 60 minuten.
    9. Was de antilichaam-gekoppelde kralen, hierna aangeduid als anti-U1 kralen, tweemaal met 0,5 ml TX-wasbuffer (0,05% Triton X-100 in 60% D).
  2. Uitputting van U1 snRNP uit NE (zie figuur 1A)
    OPMERKING: De procedure voor het bereiden van NE uit HeLa-cellen werd aanvankelijk ontwikkeld door Dignam et al.20. We hebben de materialen en gedetailleerde methoden beschreven voor de bereiding van NE voor splicing assays19 (zie stappen 2.1 en 3.1 van die referentie). NE, zoals oorspronkelijk opgesteld, staat in buffer C en zal hierna worden aangeduid als NE(C). NE(C) gedialyseerd tegen en in evenwicht gebracht met Buffer D wordt aangeduid als NE(D).
    1. Incubeer 200 μL NE(C) met 100 μL anti-U1 kralen uit stap 2.1.9 hierboven.
    2. Voeg 5 μL RNasin toe aan het mengsel.
    3. Draai de microbuis kop-over-staart bij 4 °C gedurende 1 uur.
    4. Pelleteer het mengsel door centrifugering (1.000 x g in een zwenkbakrotor bij 4 °C gedurende 10-15 s) en vang het ongebonden materiaal (U1ΔNE) op met een Hamilton-spuit.
    5. Dialyseer het volledige volume U1ΔNE, samen met een afzonderlijke aliquot van 50 μL van het oorspronkelijke niet-uitgeputte NE(C), in afzonderlijke compartimenten van een microdialysator, met roeren, gedurende 75 min tegen 60% D met behulp van een dialysemembraan met 8 K moleculair gewichtsafsnijding.
    6. Verdeel deze preparaten onmiddellijk na dialyse (U1ΔNE en NE in 60% D) in aliquots van 20 μL; knip vervolgens in een droogijs/ethanolbad en bewaar bij -80 °C.
  3. Analyse van het RNA- en eiwitgehalte van U1ΔNE en materiaal gebonden aan anti-U1-kralen
    1. Na het verwijderen van het ongebonden materiaal (U1ΔNE) (stap 2.2.4), wast u het materiaal dat aan de anti-U1-kralen is gebonden door 0,5 ml TX-wasbuffer toe te voegen. Pellet het mengsel door centrifugeren (1.000 x g in een zwenkbakrotor bij 4 °C gedurende 10-15 s) en verwijder het supernatant met behulp van een micropipettor en gooi het weg.
    2. Herhaal de wasstappen 2.3.1 tweemaal.
    3. Verwijder het materiaal dat aan de anti-U1-kralen is gebonden door 100 μL 2x SDS-monsterbuffer toe te voegen aan 100 μL van de kralen en gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur te broeden.
    4. Pellet het mengsel door centrifugeren (1.000 x g in een zwenkbakrotor bij 4 °C gedurende 10-15 s); verwijder het supernatant van hamilton spuit, en snap freeze in een droogijs/ethanol bad. Bewaren bij -80 °C.
    5. Vergelijk het niet-uitgeputte NE, het uitgeputte NE (U1ΔNE) en het materiaal dat aan de kralen is gebonden (uit de kralen verwijderd door sds-monsterbuffer zoals beschreven in stappen 2.3.3 en 2.3.4 hierboven). Volg stappen 2.3.6-2.3.8 voor RNA-analyse of stap 2.3.9-2.3.10 voor eiwitanalyse.
    6. Extraheer voor elk monster het RNA met 200 μL fenol-chloroform (50:50, v/v); vervolgens opnieuw extraheren met 180 μL chloroform-isoamylalcohol (25:1, v/v). Voeg na extractie 300 μL koude 200-proof ethanol toe, keer om om te mengen en bewaar het neergeslagen RNA een nacht bij -20 °C.
    7. Centrifugeer het ethanol-neergeslagen RNA (12.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C). Was de pellets met 150 μL koude 70% ethanol. Centrifugeer opnieuw (12.000 x g) bij 4 °C gedurende 15 min. Verwijder het supernatant met behulp van een micropipettor en droog de pellets in een speed vac gedurende 10-15 minuten zonder warmte.
    8. Resuspend de gedroogde RNA-pellet in 10 μL RNA-laadbuffer, vortex voorzichtig vortex, verwarm tot 75-85 °C gedurende 90 s en incubeer vervolgens gedurende 2 minuten op ijs. Scheid de snRNA's door gel-elektroforese (2 uur bij 16 mA) door 13% polyacrylamide - 8,3 M ureumgels en vervolgens met ethidiumbromide of onderworpen aan noordelijke blotting10,16.
    9. Laad de eiwitmonsters, in SDS-monsterbuffer van stap 2.3.5, op 12,5% polyacrylamidegels en elektroforese bij 200 V gedurende ongeveer 45-50 minuten in SDS-PAGE (natriumdodecyrylsulfaat polyacrylamide gel elektroforese) buffer.
    10. Breng de gescheiden eiwitten over in het nitrocellulosemembraan bij 400 mA gedurende 2 uur in de overdrachtsbuffer. Na overdracht, blokkeer het membraan door een nacht te incuberen in T-TBS met 10% vetvrije droge melk. Vervolgens immunobloteert u het membraan om specifieke eiwitten te onthullen8,21.

3. Immunoprecipitatie van 10S-fracties van glycerolgradiënten door anti-Gal3

  1. Bereiding van anti-Gal3 kralen voor immunoadsorptie
    OPMERKING: De afleiding en karakterisering van konijn polyklonale antisera tegen Gal3 voor konijn #2421 en voor konijn #4910 zijn eerder beschreven.
    1. Gebruik preimmune serum van konijn #49 als controle.
    2. Volg voor de bereiding van anti-Gal3-kralen de eerder beschreven procedure voor de bereiding van anti-U1-kralen (stap 2.1), met uitzondering van die welke overeenkomt met stap 2.1.3, de verhouding van antiserum (bijv. Anti-Gal3, # 49) tot kralen is 3: 1.
    3. Was vlak voor gebruik de antilichaam-gekoppelde kralen, hierna aangeduid als anti-Gal3-kralen, tweemaal met 0,5 ml TX-wasbuffer. Verwijder het supernatant, eerst met een micropipettor om het grootste deel van de vloeistof eruit te krijgen en vervolgens met een Hamilton-spuit om de vloeistof uit de kralen te krijgen; afdanken.
  2. Immunoprecipitaton van glycerolgradiëntfracties naar anti-Gal3 (zie figuur 1B)
    1. Fractionaat NE(D) over een 12%-32% glycerol gradiënt10. Combineer en meng glycerolgradiëntfracties 3, 4 en 5 (genummerd vanaf de bovenkant van het verloop), die zich in de buurt van het 10S-gebied van de gradiënt bevinden.
    2. Bereid twee monsters, elk met 150 μL aliquot van gecombineerde gradiëntfracties 3-5 (stap 3.2.1), en plaats in 50 μL anti-Gal3 kralen.
    3. Bereid tegelijkertijd twee monsters met elk 150 μL fractie 1 (met Gal3 die niet complex is met U1 snRNP10; stap 3.2.1) en plaats in 50 μL anti-Gal3-kralen.
    4. Plaats ter controle 150 μL van 60% D in een andere microbuis van 50 μL anti-Gal3 kralen.
    5. Meng zachtjes door op de buis te tikken en draai vervolgens de microbuis kop-over-staart op 4 °C gedurende 1 uur.
    6. Pellet het mengsel door zachte centrifugatie (1.000 x g in een zwenkbakrotor bij 4 °C gedurende 10-15 s).
    7. Verwijder het supernatant (ongebonden materiaal) met een Hamilton-spuit. Was de kralen niet en gebruik ze onmiddellijk voor de toevoeging van de splicingreacties (rubriek 4.2).
  3. Analyse van het RNA- en eiwitgehalte in het ongebonden en gebonden materiaal van de anti-Gal3 precipitatie van 10S gradiëntfracties
    1. Verzamel voor de analyse van componenten van het gebonden en ongebonden materiaal van anti-Gal3-precipitatie van de 10S-gradiëntfracties het ongebonden materiaal (supernatant na stap 3.2.6), breng het over in een verse microbuis en vries het in bij -20 °C.
    2. Was de neergeslagen kralen uit stap 3.2.6 (met materiaal gebonden aan anti-Gal3) door 0,5 ml TX-wasbuffer toe te voegen.
    3. Pellet het mengsel door zachte centrifugatie (1.000 x g in een zwenkende emmerrotor bij 4 °C gedurende 10-15 s); verwijder het supernatant met behulp van een micropipettor en gooi het weg. Herhaal de wasstappen nog twee keer.
    4. Voeg 50 μL 2X SDS-monsterbuffer toe aan de gewassen en gepelleteerde anti-Gal3-kralen.
    5. Meng de kralen voorzichtig en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
    6. Pelleteer het mengsel door zachte centrifugatie (1.000 x g in een zwenkende emmerrotor bij 4 °C gedurende 10-15 s), verzamel het supernatant met Hamilton-spuit en bewaar het in een nieuw microbuisje bij -20 °C.
    7. Vergelijk het ongebonden materiaal (punt 3.3.1) en het gebonden materiaal (stap 3.3.6) van de anti-Gal3 precipitatie in termen van RNA en eiwitcomponenten, met behulp van procedures zoals beschreven in stap 2.3.6. tot respectievelijk 2.3.10.

4. Assemblage van splicingreactie en analyse van producten

  1. Voorbereiding van het splicing substraat
    OPMERKING: Het pre-mRNA-substraat, aangeduid als MINX, bevat twee exonsequenties en één intronsequentie van Adenovirus22. De MINX DNA-sequentie in het plasmide staat onder controle van T3-, T7- of SP6-polymerasepromotors. De materialen en gedetailleerde methoden voor de linearisatie van het MINX-plasmide-DNA met BamHI-restrictie-endonuclease, transcriptie door SP6-RNA-polymerase in aanwezigheid van α-32P [GTP] en de zuivering van 32P-gelabelde MINX voor splicing-assays zijn eerder beschreven19 (zie stappen 2.2 en 3.2 van die referentie).
    1. Bewaar het radioactief gelabelde MINX als een ethanolprecipitaat bij -20 °C; gebruik het gelabelde splicingsubstraat binnen 4-6 weken na transcriptie.
    2. Centrifugeer vlak voor gebruik de ethanol neergeslagen 32P-gelabelde MINX bij 12.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C; verwijder het supernatant met een micropipettor en gooi het weg.
    3. Voeg 150 μL 70% ethanol toe en centrifugeer bij 12.000 x g gedurende 15 min bij 4 °C. Gooi het supernatant weg en droog de pellet in speedvac zonder warmte gedurende 15 minuten.
    4. Rehydrateer de pellet in 50 μL DEPC water. Spot 2 μL op elk van de twee GF/C-filters; dompel de filters gedurende 10 min onder in koud 5% trichloorazijnzuur (TCA). Spoel af met koude 5% TCA, gevolgd door 180-proof ethanol op een vacuümkolf. Droog de filters aan de lucht en onder voorbehoud van sprankeling tellen in 4 ml Safety-Solve.
    5. Verdun 32P-gelabelde MINX in 60% D tot 104 cpm/μL voor de splicing assay.
  2. Assemblage van de splicingreactie (zie figuur 1C)
    1. Monteer op ijs splicingreacties in een totaal volume van 24 μL (8 μL U1ΔNE (vanaf stap 2.2.6), 3,5 mM MgCl2, 1,5 mM ATP, 20 mM creatinefosfaat, 0,5 mM DTT, 20 eenheden RNasin, 4 μL 32P-gelabeld MINX splicing substraat (104 cpm/μL), 60% D) en voeg toe aan elke buis kralen uit sectie 3.2.7. Monteer een identieke reeks splicingreacties in een totaal volume van 24 μL maar zonder U1ΔNE en voeg aan elke buis kralen uit stap 3.2.7 toe.
    2. Bereid een controlesplitsingsreactie voor in een totaal volume van 12 μL (4 μL NE(D), 3,5 mM MgCl2, 1,5 mM ATP, 20 mM creatinefosfaat, 0,5 mM DTT, 20 eenheden RNasine, 2 μL 32P-gelabeld MINX splicing substraat (104 cpm/μL), 60% D).
    3. Meng de buizen voorzichtig door te tikken en draai end-over-tail bij 30°C gedurende 90 minuten. Pellet het mengsel door zachte centrifugatie bij 1.000 x g in een zwenkbakrotor bij 4 °C gedurende 10-15 s.
    4. Stop de reactie en eluteer de eiwitten van de kralen door 24 μL 2x SDS-monsterbuffer toe te voegen aan de buisjes met kralen en 12 μL 2x SDS-monsterbuffer aan de controlebuis met NE maar geen kralen. Verwarm de buizen gedurende 7 min op 100 °C.
    5. Centrifugeer de buizen voorzichtig bij 1.000 x g in een zwenkbakrotor bij 4 °C gedurende 10-15 s.
    6. Breng de supernatanten (elutie) over in verse microbuizen: ongeveer 48 μL uit de kraalbuizen en 24 μL uit de NE-regelbuis.
    7. Voeg Proteinase K (20 mg/ml) toe om de eiwitten te verteren en op te lossen: voeg 5 μL toe aan de 48 μL elutie van kralen en voeg 2,5 μL toe aan de 24 μL NE-controle.
    8. Incubeer de buizen op 37°C gedurende 40 min.
    9. Centrifugeer de buizen voorzichtig bij 1.000 x g in een zwenkbakrotor bij 4 °C gedurende 10 s.
    10. Verdun de korrels met 39,5 μL TE en 10 μL 3 M natriumacetaat. Verdun de NE-controle met 63,5 μL TE en 10 μL 3 M natriumacetaat.
    11. Extraheer en analyseer het RNA zoals hieronder beschreven (paragraaf 4.3).
  3. Analyse van producten van de splicingreactie
    1. Extract van de RNA's in elk monster met fenol-chloroform, gevolgd door chloroform-isoamylalcohol; de RNA's neerslaan met ethanol, centrifugeren, de pellets wassen, het supernatant verwijderen en de pellets drogen volgens dezelfde procedure als beschreven in de stappen 2.3.6 en 2.3.7.
    2. Resuspend de gedroogde RNA-pellet in 10 μL RNA-laadbuffer, vortex voorzichtig vortex, verwarm tot 75-85 °C gedurende 90 s en incubeer vervolgens gedurende 2 minuten op ijs.
    3. Bereid 20 ml van een oplossing die 13% polyacrylamide (bisacrylamide:acrylamide, 1,9:50 [wt/wt]) bevat in 8,3 M ureum; giet gels van 15 cm lang met behulp van deze oplossing.
    4. Zodra de gel is gegoten, elektroforeer deze (zonder monsters te laden) op 400 V gedurende 20 minuten met TBE als lopende buffer. Was na deze stap de putten met TBE running buffer.
    5. Laad de RNA-monsters in RNA-laadbuffer en elektroforese met TBE-buffer op 400 V gedurende 3,5 tot 4 uur. Verwijder na de elektroforese het ureum door de gel gedurende 10 minuten onder te dompelen en te draaien in gedestilleerd water.
    6. Droog de gel vacuüm op 3 M filtreerpapier, eerst gedurende 2 uur en 15 min bij 80 °C en vervolgens gedurende 30 minuten zonder warmte om het langzaam af te koelen. Onderwerp de gedroogde gel aan autoradiografie op film om de migratieposities van de radioactieve componenten te detecteren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

NE uitgeput van U1 snRNP (U1ΔNE uit sectie 2.2.6) en Gal3 - U1 snRNP-complexen uit het 10S-gebied van de glycerolgradiënt immunoprecipiteerd door anti-Gal3 (stap 3.2.7) werden gemengd in een splicingreactie. Dit reactiemengsel bevatte U1-snRNA (figuur 2A, baan 3) en het U1-specifieke eiwit U1-70K (figuur 2B, baan 3). Zoals verwacht heeft de anti-Gal3 Gal3 neergeslagen (figuur 2B, baan 3). Deze compon...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit rapport biedt de experimentele details die documenteren dat een Gal3 - U1 snRNP-complex gevangen op anti-Gal3-gecoate kralen kan binden aan pre-mRNA-substraat en dit ternaire complex kan splicingactiviteit herstellen tot een U1 snRNP-uitgeput NE. Gal3 is een lid van een familie van eiwitten die oorspronkelijk zijn geïsoleerd op basis van zijn galactose-specifieke koolhydraatbindende activiteit23 . Vroege immunofluorescentie- en subcellulaire fractioneringsstudies gaven de eerste hint van een a...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk is ondersteund door National Science Foundation Grant MCB-0092919 en Michigan State University Intramural Research Grant 09-CDFP-2001 (aan RJP) en door National Institutes of Health Grant GM-38740 en Michigan AgBioResearch Project MICL02455 (aan JLW).

Het MINX pre-mRNA substraat dat werd gebruikt in de splicing assays was een vriendelijk geschenk van Dr. Susan Berget (Baylor College of Medicine, Houston, TX, VS).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
anti-U1 snRNPThe Binding SiteHu ENA-RNP #33471human autoimmune serum specifiek voor U1 snRNP
bottle top vacuum filterFisher ScientificCorning 431153 (0,22 μm; PES 150 ml)voor het filteren van oplossingen die Tris bevatten
centrifugeInternational Equipment CompanyIEC Model PR-6voor het pelletten van Sepharose-kralen in immunoprecipitatie
diethylpyrocarbonate (DEPC)Sigma-Aldrich159220-5Gvoor de behandeling van water dat wordt gebruikt bij de bereiding van alle oplossingen
dimethylpimelimidate (DMP)Sigma-Aldrich80490-5Gvoor het cross-linken van antilichaam naar Sepharose-kralen
electrophoresis cellBioRad Laboratories, IncMini-Protean IIvoor SDS-PAGE-scheiding van eiwitten
ethanolamineSigma-Aldrich411000-100mlvoor blokkering na de cross-linkreactie
gel electrophoresis systemHoefer, IncHSI SE 500 Seriesvoor het scheiden van snRNA's door middel van gelelektroforese
gel slab dryerBioRadModel 224voor het drogen van gelplaten voor autoradiagrafie
Hybond ECL membraanGE HealthcareRPN3032D (0,2 μm; 30 cm x 3 m)voor immunoblotting van eiwitten op membraan
microdialyzer (12 x 100 μl monstercapaciteit)PierceMicrodialyzer System 100voor het uitwisselen van de buffer van nucleair extract
microdialyzer membranen (8K cutoff)Pierce66310voor het uitwisselen van de buffer van nucleair extract
non-fat dry milkSpartan StoresSpartan Instant Non-fat Dry Milk
Protein A Sepharose CL-4BMillipore-SigmaGE 17-0780-01voor het koppelen van antilichaam aan kralen
Proteinase KMillipore-SigmaP2308-5mgvoor het stoppen van de splicing-reactie om de RNA's te isoleren
RNasinPromegaN2111voor het remmen van ribonuclease-activiteit
rocker/rotatorLab Industries, IncLabquake Shaker 400-110voor het mengen van eiwitoplossingen in koppelingsreacties en in immunoprecipitatie
Safety-SolveResearch Products International Corp.No. 111177scintillatietelling cocktail voor de bepaling van radioactiviteit in splicing-substraat
scintillation counterBeckman InstrumentsLS6000SCscintillatieteller voor de bepaling van radioactiviteit
speed vaccum concentratorSavantSVC 100Hvoor het drogen van ethanol-geprecipiteerde RNA-pellets
Transphor electrophoresis unitHoefer, IncHoefer TE Series Transphorvoor eiwitoverdracht van SDS-PAGE naar blottingmembraan

Referenties

  1. Hoskins, A. A., Moore, M. J. The spliceosome: a flexible, reversible macromolecular machine. Trends In Biochemical Sciences. 37, 179-188 (2012).
  2. Choi, Y. D., Grabowski, P., Sharp, P. A., Dreyfuss, G. Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins: role in RNA splicing. Science. 231, 1534-1539 (1986).
  3. Lerner, M., Steitz, J. A. Snurps and scyrps. Cell. 25, 298-300 (1981).
  4. Maniatis, T., Reed, R. The role of small nuclear ribonucleoprotein particles in pre-mRNA splicing. Nature. 325, 673-678 (1987).
  5. Hoskins, A. A., et al. Ordered and dynamic assembly of single spliceosomes. Science. 331, 1289-1295 (2011).
  6. Coppin, L., Leclerc, J., Vincent, A., Porchet, N., Pigny, P. Messenger RNA life-cycle in cancer: emerging role of conventional and non-conventional RNA-binding proteins. International Journal of Molecular Sciences. 19, 650-676 (2018).
  7. Dagher, S. F., Wang, J. L., Patterson, R. J. Identification of galectin-3 as a factor in pre-mRNA splicing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 1213-1217 (1995).
  8. Vyakarnam, A., Dagher, S. F., Wang, J. L., Patterson, R. J. Evidence for a role for galectin-1 in pre-mRNA splicing. Molecular and Cellular Biology. 17, 4730-4737 (1997).
  9. Wang, W., Park, J. W., Wang, J. L., Patterson, R. J. Immunoprecipitation of spliceosomal RNAs by antisera to galectin-1 and galectin-3. Nucleic Acids Research. 34, 5166-5174 (2006).
  10. Haudek, K. C., Voss, P. G., Locascio, L. E., Wang, J. L., Patterson, R. J. A mechanism for incorporation of galectin-3 into the spliceosome through its association with U1 snRNP. Biochemistry. 48, 7705-7712 (2009).
  11. Fritsch, K., et al. Galectin-3 interacts with components of the nuclear ribonucleoprotein complex. BMC Cancer. 16, 502-511 (2016).
  12. Conway, G. C., Krainer, A. R., Spector, D. L., Roberts, R. J. Multiple splicing factors are released from endogenous complexes during in vitro pre-mRNA splicing. Molecular and Cellular Biology. 9, 5273-5280 (1989).
  13. Dery, K. J., Yean, S. L., Lin, R. J. Assembly and glycerol gradient isolation of yeast spliceosomes containing transcribed or synthetic U6 snRNA. Methods in Molecular Biology. 488, 41-63 (2008).
  14. Yoshimoto, R., Kataoka, N., Okawa, K., Ohno, M. Isolation and characterization of post-splicing lariat-intron complexes. Nucleic Acids Research. 37, 891-902 (2009).
  15. Malca, H., Shomron, N., Ast, G. The U1 snRNP base pairs with the 5' splice site within a penta-snRNP complex. Molecular and Cellular Biology. 23, 3442-3455 (2003).
  16. Haudek, K. C., Voss, P. G., Wang, J. L., Patterson, R. J. A 10S galectin-3 - snRNP complex assembles into active spliceosomes. Nucleic Acids Research. 44, 6391-6397 (2016).
  17. Rappsilber, J., Ryder, U., Lamond, A. I., Mann, M. Large-scale proteomic analysis of the human spliceosome. Genome Research. 12, 1231-1245 (2002).
  18. Jurica, M. S., Moore, M. J. Capturing splicing complexes to study structure and mechanism. Methods. 28, 336-345 (2002).
  19. Patterson, R. J., Haudek, K. C., Voss, P. G., Wang, J. L. Examination of the role of galectins in pre-mRNA splicing. Methods in Molecular Biology. 1207, 431-449 (2015).
  20. Dignam, J. D., Lebovitz, R. M., Roeder, R. G. Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian nuclei. Nucleic Acids Research. 11, 1475-1489 (1983).
  21. Agarwal, N., Sun, Q., Wang, S. Y., Wang, J. L. Carbohydrate-binding protein 35. I. Properties of the recombinant polypeptide and the individuality of the domains. Journal of Biological Chemistry. 268, 14932(1993).
  22. Zillmann, M., Zapp, M. I., Berget, S. M. Gel electrophoretic isolation of splicing complexes containing U1 small nuclear ribonucleoprotein particles. Molecular and Cellular Biology. 8, 814-821 (1988).
  23. Barondes, S. H., et al. Galectins: a family of animal β-galactoside-binding proteins. Cell. 76, 597-598 (1994).
  24. Laing, J. G., Wang, J. L. Identification of carbohydrate binding protein 35 in heterogeneous nuclear ribonucleoprotein complex. Biochemistry. 27, 5329-5334 (1988).
  25. Vyakarnam, A., Lenneman, A. J., Lakkides, K. M., Patterson, R. J., Wang, J. L. A comparative nuclear localization study of galectin-1 with other splicing components. Experimental Cell Research. 242, 419-428 (1998).
  26. Michaud, S., Reed, R. An ATP-independent complex commits pre-mRNA to the mammalian spliceosome assembly pathway. Genes & Development. 5, 2534-2546 (1991).
  27. Chiu, Y. -F., et al. Cwc25 is a novel splicing factor required after Prp2 and Yju2 to facilitate the first catalytic reaction. Molecular and Cellular Biology. 29, 5671-5678 (2009).
  28. Krishnan, R., et al. Biased Brownian ratcheting leads to pre-mRNA remodeling and capture prior to first-step splicing. Nature Structural and Molecular Biology. 20, 1450-1457 (2013).
  29. Gray, R. M., et al. Distinct effects on splicing of two monoclonal antibodies directed against the amino-terminal domain of galectin-3. Archives of Biochemistry and Biophysics. 475, 100-108 (2008).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Reconstitutie van splicingactiviteitU1 snRNP-depletieglycerolgradiënt-fractioneringanti-galectine-3-beadsdialyse van nucleair extractprotocol voor splicingreactieanalyse van RNA-substraatbehandeling met proteïnase KSDS-monsterbuffer
Aanvulling van splicingactiviteit door een Galectin-3 - U1 snRNP-complex op kralen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.